Single Eicel bisulfiet Mutagenese

Samenvatting

Bisulfiet mutagenese is de gouden standaard voor het analyseren van DNA-methylatie. Onze gewijzigde protocol zorgt voor een DNA-methylatie analyse op de single-cell niveau en is speciaal ontworpen voor individuele eicellen. Het kan ook worden gebruikt voor splitsing-embryo's.

Samenvatting

Epigenetica omvat alle erfelijke en reversibele aanpassingen van chromatine, dat alter gen toegankelijkheid, en dus zijn de belangrijkste mechanismen voor het reguleren van gentranscriptie ^1. DNA-methylatie is een epigenetische modificatie die voornamelijk fungeert als een repressieve merk. Door de covalente toevoeging van een methylgroep op cytosines in CpG dinucleotiden, kan het werven extra repressieve eiwitten en histon-modificaties aan processen die betrokken zijn in condenserende chromatine en zwijgen genen ² te starten. DNA-methylatie is essentieel voor normale ontwikkeling, want het speelt een cruciale rol in het ontwikkelings-programma's, celdifferentiatie, onderdrukking van retrovirale elementen, X-chromosoom inactivatie en genomic imprinting.

Een van de meest krachtige methoden voor DNA methylatie analyse is bisulfiet mutagenese. Natriumbisulfiet is een DNA-mutageen dat cytosines deaminates in uracils. Na PCR-amplificatie en Seque ncing, worden deze conversie gebeurtenissen gedetecteerd als thymines. Gemethyleerde cytosines worden beschermd tegen deaminering en dus blijven cytosines, waardoor de identificatie van DNA-methylatie op individueel nucleotide niveau ^3. De ontwikkeling van de bisulfiet mutagenese test in een vergevorderd stadium van de oorspronkelijk gemelde ^4-6 de richting van degenen die meer gevoelig en reproduceerbaar ^7. Een belangrijke verbetering is het inbedden van kleinere hoeveelheden DNA in een agarose kraal, waardoor de bescherming van DNA van de harde bisulfiet behandeling ^8. Hierdoor konden methylatie analyse worden uitgevoerd op zwembaden van eicellen en het blastocyst-stadium embryo's ^9. De meest geavanceerde bisulfiet mutagenese protocol tot op heden is aan de individuele blastocyst-embryo's ^10. Aangezien blastocysten hebben gemiddeld 64 cellen (die 120 tot 720 pg van DNA), deze methode niet doeltreffend voor methylering studies individuele oöcyten of splitsing-embryo's. tent "> Met aanwijzingen van agarose inbedding van minuut DNA-bedragen inclusief eicellen ^11, hier presenteren wij een methode waarbij eicellen direct zijn ingebed in een agarose en lysis oplossing kraal onmiddellijk na het ophalen en verwijderen van de zona pellucida van de eicel. Dit stelt ons in staat omzeilen de twee belangrijkste uitdagingen van een eicel bisulfiet mutagenese:. bescherming van een geringe hoeveelheid DNA van degradatie, en de daarop volgende verlies tijdens de vele stappen protocol is belangrijk, aangezien de gegevens zijn verkregen van enkele eicellen, de kwestie van de PCR-vertekening in zwembaden wordt geëlimineerd Verder. , onopzettelijke cumulus cellen besmetting is detecteerbaar met deze methode, omdat een monster met meer dan een methylatie patroon kan worden uitgesloten van de analyse ^12. Dit protocol biedt een verbeterde methode voor een succesvolle en reproduceerbare analyses van DNA-methylatie op de single-cell niveau en is bij uitstek geschikt individuele eicellen en splitsing-embryo's.

Protocol

DAG 1

Bereid de volgende oplossingen vers op de dag van de eicel collectie met steriel, gedestilleerd water, zoals GIBCO water. Om de kans op DNA-besmetting te verminderen, veranderen vaak handschoenen en gebruiken filter tips. Houd de buizen weg schuin wanneer het open is, en samen te vatten alle buizen wanneer niet in gebruik. Wij raden aan dat oplossingen zijn als n +1.

3% LMP agarose

30 mg laag smeltpunt (LMP) Agarose
tot 1 ml GIBCO _H2O
te ontbinden @ 70 ° C

Lysis Solution

8 pi lysisbuffer
1 pi pro....

Discussie

Deze ene eicel test bevat een groot aantal stappen met een aantal die kritisch zijn en vereisen speciale zorg. De eerste is eicel wassen. Het is bijzonder belangrijk voor elke eicel wassen meerdere malen in vers medium daalt na hyaluronidase behandeling om zoveel cumuluscellen mogelijk. Bovendien, wanneer de overdracht van eicellen om de oplossing te zure tyrode voor zona pellucida verwijderen zorg ervoor dat omringende medium vrij is van cumulus cellen. De eicel is zeer kleverig na zona verwijderen, en alle omringende .......

Materialen

Tabel specifieke reagentia en materialen.

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Eicel Collectie
Hyaluronidase	Sigma	H4272
Zure tyrode	Sigma	T1788
Proteinase K	Sigma	P5568
10% IGEPAL	Bioshop	NON999.500
Lysis Solution
Tris pH 7,5	Bioshop	TRS001.5
LiCl	Sigma	L9650	& Nbsp;
EDTA pH 8,0	Sigma	E5134
LIDS	Bioshop	LDS701.10
DTT	Invitrogen	P2325
SDS Lysis Buffer
TE pH 7,5	Bioshop (Tris) Sigma (EDTA)	TRS001.5 E5134
10% SDS	Bioshop	SDS001.500
Bisulfiet Conversie
Natriumhydroxide	Sigma	S8045
Natrium Hydrogensulfite (natriumbisulfiet)	Sigma	243973	;
Hydrochinon	Sigma	H9003
Low Melting Point (LMP) Agarose	Sigma	A9414
Minerale olie	Sigma	M8410
M2 Medium	Sigma	M7167
GIBCO Gedistilleerd water	Invitrogen	15230-196
Geautoclaveerd dubbel gedistilleerd (dd) water
PCR
Illustraties Hot Start Mix RTG	GE Healthcare	28-9006-54
240 ng / ml gist tRNA	Invitrogen	15401-011
5x Green GoTaq reactiebuffer	Promega	M7911
Binnen en buiten geneste primers	Sigma
Ligatie
Promega pGEM-T Easy-vector	Fisher Scientific	A1360
TA Cloning
Bevoegde E.coli-cellen	Zymo Research Corp	T3009
Uitrusting
Stereomicroscoop
70 ° C en 90 ° C warmte Blokken
37 ° C en 50 ° C waterbaden (42 ° C voor transformaties)
Schommelstoel
PCR-machine