Nanotopology van Celadhesie op variabele-Angle Total Internal Reflection fluorescentie microscopie (VA-TIRFM)

Summary

Topologie van celhechting op een substraat wordt gemeten met nanometer precisie door variabele hoek totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM).

Abstract

Oppervlakte topologie, bijv. cellen die groeien op een substraat, wordt bepaald met nanometer precisie door Variable Angle-Total Internal Reflection fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM). Cellen worden gekweekt op objectglaasjes transparante en geïncubeerd met een fluorescente merker homogeen verdeeld in de plasmamembraan. Verlichting vindt plaats door een parallelle laserbundel onder variabele hoek van totale interne reflectie (TIR) ​​met verschillende penetratiediepten van het evanescente elektromagnetische veld. Opnemen van fluorescentiebeelden bij bestraling ongeveer 10 verschillende hoeken toestaat cel-substraat afstanden te berekenen met een nauwkeurigheid van enkele nanometers. Verschillen van hechting tussen verschillende cellijnen, bijv. kankercellen en minder kwaadaardige cellen zijn dus bepaald. Bovendien kunnen mogelijke veranderingen van celadhesie op chemische of fotodynamische behandeling onderzocht. In vergelijking met andere methoden van super-resolutie microscopie belichting wordt gehoudenzeer klein, en geen beschadiging van levende cellen wordt verwacht.

Introduction

Wanneer een lichtbundel voortplant door een medium _{brekingsindex} n1 een interface aan een tweede medium _{brekingsindex} n2 1, totale interne reflectie optreedt bij alle invalshoeken Θ, die groter zijn dan de kritische hoek Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Ondanks dat volledig gereflecteerd de invallende lichtbundel roept een verdwijnende elektromagnetisch veld dat in het tweede medium en vervalt exponentieel met loodrechte afstand z van het grensvlak dringt volgens I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) overeenkomt met de intensiteit van het elektromagnetische veld en d (Θ) de penetratiediepte b....

Protocol

1. Zaaien en incubatie van cellen

1. Seed individuele cellen, bijvoorbeeld U373-MG of U-251 MG-glioblastoma cellen bij een typische dichtheid van 100 cellen / mm ² op een glasplaatje en ze 4872 uur in kweekmedium groeien (bijv. RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en antibiotica) met een incubator bij 37 ° C en _5% CO2.
2. Incuberen met een membraan marker, bijv. 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naftaleen (laurdan) toegepast gedurende 60 min in een concentratie van 8 urn (in kweekmedium) ^4, of cytoplasma marker, bijvoorbeeld calceïne acetomethlyester aangevraagde 40 min bij een c....

Discussion

Een methode wordt beschreven voor het meten van cel-substraat afstanden nanometer precisie. Op dit moment, de wijze van super-resolutie microscopie, bijvoorbeeld op basis van gestructureerde verlichting ⁷ of op single molecule detectie ^{8 tot 10} en stimulated emission depletion (STED) microscopie ¹¹ zijn van groot belang. Geen van deze technieken maakt echter een axiale resolutie van minder dan 50 nm. Bovendien vrij hoge bestraling van 50100 W / cm ² nodig voor enkel m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam	Vennootschap	Type	Reacties
Broedmachine	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminaire stroming	Holten Safe	S2010 1,2 EN GG 1LN
DMEM + 10% FCS + 1% penicilline / streptomycine	Biochrom		Kweekmedium
Glazen voorwerp dia's	Marienfeld	Zuiver wit glas	Speciale gebruikt reinigingsprocedure
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naftaleen (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescente merker (voorraadoplossing: 2 mM in ethanol)
Microscoop	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laserdiode	PicoQuant	LDH 400 met chauffeur PDL 800-B	Golflengte: 391 nm
Single mode fiber-systeem	Point Source	kineFlex	Gebruikt met optieksysteem
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Terug verlicht camera