Verbeterde visualisatie van longmetastasen bij Single Cell resolutie in Muizen van de gecombineerde In-situ Perfusie van het longweefsel en X-gal kleuring van LacZ-Label tumorcellen

Samenvatting

De nieuwe protocol gerapporteerd in deze studie kan selectieve detectie van longmetastasen in cel resolutie in muizen door gecombineerde In-situ Longperfusie en fixatie en X-Gal kleuring van LacZ-Gelabeld tumorcellen.

Samenvatting

Metastase is de belangrijkste oorzaak van overlijden in de meeste vormen van kanker en dus een belangrijke focus in het kankeronderzoek. De detectie van micrometastasen van radiologische beeldvorming en het succes in hun therapeutische uitroeiing beperkt blijven.

Terwijl diermodellen hebben bewezen van onschatbare waarde voor kankeronderzoek ^1, de monitoring / visualisatie van micrometastasen blijft een uitdaging en onnauwkeurig evaluatie van metastatische verspreiding in preklinische studies mogelijk leidt tot teleurstellende resultaten in klinische studies ^2. Bijgevolg is er grote belangstelling voor het verfijnen van de methoden om uiteindelijk toe reproduceerbare en betrouwbare detectie van uitzaaiingen naar de enkele cel niveau in normaal weefsel. Het zwaartepunt ligt dus op technieken die de detectie van tumorcellen in vivo mogelijk, zoals micro-computer tomografie (micro-CT), positron emissie tomografie (PET), bioluminescentie of fluorescentie beeldvorming <sup> 3,4. We momenteel optimaliseren van deze technieken voor in vivo monitoring van primaire tumorgroei en metastase in verschillende modellen osteosarcoma. Sommige van deze technieken kunnen ook worden gebruikt voor ex vivo analyse van metastase naast klassieke methoden zoals qPCR ^{5, 6} of FACS verschillende histologische kleuring. Als referentiepunt, hebben we in de onderhavige studie de stabiele transfectie of transductie van tumorcellen met het lacZ-gen dat codeert voor het bacteriële enzym β-galactosidase dat het chromogene substraat 5-broom-4-chloor-3-indolyl-beta-D metaboliseert -galactopyranoside (X-Gal) aan een onoplosbare indigo blauwe kleurstof ⁷ en een zeer gevoelige en selectieve histochemische blauwe kleuring van tumorcellen in muizen weefsel ex vivo naar de enkele cel niveau zoals ze zijn. Dit is een low-cost en niet die apparatuur-intensieve tool, die zorgt voor een precieze validatie van metastase ⁸ in studies waarin de nieuwe eenticancer therapieën ^9-11. Een beperkende factor van X-gal kleuring is het lage contrast van bloed-gerelateerde kleuring van goed gevasculariseerde weefsels bijvoorbeeld. In longweefsel dit probleem kan worden opgelost door in-situ longperfusie, een techniek die recent werd door Borsig et al. ^12. Die de longen van muizen geperfuseerd onder verdoving om ze van bloed en op te lossen en te bedden in-situ onder inflatie door de trachea. Deze methode voorkomt tevens het uiteenvallen van de longen en daardoor behoudt de morfologie van functionele longblaasjes, waardoor de kwaliteit van het weefsel voor histologische analyse verbetert. In deze studie beschrijven we een nieuw protocol, dat gebruik maakt van een combinatie van X-gal kleuring van lacZ tot expressie brengende tumorcellen en in-situ perfusie en bevestiging van longweefsel. Deze verfijnde protocol maakt hoge gevoeligheid detectie van enkele metastatische cellen in de longen en stelde ons in staat in een recente studie aan detect "slapende" long micrometastasen in een muizenmodel ^13, oorspronkelijk beschreven als niet-metastatische ^14.

Protocol

1. In-situ longperfusie en fixatie

1. Verdoven muizen door ip injectie van ~ 150 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 112,5 mg / kg (lichaamsgewicht) ketamine, 16,5 mg / kg xylazine en 15 mg / kg acepromazine (of een andere verdoving die geschikte pijnstillers). Die
2. Wanneer reflexen van de muis niet meer waargenomen, bevestig deze op de operatietafel terug naar beneden en nat de vacht met 70% Ethanol die aan de slick de haren naar beneden.
3. Open de huid van de buik tot aan de nek en trek het naar de zijkanten of te verwijderen.
4. Open het buikvlies en de thorax van een voldoende grootte. Voorkom breuken van grote voorwerpen, (bijv. de vena jugularis) een verminderde efficiëntie van de daarop volgende perfusie te voorkomen.
5. Snij de vena cava onder caudalis de lever.
6. Gebruik een 20 ml spuit met een 21G - 24G naald langzaam 10-15 ml PBS injecteren in de rechter ventrikel van het kloppende hart totdat de longen volledig withet hart stopt met kloppen (asystolie).
7. Knijpen de bloedvaten de lever en het membraan met een vasculaire klem.
8. Een 10 ml spuit met een 21G - 24G naald ~ 2 ml 3% paraformaldehyde (PFA) in PBS injecteren in het rechterventrikel.
9. Ontdek de luchtpijp buitenkant van de thorax. Gebruik dezelfde spuit ~ 3 ml 3% PFA in PBS geïnjecteerd craniale (buiten thorax) in de luchtpijp tot de long wordt opgeblazen. Onmiddellijk na verwijdering van de naald, knijpen de trachea caudale van het lek met een vasculaire klem en wacht gedurende 10 min om fixatie mogelijk.
10. Doorsnijden de bloedvaten boven de vasculaire klem, verwijder de klem en injecteer ~ 2 ml PBS het rechterventrikel om overmaat PFA verwijderen.
11. Punctie de lagere delen van longkwabben met een naald, verwijdert de vasculaire klem op de trachea en injecteer 3-5 ml van een oplossing van PolyFreeze inbedding / PBS 01:01 in de luchtpijp caudale van de eerste tot de punctie PFA in de longlobben wordt vervangen door de oplossing.
12. Verwijder de long door aan het hart met een forceps en transsecteren bindweefsel bindweefsel, bloedvaten en de luchtpijp. Om het hart verbonden met de longen.
13. Afhankelijk van hoe verder te gaan met het longweefsel analyse verder met de protocollen beschreven in de punten 2 en 3. Als u wilt beide analyses te doen, verwijder dan een long kwab en ga verder zoals beschreven onder 3. Verwerk de resterende lobben verbonden met het hart zoals beschreven in 2.

2. Visualisatie van lacZ-tagged gemetastaseerde tumorcellen in hele longkwabben

1. Plaats de long in een plastic beker met strak sluitende deksel en vastzetten met 2% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten.
2. Verwijder fixatie-oplossing en grondig wassen 3 maal met PBS.
3. Voeg ten minste 10 ml vers 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) kleuroplossing (X-Gal voorraadoplossing [40 mg / ml in bereidingenDimethylformamide] 1:40 verdund in Basic kleuroplossing, pH 7,1 (zie tabel 1); bescherming tegen licht).
4. Leg een stuk gaas op de top van het zwembad long volledig houden in de oplossing en leg het deksel slechts losjes op de pot om de uitwisseling van lucht mogelijk te maken.
5. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3-5 uur beschermd tegen licht.
6. Verwijderen X-Gal oplossing eenmaal spoelen met PBS om resterende X-Gal oplossing (optioneel) verwijderen en 4% PFA voegen.

3. Visualisatie van lacZ-tagged gemetastaseerde tumorcellen in Lung Weefsel secties

1. Prefill een gelabelde inbedding mal tot 1/3 met onverdunde PolyFreeze inbedding medium. Zet de long kwab op de top en vullen met het inbedden van medium tot de lob is volledig bedekt. Probeer bellen te voorkomen.
2. Incubeer de geïntegreerde longen bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
3. Vervolgens bevriezen ingebed longen langzaam in een mengsel van droog ijs en isopentaan en bij -80 ° C.
4. Snijd 7 tot 10 micrometer cryohoofdstukken over een cryostaat en plak ze op SuperFrostPlus objectglaasjes.
5. Onmiddellijk Incubeer de secties met X-Gal kleuring oplossing bij 37 ° C gedurende 24 uur in een bevochtigde kamer.
6. Spoel de glaasjes in PBS 2 keer gedurende 5 minuten en vervolgens kort in gedestilleerd water.
7. Counter-vlek met nucleaire snel rood gedurende 10-30 seconden, spoel in gedestilleerd water en monteer de dia's met Immu-Mount.

4. Representatieve resultaten

Asai et al.. Vermeld in het oorspronkelijke artikel over de Dunn afgeleide LM8 OS muismodel sc primaire tumoren verkregen uit de parentale cellen Dunn, anders dan uit de zeer metastatische LM8 sub cellijn niet spontaan detecteerbare longmetastasen vormen in syngene C3H muizen ^14. Met de hier gerapporteerde technieken, we opnieuw onderzocht de vorming van uitzaaiingen in de Dunn/LM8 muis OS-modellen. We maakten gebruik van stabiele lacZ-getransduceerde Dunn en LM8 cels en van een protocol voor in-situ longperfusie en fixatie bij muizen. Representatieve beelden van geperfundeerde en niet-geperfundeerde longen van muizen subcutaan met lacZ-getransduceerde en niet-getransduceerde control Dunn en LM8 cellen worden getoond in Figuur 1. In muizen geïnjecteerd met controle cellen Dunn, macroscopische en microscopische metastasen bleef niet detecteerbaar in niet-geperfundeerde en geperfundeerde longen (Figuur 1A, i-iv). Maar interessant, in muizen geïnjecteerd met Dunn-lacZ cellen, X-gal kleuring toonde blauwe micrometastatische foci van losse cellen of kleine clusters cellen (<0,1 mm) op het oppervlak van niet-geperfundeerde longen (Figuur 1A, vi). In- situ perfusie en fixatie van de longen verbeterde de detecteerbaarheid van Dunn-lacZ micrometastasen (Figuur 1A, viii). Er werd echter uitgroei van macroscopische foci niet waargenomen (Figuur 1A, v, vii).

In muizen geïnjecteerd met controle cellen LM8, translucent, nauwelijks detecteerbare macrometastatic foci groter dan 0,1 mm in diameter werden opgenomen in niet-geperfundeerde longen (Figuur 1B, i). Perfusie van de long (figuur 1B, iii) verbeterde niet de detectie van de foci. Echter in muizen geïnjecteerd met LM8-lacZ cellen multiple X-Gal blauw gekleurd macro-(Figuur 1B, v) en micrometastasen (Figuur 1B, vi) werden gedetecteerd op het oppervlak van niet-geperfundeerde organen. Bovendien perfusie van de longen verbeterde de detecteerbaarheid van macro-en micrometastasen (fig. 1B, vii - viii). Bijgevolg micro-en macrometastases zichtbaar op een hogere dichtheid en een groter aantal, voornamelijk door de doorschijnendheid van de geperfuseerde weefsel waarin foci onder het orgaanoppervlak werd zichtbaar.

Een extra histological analyse met behulp van vriescoupes van longweefsel bevestigde de verbeterde detecteerbaarheid van longmetastasen bij muizen ingespoten met lacZ-getransduceerde Dunn en LM8 cellen. In muizen met tumoren verkregen uit primaire Dunn-lacZ of LM8-lacZ cellen werden tegenstelling tot muizen met primaire tumoren van het betreffende bedieningselement cellen micrometastasen of enkele cel foci opgenomen in longsecties (figuur 2). Bovendien macrometastases waren ook duidelijk zichtbaar in muizen geïnjecteerd met LM8-lacZ cellen dan in dieren geïnjecteerd met de controle LM8 cellen (figuur 2C, D).

Figuur 1. Detectie van spontane metastasen van niet-getransduceerde (i-iv) en lacZ-getransduceerde (v-viii) Dunn (A) en LM8 (B) cellen in niet-geperfundeerde (i, ii, v, vi) en geperfuseerd (iii, iv, vii, viii) longen in C3H muizen. Metastasen in representatieve X-Gal-staINED hele longen (v, vii in A en B) en respectieve close-ups (vi, viii in A en B) blauwe kleur. Macrometastatic foci (> 0,1 mm) in de organen van muizen geïnjecteerd met niet-gelabeld LM8 cellen (i-iv in B) zijn aangegeven door sterretjes. Plekken die in close-ups representatief zijn voor de gehele longen. Schaal balken geven 1 mm in beelden van hele longen en 0,1 mm in close-ups. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. Detectie van Dunn en LM8 micrometastasen in de longen vriescoupes. Delen van OCT ingebedde longweefsel werden geïncubeerd in X-gal kleuring oplossing bij 37 ° C gedurende 24 uur in een bevochtigde kamer en daarna tegengekleurd met kernechtrood rood. Pijlen wijzen naar micrometastatische foci opgenomen in longsecties van muizen geïnjecteerd met Dunn-lacZ (B) of LM8-lacZ cellen (D). Micrometastases bleef niet detecteerbaar in longsecties van muizen geïnjecteerd met niet-getransduceerde Dunn (A) of LM8 cellen (C). Scale balken geven 0,1 mm.

Discussie

De hier gepresenteerde resultaten in de muis Dunn/LM8 OS model tonen de kracht van de nieuw ingestelde methode die de X-Gal kleuring van lacZ-gelabeld tumorcellen met de in-situ perfusie / fixatie van longweefsel combineert. Deze combinatie van de twee technieken maakt hoge gevoelige detectie van micrometastatische laesies naar de enkele cel en verbetert de visualisatie van macrometastases de long (figuur 1) en in longsecties (figuur 2). Hoewel de X-Gal kleuring kan ook de detectie van (micro) metastasen in andere organen, in-situ perfusie / bevestiging verbetert de detecteerbaarheid van metastatische foci in andere weefsels dan de long lopen omdat de natuurlijke bloed-en weefsel-gerelateerde color Deze organen ^13. Zelfs als de perfusie wordt naar een ander orgaan, bijvoorbeeld de lever, de verwijdering van het bloed slechts gedeeltelijk verbeteren contrast betsen X-gal kleuring en de natuurlijke kleur van het orgel. De werkwijze is toepasbaar op elk type lacZ-gelabelde tumorcellen zal drastisch verbeteren van de detecteerbaarheid van longmetastase tot het niveau van de slapende eencellige micrometastasen en maakt een eenvoudige en betrouwbare kwantificering van macro-en micrometastasen. Een beperking van deze werkwijze en alle andere technieken die gebaseerd zijn op reportergenen, zoals luciferase en fluorescerende eiwitten, is de stabiliteit van de transgenexpressie. Zoals weergegeven in figuur 2d, niet alle tumorcellen in de macrometastatic foci blauw gekleurd, hetgeen een gebrek aan beta-galactosidase activiteit. Dit kan gerelateerd aan necrose, maar het is waarschijnlijk te wijten aan een verlies van transgenexpressie. We observeerden dat de Dunn en LM8 cellen zijn zeer effectief in de down-regulatie van lacZ en andere transgenen zelfs onder continue selectie voor expressie. Daarom geschakeld recente studies op de murine K12en K7M2 en de menselijke HOS, 143B en Saos-2 osteosarcoom cellijnen, die alle stabiele lacZ expressie gehandhaafd in vitro als in vivo tot 100% in de tijd.

Zodra stabiele lacZ-expressie gegarandeerd kan deze techniek worden toegepast in studies met gen-gemanipuleerde tumorcellen, bijvoorbeeld tot mechanistische onderzoeken proces van kolonisatie weefsel ^{13 alsmede} voor het ontwikkelen en testen van nieuwe therapieën gericht op uitroeiing van metastasen ^{15 , 16.} Verder kan het dienen als een benchmark voor de verbetering van de huidige radiologische beeldvormende technieken, zoals PET, (micro) CT en MRI, gebruikt voor de vroegtijdige opsporing van metastatische laesies. In een recente studie PET (niet gepubliceerd) met verschillende tracers nagegaan in vivo gedetecteerd longmetastasen vervolgens ex vivo met de beschreven protocol. In een lopende studie met een nieuwe kleine dieren micro-CT (SkyScan) zijn we tot nu toe able long metastasen op in vivo tot een grootte van 0,5 mm en ex vivo tot 0,3 mm, maar gericht op een resolutie van 0,1 mm. Interessant, dit is de maximale grootte die we onderscheiden macro-uit micrometastasen met de gecombineerde methode van in-situ perfusie en X-gal kleuring. Hieruit blijkt nogmaals de gevoeligheid en het nut van deze gemakkelijke en kosteneffectieve techniek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Narketan10 (ketamine)	Vetoquinol AG		100 mg / ml oplossing
Xylazin (xylazine)	Streuli Pharma AG		20 mg / ml oplossing
Prequilan (acepromazine)	Fatro SpA		10 mg / ml oplossing
Bulldog Type Serrefine vasculaire klem	Fine Science Tools	18.051-35	gebogen, 35 mm
Plastic beker met deksel	Semadeni	2988	25 ml bekers met deksels
5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); poeder	Axxora	ALX-582-002-G005	lossen in N, N-Di-methylformamide tot 40 mg / ml, store licht beschermd bij -20 ° C
Basic kleuroplossing, geëquilibreerd op pH 7,1, opgeslagen licht beschermd bij 4 ° C max. 1 maand	self-made		100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% natrium-deoxycholaat
PolyFreeze Embedding Medium	Polysciences; Zwitserse distributeur: Brunschwig	19.636-1
Inbedding schimmel	Polysciences	18646A-1
Leica CM1850 cryostaat	Leica Microsystems
SuperFrost dia's	Menzel	J1800AMNZ
Nuclear-Fast Red - Aluminium sulfaat-oplossing	Divisie Chroma Waldeck GmbH & Co KG distributor: Medite	84-0241-00
Immu-Mount	Thermo Electron, Zwitserse distributeur: Histocom	9990412