Single Eicel bisulfiet Mutagenese

Samenvatting

Bisulfiet mutagenese is de gouden standaard voor het analyseren van DNA-methylatie. Onze gewijzigde protocol zorgt voor een DNA-methylatie analyse op de single-cell niveau en is speciaal ontworpen voor individuele eicellen. Het kan ook worden gebruikt voor splitsing-embryo's.

Samenvatting

Epigenetica omvat alle erfelijke en reversibele aanpassingen van chromatine, dat alter gen toegankelijkheid, en dus zijn de belangrijkste mechanismen voor het reguleren van gentranscriptie ^1. DNA-methylatie is een epigenetische modificatie die voornamelijk fungeert als een repressieve merk. Door de covalente toevoeging van een methylgroep op cytosines in CpG dinucleotiden, kan het werven extra repressieve eiwitten en histon-modificaties aan processen die betrokken zijn in condenserende chromatine en zwijgen genen ² te starten. DNA-methylatie is essentieel voor normale ontwikkeling, want het speelt een cruciale rol in het ontwikkelings-programma's, celdifferentiatie, onderdrukking van retrovirale elementen, X-chromosoom inactivatie en genomic imprinting.

Een van de meest krachtige methoden voor DNA methylatie analyse is bisulfiet mutagenese. Natriumbisulfiet is een DNA-mutageen dat cytosines deaminates in uracils. Na PCR-amplificatie en Seque ncing, worden deze conversie gebeurtenissen gedetecteerd als thymines. Gemethyleerde cytosines worden beschermd tegen deaminering en dus blijven cytosines, waardoor de identificatie van DNA-methylatie op individueel nucleotide niveau ^3. De ontwikkeling van de bisulfiet mutagenese test in een vergevorderd stadium van de oorspronkelijk gemelde ^4-6 de richting van degenen die meer gevoelig en reproduceerbaar ^7. Een belangrijke verbetering is het inbedden van kleinere hoeveelheden DNA in een agarose kraal, waardoor de bescherming van DNA van de harde bisulfiet behandeling ^8. Hierdoor konden methylatie analyse worden uitgevoerd op zwembaden van eicellen en het blastocyst-stadium embryo's ^9. De meest geavanceerde bisulfiet mutagenese protocol tot op heden is aan de individuele blastocyst-embryo's ^10. Aangezien blastocysten hebben gemiddeld 64 cellen (die 120 tot 720 pg van DNA), deze methode niet doeltreffend voor methylering studies individuele oöcyten of splitsing-embryo's. tent "> Met aanwijzingen van agarose inbedding van minuut DNA-bedragen inclusief eicellen ^11, hier presenteren wij een methode waarbij eicellen direct zijn ingebed in een agarose en lysis oplossing kraal onmiddellijk na het ophalen en verwijderen van de zona pellucida van de eicel. Dit stelt ons in staat omzeilen de twee belangrijkste uitdagingen van een eicel bisulfiet mutagenese:. bescherming van een geringe hoeveelheid DNA van degradatie, en de daarop volgende verlies tijdens de vele stappen protocol is belangrijk, aangezien de gegevens zijn verkregen van enkele eicellen, de kwestie van de PCR-vertekening in zwembaden wordt geëlimineerd Verder. , onopzettelijke cumulus cellen besmetting is detecteerbaar met deze methode, omdat een monster met meer dan een methylatie patroon kan worden uitgesloten van de analyse ^12. Dit protocol biedt een verbeterde methode voor een succesvolle en reproduceerbare analyses van DNA-methylatie op de single-cell niveau en is bij uitstek geschikt individuele eicellen en splitsing-embryo's.

Protocol

DAG 1

Bereid de volgende oplossingen vers op de dag van de eicel collectie met steriel, gedestilleerd water, zoals GIBCO water. Om de kans op DNA-besmetting te verminderen, veranderen vaak handschoenen en gebruiken filter tips. Houd de buizen weg schuin wanneer het open is, en samen te vatten alle buizen wanneer niet in gebruik. Wij raden aan dat oplossingen zijn als n +1.

3% LMP agarose

30 mg laag smeltpunt (LMP) Agarose
tot 1 ml GIBCO _H2O
te ontbinden @ 70 ° C

Lysis Solution

8 pi lysisbuffer
1 pi proteinase K
1 pi 10% IGEPAL
plaats op ijs tot aan gebruik

02:01 Agarose: Lysis Solution (10 ul per individuele eicel, het bedrag is voor 3 eicellen)

20 ul 3% LMP agarose
10 pi Lysis Solution
Meng @ 70 ° C

SDS Lysis Buffer (501 ul per persoon eicel)

1 x TE pH 7,5	450 ul
10% SDS	50 ul
Proteinase K	1 pi
	501 ul

1. Eicel Collectie

1. Plaats de muis ontleed eileiders in M2 media, en scheur de ampullen aan de cumulus cellen complex te extraheren.
2. Scheid de eicellen uit de cumulus cellencomplex gebruik van 0,3 mg / ml hyaluronidase oplossing in een 30 ul druppel M2 media. Houd de eicellen in oplossing slechts zo lang als het duurt om verwijderen van de cumulus cellen, zoals langdurige blootstelling kan beschadigen. Was de oöcyten 3x in 30 pi druppel M2 media verwijderd cumuluscellen periodiek.
3. Verwijder de zona pellucida met behulp van zure tyrode-oplossing. Plaats de eicellen in een 30 ul druppel van de oplossing, en dan naar een ander 30pl drop, als het even welke media meegevoerd zal verdunnen het zuur en vermindering van de efficiëntie. Houd de eicellen in oplossing slechts zo lang als het duurt om de zona te verwijderen, zoals langdurige blootstelling kan beschadigen. Opmerking: een verhoogde concentratie van de oplossing zure tyrode of pronase kunnen worden gebruikt voor humane monsters de menselijke zona pellucida beter bestand is tegen de behandeling met zuur oplossing tyrode de van de muis.
4. Was de eicellen nog eens in een 30 ul druppel M2 media.

2. Agarose inbedding en Lysis

1. Om agarose inbedding uitvoeren, plaatst u de lysis oplossing op een 70 ° C heatblock. Voeg de voorverwarmde LMP agarose de lysis oplossing produceert een 2:1 agarose: lysis oplossing.
2. Plaats een eicel op een schoon glasplaatje in een mum van M2 media. Neem een ​​stijging van 10 ul van de agarose: lysis oplossing in een pipet, en (onder de microscoop) voorzichtig verwijdering van een kleine hoeveelheid (~ 1 ui of minder) op het glasplaatje, waardoor het te mengen met de minimAl media. Voorzichtig pak je de eicel in de pipetpunt en zet alle 10 pl in een eppendorfbuisje met 300 ul minerale olie, zodat de kraal vormt een bol.
   Opmerking: dit proces moet vrij snel worden uitgevoerd als de agarose hardt als de temperatuur slechts 5 ° C onder 70 ° C.
3. Incubeer de buis op ijs gedurende 10 minuten. Lysis uitvoeren verwijderen 300 ul minerale olie en voeg 500 pi van de SDS lysisbuffer. Incubeer overnacht in een 50 ° C waterbad.
   Opmerking: Lysis oplossing (tabel 1) kunnen ook worden gebruikt voor dit doel.

DAG 2

Bereid de volgende oplossingen vers op de dag van bisulfiet mutagenese. Om kans op DNA-besmetting te verminderen, veranderen vaak handschoenen en gebruiken filter tips. Houd de buizen weg schuin wanneer het open is, en samen te vatten alle buizen wanneer niet in gebruik. Wij raden aan dat oplossingen zijn als n +1.

3 M NaOH	2,4 g NaOH in 20 ml autoclaaf DDH 2 O
0,1 M NaOH	0,5 ml 3M in 14,5 ml autoclaaf DDH 2 O
0,3 M NaOH	1,5 ml 3M in 13,5 ml autoclaaf DDH 2 O

2,5 M oplossing bisulfiet

1. 3,8 g natriumbisulfiet
   5,5 ml gedestilleerd GIBCO _H2O
   1 ml 3 M NaOH
   te ontbinden @ kamertemperatuur
2. 110 mg hydrochinon
   1 ml gedestilleerd GIBCO _H2O
   te ontbinden @ 90 ° C (voor zolang het duurt om op te lossen, meng regelmatig)

Bij volledig is opgelost, mengen oplossing (a) en (b)
* Uit de buurt van het licht *

3. Bisulfiet Mutagenese

1. Volledig verwijderen 500 ul lysisbuffer SDS en voeg 300 ul minerale olie (~ 20 uur). Elke lysisbuffer resterende zal verdunnen ee agarose bij verhitting en de kraal gevoeliger zijn oplossen in de volgende stappen. Ga direct door met bisulfiet mutagenese, of op te slaan bij -20 ° C gedurende maximaal 5 dagen.
2. Indien van toepassing, verwijder eicellen uit de vriezer en laat ontdooien (slechts tot agarose kraal is relatief doorzichtig). Incubeer gedurende 2,5 minuut op een 90 ° C warmte-blok, waarna Incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
   Let op: Niet mengen of roeren, het uitbreiden van langer dan 2,5 minuten, of fluctueren temperatuur.
3. Om denaturatie uit te voeren, verwijder dan de minerale olie en voeg 1 ml 0,1 M NaOH aan elke buis, flick en omkeren 5-6 keer.
4. Incubeer gedurende 15 minuten in een 37 ° C waterbad, om te keren om de 3-4 minuten. De kraal moet drijven in de NaOH.
5. Om bisulfiet behandeling uit te voeren, de buis voorzichtig draaien, verwijder vervolgens de NaOH en voeg 300 ul minerale olie en 500 ul bisulfiet oplossing. Incubeer de buis gedurende 3,5 uur in een 50 ° C waterbad. * Uit de buurt van het licht *
   Opmerking: lengte van incubatie kan moet empirisch worden bepaald gen van belang.
6. Om desulfonation uit te voeren, incuberen op ijs gedurende 3 minuten en verwijder dan de minerale olie en de bisulfiet oplossing, draaien zachtjes en voeg 1 ml 0,3 M NaOH. Flick en omkeren 5-6 keer.
7. Incubeer gedurende 15 minuten in een 37 ° C waterbad, om te keren om de 3-4 minuten. De kraal moet drijven in de NaOH.
8. Was de monsters, door eerst voorzichtig draaien, verwijder vervolgens de NaOH en voeg 1 ml 1x TE pH 7,5. Schudden gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (op een schudapparaat). Weer voorzichtig Spin, verwijder dan de 1x TE. Herhaal dit twee keer wassen.
9. Voeg 1 ml autoclaaf DDH ₂ O. Schudden gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (op een schudapparaat). Draai voorzichtig, verwijder vervolgens de H ₂ O. Twee keer herhalen DDH ₂ O wassen.
10. De pH van de bovenstaande vloeistof, het moet pH 5,0. Als nog te basic, weer wassen met H ₂ O. Verwijder alle bovenstaande vloeistof, waardoor alleen de agarose zijnadvertentie.

4. 1 ^e en 2 ^e ronde PCR-amplificatie

1. Bereid 1 ^e ronde PCR-mix ** tijdens het wassen **

10 uM Primer Forward Outer	0,5 ul
10 uM Primer Reverse Outer	0,5 ul
240 ng / ml tRNA	1 pi
H2O	13 pl

Toevoegen aan Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR kralen
Schuif de vaste agarose kraal in de PCR-buis (~ 10 pi)
Na verwarming tot 70 ° C en meng
Voeg 25 ul minerale olie
Totaal: 50 pi

2. Versterken
   Opmerking: Een voorbeeld van fietsen voorwaarden muis Snrpn is denaturatie 2 minuten bij 94 ° C, gevolgd door 40 cycli van 30 seconden bij 94 ° C, 1 minuut bij 50 ° C en 1minuten bij 68 ° C en een laatste 10 minuten verlengingsstap bij 68 ° C. Annealing temperatuur voor 1 ^e ronde PCR voor muis H19 en Peg3 is 50 ° C.
3. Bereid 2 ^e ronde PCR-mix

10 uM Primer Forward Inner	0,5 ul
10 uM Primer Reverse Inner	0,5 ul
H2O	19 pl

Toevoegen aan Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR kralen
Voeg 5 pl 1 ^e ronde product als een sjabloon. Verwarm de ^1e ronde product tot 70 ° C gedurende 1 minuut op de agarose verzachten. Zorg ervoor dat u pipetteer onder de laag van minerale olie.
Voeg 25 ul minerale olie
Totaal: 50 pi

Let op: Geneste primersequenties voor Snrpn, H19 en Peg3 zijn te vinden in de markt-Velker et al. ^10,12.

4. Versterken
   Opmerking: fietsen voorwaarden muis Snrpn is denaturatie 2 minuten bij 94 ° C, gevolgd door 40 cycli van 30 seconden bij 94 ° C, 1 minuut bij 50 ° C en 1 minuut bij 68 ° C en een laatste 10 minuten rek stap bij 68 ° C ^10. Muis H19 en Peg3 vereisen een 50 ° C annealing temperatuur voor de 2 ^e ronde PCR.
5. Als een diagnostische test, kan tweede ronde monsters worden gesneden met een restrictie-enzym dat methylatie-of stam-specifieke.

2 e Ronde product	4 pi
Restrictie-enzym	1 pi
Buffer	1 pi
H2O	4 pi

6. Electrophorese de vertering producten 8% acrylamide gel. Een heterogene bands vertegenwoordigen meer dan een SequeNVU.

5. TA Klonering en kolonie-PCR

1. Om ^2e ronde product eerst warmte 70 klonen ° C gedurende 1 minuut op de agarose dan ligeren in de vector volgens de Promega pGEM-T vectorsysteem (Fisher Scientific Cat # A1360) verzachten.

2 e Ronde PCR	1 pi
pGEMT-EASY vector	1 pi
Ligase	1 pi
H2O	2 pi
2x ligatiebuffer	5 pi

Incubeer overnacht @ 4 ° C in PCR-machine.

2. Ontdooi bevoegde E.coli-cellen op ijs gedurende 15 minuten (Zymo Research Corp Cat # T3009). Voeg 3 pi ligatiereactie 8 pi E. coli en incubeer ligatie op ijs gedurende 15 minuten.
3. Heat shock gedurende 40 seconden in een 42 ° C waterbad,en incubeer op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 60 pi SOC medium en incuberen bij 37 ° C gedurende 1 uur (shaker).
4. Plaats alle van de reactie mix op een LB / Agar / IPTG / Xgal / Amp plaat en incubeer plaat bij 37 ° C gedurende de nacht.
5. Bereid kolonie PCR-mix

20 uM M13 voorwaartse primer	0,7 pl
20 uM M13 reverse primer	0,7 pl
5x Green Go Taq-Buffer	7,0 pl
10 mM dNTP	0,7 pl
Taq DNA polymerase	0,28 ul
H2O	25,62 pl
	35 pl Totaal

Voeg 35 pl kolonie PCR Master Mix in een PCR-buis. Kies een witte bacteriële kolonie van de plaat met een pipet, en zwenk het in de PCR-reactie.

6. Versterken met denaturatie gedurende 10 minuten bij 94 ° C, gevolgd door 30 cycli van 45 seconden bij 94 ° C, 30 seconden bij 57 ° C en 1 minuut bij 72 ° C en een laatste 10 minuten rek bij 72 ° C. Electrophorese 4 pi van een 1,5% agarosegel. Stuur ~ 30 pi van het PCR product sequentie.
   Opmerking: Voor eicellen, 5 kolonie PCR-producten worden gesequenced.
7. Zodra sequencing resultaten worden verkregen, kan methyleringspatronen worden gelezen. Elke originele CG dat bleef als een CG is gemethyleerd, en alle originele CG dat het nu een TG werd ongemethyleerd.

6. Representatieve resultaten

In ons werk hebben we test ingeprent methylatie in individuele eicellen en embryo's (figuur 1). Na geneste PCR amplificatie met primers bisulfiet omgezet, is het mogelijk om een conversie bevestigen visualiseren een juiste fragmentgrootte op een agarosegel (figuur 2). Een afzonderlijke oöcytvertegenwoordigt een ouderlijke allel en in principe heeft een bedrukt methylatiepatroon. Als zodanig kan tweede PCR-producten worden getest onbedoelde verontreiniging. Een restrictie-enzym gevoelig DNA methylering (zoals Hinfl of DpnII) kan worden gebruikt om de tweede PCR-product verteerbaar beoordelen of het een gemethyleerd of gemethyleerd allel (figuur 3) bevat. Een gemethyleerde C in het enzym herkenningssequentie gesplitst terwijl een gemethyleerd C wordt omgezet T niet meer herkend door het enzym en afgesneden. Elke MII eicel monster die zowel gemethyleerde en niet-gemethyleerd allelen dient te worden weggegooid, omdat het wijst op cumulus cellen verontreiniging (figuur 3). Na ligatie en transformatie kunnen succesvolle kolonie-PCR amplificatie gevisualiseerd op een agarose gel om monsters met de juiste grootte product worden verzonden voor sequencing (figuur 4). Tenslotte is de volgorde van vijf afzonderlijke cldie van een MII eicel moet produceren vijf identieke methylatie patronen en identieke nonCpG omrekeningskoersen (figuur 5a). Alle monsters meer dan een patroon bevat moet worden verwijderd (figuur 5b). Aangezien geovuleerde MII oöcyten twee exemplaren chromosoom of een aangesloten polaire lichaam, is het mogelijk voor het verkrijgen twee identieke sequentie patronen (figuur 5c). Wij raden gegevens te verwijderen uit eicellen die zeer ongelijke methylatie patronen hebben sinds cumulus cellen besmetting kan niet worden uitgesloten.

Figuur 1. Schematische voorstelling van de interne Eicel bisulfiet Mutagenese test.

Figuur 2. Vertegenwoordiger van de resultaten van 2 ^e ronde versterking voor Snrpn van een zingenle MII eicel op een 1,5% agarosegel. Lanes 1-4 zijn vier enkele MII eicellen en baan 5 is een negatieve controle (geen eicel). Verwachte amplicongrootte voor Snrpn is 420 bp. L, ladder.

Figuur 3. Representatieve resultaten van ² t ronde Methylatiespecifieke restrictiedigestie van Snrpn van een MII eicel van een 8% acrylamide gel. Hinfl diagnostische restrictiedigestie toont ongemethyleerd DNA dat een T de restrictieplaats schaft herbergt (420bp, laan 1) of gemethyleerd DNA dat een C in herkenningsplaats bevat (cut, 262, 103 en 54 bp, laan 2). Spijsvertering met zowel gemethyleerde en niet-gemethyleerd restrictie-enzym sites (cut & uncut bands, laan 3) zijn een indicatie van cumulus cellen besmetting. L, ladder.

Figuur 4. Representatieve resultaten kolonie-PCR amplificatie voor Snrpn van een MII eicel op een 1,5% agarosegel. Verwachte amplicongrootte na ligatie van Snrpn in de pGEM-T Easy-vector en het gebruik van M13 forward en reverse primers is 656 bp. Lane 1-8 amplicons van klonen 1-8. Kloon 5 heeft een onjuiste ampliconlengte en mag niet worden verzonden voor het rangschikken.

Figuur 5. Vertegenwoordiger van sequencing resultaten voor Snrpn van een enkele MII eicel. Snrpn wordt gemethyleerd in eicellen. Zwarte cirkels geven gemethyleerde CpGs. Witte cirkels geven aan niet-gemethyleerd CpGs. CpG aantal en plaatsing is vertegenwoordiger voor een B6 stam vrouwelijke muis. a) Verwachte sequencing resultaten voor Snrpn van een enkele MII eicel. Slechts een enkele streng van het DNA te versterken in alle vijf klonen. Eicellen met een methylatie patroon en dezelfde niet-CpG conversie babbeln worden opgenomen in analyses (percentage omzetting van niet-CpGs rechts naast werd berekend als het aantal niet-CpG cytosines omgezet thymine als percentage van de totale niet-CpG cytosines). b) Sequencing resultaten voor Snrpn uit een enkele eicel MII met cumulus cellen besmetting. Let op de ongelijkheid tussen methylatie staten en conversie patronen die aangeven meerdere streng versterking. c) Sequencing resultaten voor Snrpn uit een enkele eicel MII met beide chromosoom-kopieën of polaire lichaam integratie.

Discussie

Deze ene eicel test bevat een groot aantal stappen met een aantal die kritisch zijn en vereisen speciale zorg. De eerste is eicel wassen. Het is bijzonder belangrijk voor elke eicel wassen meerdere malen in vers medium daalt na hyaluronidase behandeling om zoveel cumuluscellen mogelijk. Bovendien, wanneer de overdracht van eicellen om de oplossing te zure tyrode voor zona pellucida verwijderen zorg ervoor dat omringende medium vrij is van cumulus cellen. De eicel is zeer kleverig na zona verwijderen, en alle omringende ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Eicel Collectie
Hyaluronidase	Sigma	H4272
Zure tyrode	Sigma	T1788
Proteinase K	Sigma	P5568
10% IGEPAL	Bioshop	NON999.500
Lysis Solution
Tris pH 7,5	Bioshop	TRS001.5
LiCl	Sigma	L9650	& Nbsp;
EDTA pH 8,0	Sigma	E5134
LIDS	Bioshop	LDS701.10
DTT	Invitrogen	P2325
SDS Lysis Buffer
TE pH 7,5	Bioshop (Tris) Sigma (EDTA)	TRS001.5 E5134
10% SDS	Bioshop	SDS001.500
Bisulfiet Conversie
Natriumhydroxide	Sigma	S8045
Natrium Hydrogensulfite (natriumbisulfiet)	Sigma	243973	;
Hydrochinon	Sigma	H9003
Low Melting Point (LMP) Agarose	Sigma	A9414
Minerale olie	Sigma	M8410
M2 Medium	Sigma	M7167
GIBCO Gedistilleerd water	Invitrogen	15230-196
Geautoclaveerd dubbel gedistilleerd (dd) water
PCR
Illustraties Hot Start Mix RTG	GE Healthcare	28-9006-54
240 ng / ml gist tRNA	Invitrogen	15401-011
5x Green GoTaq reactiebuffer	Promega	M7911
Binnen en buiten geneste primers	Sigma
Ligatie
Promega pGEM-T Easy-vector	Fisher Scientific	A1360
TA Cloning
Bevoegde E.coli-cellen	Zymo Research Corp	T3009
Uitrusting
Stereomicroscoop
70 ° C en 90 ° C warmte Blokken
37 ° C en 50 ° C waterbaden (42 ° C voor transformaties)
Schommelstoel
PCR-machine