Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

Samenvatting

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca mitochondria ^{2 +} Handling, mitochondriale membraanpotentiaal en mitochondriale volume. De procedure voor het verkrijgen van hoge kwaliteit en functionele hart mitochondria wordt ook beschreven.

Samenvatting

De mitochondriale permeabiliteit transitie poriën (mtPTP) is een niet specifiek kanaal vormt in het binnenste mitochondriale membraan opgeloste stoffen transport met een moleculaire massa kleiner dan 1,5 kDa. Hoewel de definitieve moleculaire identiteit van de porie nog steeds ter discussie, eiwitten zoals cyclofiline D, VDAC en ANT bijdragen aan de vorming mtPTP. Hoewel de betrokkenheid van mtPTP opening in celdood is goed ingeburgerd ^1, accumuleren gegevens blijkt dat het mtPTP een fysiologische rol dient tijdens mitochondriale ^{Ca2 +} homeostase ^2, bio-energetica en redox signalering ^3.

mtPTP opening wordt geactiveerd door matrix Ca ^{2 +,} maar de activiteit kan gemoduleerd worden door verschillende factoren zoals oxidatieve stress, adenine nucleotide uitputting hoge concentraties Pi, mitochondriale membraan depolarisatie of ontkoppelen en lange vetzuurketens ^4. In vitro, mtPTP opening kan achieved door meer ^{Ca2 +} concentratie in de mitochondriale matrix door exogene toevoeging van Ca ^{2 +} (calcium retentievermogen). Wanneer Ca ^{2 +} niveaus binnen mitochondria bereiken van een bepaalde drempel, de mtPTP opent en faciliteert Ca ^{2 +} release, dissipatie van het proton beweging veroorzakende kracht, membraanpotentiaal ineenstorting en een toename van de mitochondriale matrix volume (zwelling), die uiteindelijk leidt tot de breuk van de buitenste mitochondriale membraan en onomkeerbaar verlies van organellen functie.

Hier beschrijven we een fluorometrische assay waarmee een uitgebreide karakterisering van mtPTP opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van drie mitochondriale parameters die gewijzigd wanneer mtPTP opening plaatsvindt: mitochondrial Ca ^{2 +} handling (opname en afgifte, zoals gemeten ^door Ca2 ⁺ concentratie in het testmedium), mitochondriale membraanpotentiaal en mitochondrial volume. De kleurstoffen toegepast voor Ca ^{2 +} meting in het testmedium en mitochondriale membraanpotentiaal zijn Fura FF, een membraan impermeant, ratiometrisch indicator die een verschuiving in de golflengte in aanwezigheid van Ca ^{2 +,} en JC-1, een kationische ondergaat, ratiometrische indicator die groen of rood monomeren aggregaten vormt bij lage en hoge membraanpotentiaal respectievelijk. Veranderingen in de mitochondriale volume worden gemeten door lichtverstrooiing door de mitochondriale schorsing. Sinds hoogwaardige, functionele mitochondriën nodig zijn voor de mtPTP opening test, hebben we ook een beschrijving van de stappen die nodig zijn voor het verkrijgen intact, zeer gekoppeld en functionele geïsoleerde hart mitochondriën.

Protocol

1. Isolatie van mitochondriën van Mouse Hart

1. Te isoleren hart mitochondriën, verdoven en te offeren muizen volgens de procedures die zijn goedgekeurd door uw lokale Institutionele Animal Care en gebruik Comite.

Opmerking: Alle stappen van de mitochondria isolatie-protocol moet worden uitgevoerd op ijs. Gebruik ijskoude buffers en voorgekoeld Petrischalen, Falcon buizen en Eppendorf buizen. De volumes die in het protocol zijn voor een monster dat 2 muis harten.

2. Harten verwijderen, ze in koud Mitochondria Isolatie buffer (300 mM sucrose, 10 mM Na-HEPES, 200 uM EDTA, pH 7,4) en spoelen bloed.

Opmerking: Voor een optimaal resultaat, de pH van mitochondriale buffers dienen te worden aangepast met KOH en azijnzuur.

3. Plaats harten op een koude petrischaaltje, verwijder vet en atria en gehakt fijn met behulp van een mes tot het verkrijgen vantot instelling van een homogeen product.
4. Overdracht gehakt harten in een 50 ml Falcon buis 10 ml Mitochondria Isolatie buffer met 0,1 mg / ml trypsine en laat het monster op ijs gedurende 10 minuten verteren.

Opmerking: Trypsine tijdens de isolatieprocedure verhoogt het rendement van geïsoleerde mitochondria en moet constant gehouden tussen mitochondriale preparaten worden. We raden testen mitochondriële functies op geïsoleerde preparaten is de afwezigheid van trypsine te zorgen dat het enzym niet interfereert met functionaliteit.

5. Voeg 10 ml Mitochondriën Isolatie buffer met 0,1% vetzuur vrij BSA en 5 mg trypsine-remmer (soja) en meng door het buisje om een ​​paar keer naar de trypsine te neutraliseren.

Opmerking: Mitochondria Isolation Buffer worden voorbereid en worden bewaard bij -20 ° C. Controleer de pH bij het ​​ontdooien. Trypsine, trypsine inhibitor of BSA moet eenT OEGEVOEGDE de Mitochondria Isolatie Buffer op de dag van het experiment.

6. Terugwinnen gedigereerd weefsel laag naar medium snelheid centrifugatie gedurende 1 min bij 4 ° C.
7. Resuspendeer weefsel in 8 ml Mitochondria Isolatie Buffer met 0,1% vrij vetzuur BSA en homogeniseren met een gemotoriseerde Dounce homogenisator met een Teflon stamper (4-6 passages bij 1,200-14,00 rpm). Houd het monster op ijs onder homogeniseren.
8. Breng gelijkmatig verdelen in een 15 ml Falcon buis en centrifugeer bij 800xg gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet kernen en weefselafval.
9. Herstel de supernatant die de mitochondria in Eppendorf buizen en centrifugeer bij 8000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
10. Verwijder voorzichtig de bovenste witte laag en was de resterende donkerder pellet met daarin de mitochondriën in 1 ml Mitochondriën Isolatie buffer.
11. Centrifugeer bij 8000xg gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Gooi supernatant en resuspendeer mitochondria pellet in 150 ui Mitochondriale Isolatie Buffer. Mitochondria houden op ijs voor verdere assays.

Opmerking: Voor het beste resultaat tijdens de functionele testen, mitochondriën gebruiken binnen 4 uur van isolatie.

12. Kwantificeren mitochondriaal eiwit met de Bradford assay.

2. Kwaliteitscontrole van geïsoleerde Mitochondria

2.1. Meting van ademhaling ratio (RCR)

1. Kalibreer de Oxytherm zuurstof elektrode met lucht verzadigde water om de maximale zuurstofopname lijn vast te stellen. Wanneer een stabiel niveau van zuurstof verkregen voeg 100 ul van een vers bereide 10 mM natriumhydrosulfiet oplossing van het zero zuurstof lijn stellen. Voer metingen bij 30 ° C.
2. Voeg 2 ml Mitochondria Respiration Buffer (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM _MgCl2, 400 uM EGTA, 300 uM DTT, 5 mM KH _{2PO 4,} pH 7,2) met 1 uM rotenone de Oxytherm kamer, de kamer afdichten en start RECORding.
3. Wanneer zuurstof signaal stabiel is, voeg 250 ug mitochondria en basale plaat ademhaling gedurende 1 min. De ademhaling op dit punt moet heel laag als mitochondriën zijn ademende op de endogene substraten (staat 1 ademhaling).
4. Voeg 5 mM succinaat en opnemen signaal gedurende 1 minuut. Zuurstofverbruik moet stijgen tijdens het staatsbezoek van twee ademhaling.
5. State 3 induceren ademhaling door toevoeging van 150 uM ADP. Op dit punt zuurstofverbruik moet toenemen als gevolg van de ATP-synthese door middel van oxidatieve fosforylering. Record signaal tot ademhaling vertraagt, wat aangeeft ADP verbruik en de overgang naar 4 ademhaling staat. Record State 4 ademhaling ten minste 1 min.
6. Voeg 1 uM CCCP en opnemen van signaal gedurende 1 minuut. Ontkoppelde ademhaling moet maximaal zijn.

Opmerking: Het effect van CCCP op de mitochondriale ademhaling is dosisafhankelijk: hoge concentraties van CCCP kan zuurstofverbruik remmen en moet daarom zorgvuldig worden titrated.

7. Bereken de luchtwegen controle ratio (RCR) wordt berekend door zuurstof verbruik tijdens het staatsbezoek van 3 ademhaling door de zuurstof verbruik tijdens het staatsbezoek van 4 ademhaling. Een doel RCR dient ≥ 4.

2.2. Beoordeling van de mitochondriale membraan integriteit (cytochroom c-test)

1. Grondig wassen Oxytherm kamer met 70% ethanol en water en herhaal de stappen 2.1.2 -2.1.4.
2. Voeg 1 mM ADP en opnemen van zuurstof verbruik gedurende 1 minuut.
3. Voeg 10 uM cytochroom c. Aangezien cytochroom c ondoordringbaar is voor intact membranen, een toename geeft ademhaling gebroken of beschadigde mitochondriale membranen.

3. Meting van de mitochondriale permeabiliteit Transitie porie openend

1. Stel de spectrofluorometer voor de multi-parameter meting van mtPTP opening. Met behulp van de FelixGx programma, maak een nieuwe hardware-configuratie (Quanta meester gestage state) omvattende de lichtbron, excitatie monochromator, monstercompartiment en twee detectors geplaatst op 90 ° en 270 ° ten opzichte van de excitatie monochromator (figuur 4). Om maximale tijdsresolutie te bereiken, moeten zowel emissie monochromatoren (90 ° en 270 °) worden uitgeschakeld en de emissie filters bij 90 ° en 270 ° in de steekproef compartiment ingeschakeld in de hardware configuratie menu. Deze stap verwijdert de motorbesturing van de emissiegolflengten en bevestig elk monochromator bij een bepaalde golflengte. Als de emissie monochromatoren niet zijn uitgeschakeld, zal elke detector cyclus tussen beide golflengten en dubbele metingen zullen worden opgenomen.
2. Maak een nieuwe aanwinst protocol met behulp van de Multi Dye en voer de volgende kleurstoffen:
   • Fura (hoog Ca + +): excitatie 340 nm, emissie 525 nm (detector 1)
   • Fura (laag Ca + +): excitatie 380 nm, emissie 525 nm (detector 1)
   • JC1 (totaal): excitatie 543 nm, Emissie 595 nm (detector 2)
   • JC1 (monomeer): excitatie 498 nm, emissie 525 nm (detector 1)
   • Zwelling: excitatie 525 nm, emissie 525 nm (detector 1)
3. Stel de excitatie en emissie spleten tot 1 nm en de temperatuur tot 37 ° C.
4. De ratiometrische signaal Fura en JC-1 te verkrijgen, genereren twee afgeleide sporen: Fura (hoog Ca + +) / Fura (laag Ca + +) en JC1 (totaal) / JC1 (monomeer).
5. Handmatig de emissiegolflengte van detectoren 1 en 2 525 nm en 595 nm respectievelijk.
6. Meng 1 ml Mitochondria Assay Buffer (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH _{2PO 4,} 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) met 1 uM rotenon, 5 mM succinaat en 800 nM Fura FF in een wegwerp 4-zijdige methacrylaat cuvette. Voeg 250 mg mitochondriën en plaats monster in het monster compartiment. Ervoor zorgen dat de magnetische roerder aangezet.
7. Start de opname. Na 1 min, de overname pauzeren, voeg 500 nM JC-1 en start de eencquisition. De JC-1-ratio-signaal moeten toenemen, wat aangeeft kleurstof opname door actieve mitochondriën. Opnemen totdat JC-1 signaal heeft een plateau bereikt (gewoonlijk binnen 5 min).
8. Voeg 20 uM _CaCl2. Een instantane toename in Fura FF verhoudingssignaal opgemerkt door de verhoogde Ca ^{2 +} aanwezigheid in de assay buffer, gevolgd door een geleidelijke daling door mitochondriale ^{Ca2 +} opname. De JC-1 ratio signaal moet vertonen een korte voorbijgaande daling wijst op een lichte mitochondriale membraan depolarisatie.
9. Wacht tot Fura FF verhoudingssignaal terug naar het basale niveau voorafgaand aan toevoeging van een _CaCl2 puls (1-1,5 min). Verder pulseren op vaste intervallen mitochondriën niet kan ophopen Ca ^{2 +} en beginnen los Ca ^{2 +} in de assay buffer. mtPTP opening gevisualiseerd met een gelijktijdige toename in het Fura FF verhoudingssignaal door ^{Ca2 +} afgifte, een daling van het JC-1 signaalverhouding door membraan potential instorting, en een afname van de lichtverstrooiing te wijten aan mitochondriale zwelling (figuur 5).
10. Na activatie mtPTP respectievelijk controleert de specificiteit van Fura FF, JC-1 en zwelling signalen met 1 mM EGTA, 1 uM CCCP en 5 ug / ml alamethicin.
11. Om specificiteit van mtPTP opening controleren stappen herhaalt 3,6 - 3,9 in aanwezigheid van 1 uM van de cyclofiline D inhibitor cyclosporine A (cyclofiline D is een onderdeel van de mtPTP). In aanwezigheid van cyclosporine A, opening van de mtPTP vraagt ​​aanzienlijk meer CaCl ₂ pulsen dan controlemonsters (Figuur 6).

4. Representatieve resultaten

Figuur 2 toont een typische ademhaling geïsoleerde muizenhart mitochondria. State 3 ademhaling door toevoeging van ADP aan mitochondria ademende op succinaat, en wordt gekenmerkt door significant verhoogd zuurstofverbruik met betrekking tot de Hydrote alleen. Uitputting van toegevoegde ADP ingewijden State 4 ademhaling, waarbij zuurstofverbruik vertraagt ​​en is vergelijkbaar met tarieven voor behaald aan ADP toevoeging. RCR wordt verkregen door het zuurstofverbruik tarief voor Provincie 3 ademhaling door die van State 4 ademhaling. Het cytochroom c test wordt gebruikt om de assay voor de buitenste mitochondriale membraan: wanneer cytochroom c wordt toegevoegd aan mitochondria ademende op succinaat en ADP, geen verdere toename waargenomen ademhaling, geeft een intact buitenste membranen (Figuur 3).

Een vertegenwoordiger voor de mtPTP opening in geïsoleerde hart mitochondria is weergegeven in figuur 4. In dit geval mtPTP opening werd veroorzaakt door de toevoeging van 4 _CaCl2 pulsen (20 pM elk) van 1,5 min intervallen. mtPTP opening is duidelijk door de nabije gelijktijdige release van mitochondriale Ca ^{2 +} (toename van de Fura FF verhouding signaal), ineenstorting van mitochondRial membraanpotentiaal (afname van de JC-1 ratio-signaal) en verhoogde mitochondriale volume (afname van de zwelling signaal). Wanneer cyclosporine A wordt toegevoegd, dat bindt aan het cyclofiline D component van mtPTP, mtPTP opengesteld 7 pulsen _van CaCl2 in plaats van 4 (figuur 5).

Figuur 1. Stroomschema van de multi-parameter mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening protocol voor geïsoleerde hart mitochondria. Hart wordt gewonnen uit muizen en mitochondriën zijn geïsoleerd door middel van differentiële centrifugatie. De mitochondriale preparaat wordt vervolgens kwalitatief geëvalueerd door meting van de polarografische ademhaling verhouding en mitochondriale membraan intact in de aanwezigheid van cytochroom c. Mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde mitochondria wordt geactiveerd door sequentiële CaCl ₂ toevoegingen en wordt gemeten met een spectrofluorometer door het bewaken van Ca ^{2 +} release van mitochondriën, membraanpotentiaal instorting en zwelling van de mitochondriale matrix.

Figuur 2. Meting van ademhaling ratio (RCR) van geïsoleerde hart mitochondriën. Zuurstofverbruik door geïsoleerde hart mitochondria wordt tijdens State 3 ademhaling in aanwezigheid van ADP en succinaat en tijdens State 4 ademhaling na ADP consumptie. De reactie van geïsoleerde mitochondriën ontkoppelrails wordt gemeten door de toevoeging van CCCP. Getallen in de grafiek zijn de percentages van zuurstofverbruik door geïsoleerde mitochondriën in nmol / min / mg eiwit.

Figuur 3. Meet ling van membraan integriteit van geïsoleerde hart mitochondriën. Mitochondriale membraan integriteit wordt bepaald door zuurstofverbruik in mitochondria die in aanwezigheid van ADP en succinaat en na toevoeging van cytochroom c. Getallen in de grafiek zijn de percentages van zuurstofverbruik door geïsoleerde mitochondriën in nmol / min / mg eiwit.

Figuur 4. Spectrofluorometer hardwareconfiguratie voor de multi-parameter meting van mtPTP opening. De hardwareconfiguratie van de spectrofluorometer omvat een lichtbron, een excitatie monochromator, een monstercompartiment en twee detectoren met vaste emissiegolflengte bij 525 nm en 595 nm. Detector 1 wordt gebruikt voor de signaaldetectie van Fura FF hoge en lage Ca ^{2 +,} JC-1 monomeer en de zwelling signaal. Detector 2 meet de JC-1 aggregaat signaal.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 5. Multi-parameter meting van mtPTP opening in geïsoleerde hart mitochondriën. mtPTP opening werd veroorzaakt door opeenvolgende toevoegingen van 20 uM CaCl ₂ en werd gekenmerkt door Ca ^{2 +} release van mitochondriën, mitochondriale membraanpotentiaal instorting en een verhoogde mitochondriale matrix volume (zwelling). Extramitochondrial Ca ^{2 +} en membraanpotentiaal werd gemeten met de ratiometrische indicatoren Fura FF (groen trace) en JC-1 (rood trace). Zwelling van mitochondriën werd gemeten door lichtverstrooiing bij 525 nm (zwart spoor). Specificiteit van JC-1 en zwelling signalen werd getest met 1 uM CCCP en 5 ug / ml alamethicin (een microbieel toxine).

Figuur 6. Multi-Parameter meting van mtPTP opening in geïsoleerde hart mitochondria in aanwezigheid van cyclosporine A. Cyclosporine A (1 uM) verhoogt het aantal pulsen _CaCl2 moeten mtPTP openen in geïsoleerde hart mitochondria.

Discussie

De hier gepresenteerde protocol beschrijft de benodigde experimentele stappen permeabiliteit transitie porie opening beoordelen geïsoleerde hart mitochondria (figuur 1 en figuur 4): de werkwijze voor het isoleren muizenhart mitochondria, de luchtwegen controles die de integriteit en functionaliteit, de mitochondriale parameters gecontroleerd tijdens mtPTP opening en de kleurstoffen gebruikt voor de meting, het opzetten van de spectrofluorimetrische instrumentatie, en de karakterisering ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer
Trypsine	Sigma-Aldrich	T3030
Trypsineremmer (soja)	Sigma-Aldrich	T9128
Natriumhydrosulfiet	Sigma-Aldrich	71699
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
Cytochroom c	Sigma-Aldrich	C7752
Alamethicin	Sigma-Aldrich	A4665
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Cyclosporine A	Calbiochem	239835
Fura FF	Invitrogen	F14180
JC-1	Invitrogen	T3168
Tissue grinder Potter-Elvehjem met Teflon stamper 15 ml	Wheaton Industries
Overhead roerder	Wheaton Industries	903475
Oxytherm (temperatuurgestuurde zuurstofelektrode)	Hansatech Instrumenten
QuantaMaster 80 dual-emissie spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc