Formuleringen voor Vriesdrogen van bacteriën en hun invloed op de overleving van de cel

Samenvatting

Vriesdrogen is vaak een eenvoudige en handige manier om droge producten van levensvatbare bacteriële cellen te verkrijgen. Een kwestie van het proces is overleving van de cel. We detail hier een procedure te onderzoeken hoe celoverleving gedurende vriesdrogen wordt beïnvloed door de eigenschappen van de formulering.

Samenvatting

Cellular water kan worden verwijderd om reversibel inactiveren micro makkelijker opbergen. Een dergelijke methode van verwijdering is vriesdrogen, die als zachte uitdroging methode. Om celoverleving tijdens het drogen te vergemakkelijken, worden de cellen vaak vooraf geformuleerd. De samenstelling vormt een matrix die de cellen ingesloten en beschermt ze tegen diverse schadelijke stressfactoren waarmee de cellen tijdens invriezen en drogen. We stellen hier een algemene methode voor de overleving van cellen na vriesdrogen en evalueren we illustreren door de resultaten verkregen met vier verschillende formuleringen: de disaccharide sucrose, saccharose verkregen polymeer Ficoll PM400 en de respectieve Polysacchariden hydroxyethylcellulose (HEC ) en hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), twee bacteriestammen, P. putida KT2440 en A. chlorophenolicus A6. In dit werk illustreren we hoe de formuleringen te bereiden op vriesdrogen en hoe de mechanismen te onderzoekenisms van celoverleving na rehydratatie Door die formulering gebruikt van differentiële scanning calorimetrie (DSC), oppervlaktespanning metingen röntgenanalyse en elektronenmicroscopie en betreffende de gegevens overlevingskansen. De polymeren werden gekozen om een ​​monomere structuur van elke polysaccharide lijkt sucrose naar een verschillende mate. Met deze methode opstelling we zien dat polymeren celoverleving als effectief ondersteunen disachariden of bepaalde fysische eigenschappen van de formulering worden gecontroleerd ^1.

Protocol

1. Teelt en oogst van P. putida

1. Bereid een starter cultuur van Pseudomonas putida door het enten van 100 ml tryptische soja bouillon (TSB) met een kolonie van P. putida cellen gekweekt op agar gesupplementeerd met tryptische soja bouillon (TSA). Houd de cultuur bij 30 ° C op een schudden plank ingesteld op 130 tpm.
2. Na 7 uur dragen een hoeveelheid van de startercultuur gelijk aan 1/10 van het uiteindelijke volume van de belangrijkste cultuur om verse TSB-medium. Laat de cellen bij 30 ° C op een schuddend boord 130 rpm gedurende 16 uur.
3. Na 16 uur groei worden de cellen geoogst door het draaien van de celkweek bij 1500 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant en was de cellen door resuspenderen de celpellet in een NaCl-oplossing die isotonisch aan het groeimedium. In dit geval werd een 150 mM NaCl-oplossing gebruikt. De cellen worden dan opnieuw gecentrifugeerd en de supernatant wordt gedecanteerd voor resuspenderen van de cellen in het preparaat medium,zie stap 3.2.

2. Teelt van andere soorten

1. Om het protocol aan te passen aan andere bacteriesoorten de teelt en oogst procedures moeten worden aangepast aan de eisen van die soort. Om osmotische shock te vermijden bij behandeling van de cellen tijdens de oogst en de wasstap (s), de osmolaliteit van de oplossingen moet overeenkomen met dat van het groeimedium bij de oogst.

3. Formulering van cellen

1. Bereid de formulering oplossingen door weging van de respectieve matrix componenten en los ze in water. Om isotone voorwaarden te bereiken, hetzij het bedrag aanpassen van de hulpstof of voeg NaCl of een andere cel compatibele opgeloste stof aan de gewenste osmolaliteit te bereiken. Voor stoffen met laag molecuulgewicht zoals disachariden bedragen gemakkelijk kan worden aangepast aan isotone omstandigheden te bereiken. Voor stoffen zoals polymeren die een hoog molecuulgewicht, de toniciteit ingesteld moet worden met een mobiele compatibele zoluiten, bijvoorbeeld NaCl of disacchariden. Merk op dat toevoeging van een stof de fysische eigenschappen van de formulering, waardoor het vriesdrogen gedrag en celoverleving kan beïnvloeden beïnvloeden.
2. Decanteer de wasvloeistof (in dit geval NaCl) en resuspendeer de cellen in de respectieve formulering media.
3. Zorg ervoor dat de cellen homogeen verspreid zijn. Formuleringen van lage viscositeit worden gewerveld terwijl formuleringen van hogere viscositeit worden gemengd met behulp van door het toevoegen, bijvoorbeeld., Een roerstaaf en schudden van de container tot homogene menging wordt bereikt.
4. Verdeel de formuleringen in de vriesdroger flesjes. Het vaccin dient leeg gewogen, met monster voor en na vriesdrogen de hoeveelheid verwijderd water tijdens vriesdrogen berekenen.
5. Voeg rubberen stoppen aan de flacons als de flacon worden verzegeld in de vriesdroger, zie stap 4.3.
6. Inventariseer de cellen in elke formulering voor vriesdrogen, zie stap 6.

4. Vriesdrogen

1. Het vriesdrogen voorwaarden worden aangepast aan de fysische eigenschappen van de formulering. De belangrijkste parameter in dit geval de glasovergangstemperatuur, Tg, van de formulering, aangeduid Tg "voor de freeze-geconcentreerde monster aan te geven dat het water nog aanwezig. De Tg 'van de freeze-geconcentreerde formulering gemakkelijk gemeten met differentiële scanning calorimetrie (DSC), zie stap 7.
2. Pas de parameters van de vries-droogproces zodat de temperatuur van het monster steeds beneden de Tg van het monster en de kamerdruk maakt een snelle sublimatie van ijs, dat wil zeggen primair drogen en restwater in de formulering, dat wil zeggen secundaire drogen. Indien de monstertemperatuur boven Tg 'tijdens het droogproces er een groot gevaar voor instorting van het monster die de cellulaire overleving significant kan verminderen.
3. Om de droge producten te beschermen na freeze drogen het monster atmosfeer worden gecontroleerd. Indien mogelijk, sluit de monsters in de vriesdroger voordat het vacuüm wordt vrijgegeven op het einde van de vriesdrogen cyclus. Ook de flesjes gevuld kan worden met een gewenste atmosfeer. Het is belangrijk om blootstelling van de monsters aan de omgevingsomstandigheden voor vocht of zuurstof in de bewaaratmosfeer de overleving van cellen beïnvloeden.
4. Weeg de flesjes.

5. Rehydratie

1. Hydrateren de monsters met gedeïoniseerd en steriel water. De hoeveelheid water die moet worden toegevoegd dat dient met het bedrag verwijdert tijdens vriesdrogen en wordt berekend uit het gewicht van de lege flacon, hetzelfde flesje met monster voor en na vriesdrogen zijn. Vortex de monsters nu en dan weer tot de oplossingen verschijnen homogeen.

6. Opsomming

1. Trekken 100 pi van elk monster en maak 10-voudige seriële verdunningen. Uit de verdunningen van inteoverige 100 ul wordt uitgeplaat op TSA-platen. De platen worden geïncubeerd bij de temperatuur en tijd vereist.

7. Karakterisering van Formulering van Freezing Gedrag

1. Neem een ​​kleine hoeveelheid, 5-10 mg, van het monster en het insluiten in een DSC-aluminium pan met deksel. Bereid een lege pan als referentie.
2. Stel de DSC temperatuur scanprogramma. De koel-programma is ingesteld op de bevriezing stap in het vriesdrogen programma na te bootsen. Dit gebeurt als koelmiddel kinetiek beïnvloeden de Tg 'van de gehydrateerde samenstellingen. Vóór de verwarmingsscan begint omlaag brengen van de temperatuur ruim onder de verwachte Tg 'van de onderzochte formuleringen, gewoonlijk -100 ° C.
3. Kies een geschikte opwarmsnelheid, normaal gesproken een opwarmsnelheid van 5 - 40 ° C / min wordt gebruikt. De opgenomen warmte stroomsignaal wordt uitgedrukt in watt en wordt beïnvloed door de verwarmingssnelheid. Een hogere verwarming tarief zal een groter signaal van Tg 'te geven.
4. Stel het temperatuurbereik, zodat ikt omvat zowel Tg en het smelten van de formulering.

8. Surface Tension Metingen van de gehydrateerde formuleringen

1. De experimentele opstelling die in dit experiment wordt volgens de methode du Nouy oppervlak meten.
2. Reinig de platina ring en het meetvat zorgvuldig. Het vat wordt gespoeld met aceton, veegde met een niet-pluizende tissue, en vervolgens verbrand aan de binnenkant met een kleurloze vlam. De ring gloeit rood in een kleurloze vlam.
3. Vul het vat met de oplossing en laat het oppervlak af te wikkelen alvorens te meten. Voor oplossingen waarbij de evenwichtstoestand wordt pas na een lange tijd, bijvoorbeeld polymeren, de eenvoudige installatie Daarbij zal worden kwalitatieve gegevens.
4. Voor formuleringen met hoge viscositeiten, zoals oplossingen van 2% (w / w) HEC of HPMC, de oppervlaktespanning te meten aan oplossingen van lagere concentraties worden geëxtrapoleerd. Dit kan gedaan worden door te profiteren van het feit datde daling oppervlaktespanning afvlakt bij concentraties onder 0,5% (w / w).

9. X-ray analyse van de droge formuleringen

1. Neem een ​​kleine hoeveelheid van de matrix / bacteriën en te laden op een monsterhouder.
2. Monteer de monsterhouder in de X-ray-diffractometer.
3. Om kristallijne fase in het monster analyseren de EVA programmapakket van Bruker worden gebruikt.

10. Electron Microscopy

1. Neem een ​​kleine hoeveelheid van de matrix / bacteriën uit de flesjes en plaats deze op een SEM stomp.
2. Laad de SEM houder in het sputter-bekleder (Thermo VGScientific Polaron SC7640 gebruikt in het huidige werk) en de vacht van de steekproef met een paar nm van Au / Pd of Pt. In deze experimenten werden de sputteren parameters: 1900 V, 20 mA en 20 sec, voor een ~ 5-10 nm Au / Pd coating. De coating vermindert elektrische oplading tijdens beeldopname. Het wordt aanbevolen om te beginnen met een dunne laag en, indien opladen voortduren veroorzaakt imageartefacten, moet het monster opnieuw worden gecoat.
3. Laad de SEM houder in de SEM kamer. Selecteer de juiste beeldvorming parameters. Voor het instrument gebruikt in figuur 2 (FEI Strata DB235) gebruikten we 5 kV versnellingsspanning, spotsize 3, een werkafstand van 5 mm en de secundaire elektronen detector.
4. Eventueel is het mogelijk om de Focused Ion Beam dwarsdoorsneden van de bacteriën in het polymeer ingebedde voor verdere details onthullen snijden.

Resultaten

Tabel 1 toont gegevens formulering samenstelling, thermische gebeurtenissen DSC opgenomen tijdens het verwarmen van de bevroren samenstellingen, structuur van de droge monsters en de oppervlaktespanning van de formulering oplossingen. De _Tg 'van sacharose is bepaald -40 ° C ^{2, 3} en kan moeilijk te detecteren sucrose concentraties beneden 20% w / w. De thermische gebeurtenis bij -35 ° C houdt waarschijnlijk verband met het ontstaan ​​van ijs oplossing ^2. De k...

Discussie

De aanleiding voor dit onderzoek was om enkele formulering eigenschappen die van belang kunnen zijn voor de overleving van de cel tijdens vriesdrogen onderzoeken. Hoewel de intrinsieke drogen zekere tolerantie tussen verschillende soorten, zoals geïllustreerd in figuur 1A, de trend van hoe goed de verschillende formuleringen support celoverleving is vergelijkbaar. Het is informatief te beginnen met een vergelijking van sucrose en Ficoll. Er wordt aangenomen dat een belangrijke factor voor een formulerin...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift van Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift van de Faculteit Farmacie, Uppsala Universiteit
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educatieve Tensiometer	Krüss	N.A.