Method Article

Een eenvoudig protocol voor het extraheren van hemocyten van Wild Rupsen

DOI:

10.3791/4173

November 15th, 2012

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insect hemocyten voeren tal van belangrijke functies, zowel immune als niet-immune, in alle stadia van insecten ontwikkeling. Onze huidige kennis van hemocyte soorten en functie komt van studies over insecten genetische modellen. Hier presenteren we een methode voor het extraheren, het kwantificeren en visualiseren hemocyten van wilde rupsen.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insect hemocyten (gelijk aan zoogdieren witte bloedcellen) spelen een belangrijke rol in diverse fysiologische processen in het leven van een insect cyclus 1. In larvale stadia van insecten behorend tot de orde van de Lepidoptera (motten en vlinders) en Diptera (ware vliegen), worden hemocyten gevormd uit de lymfeklier (een gespecialiseerde hematopoietische orgel) of embryonale cellen en kan worden uitgevoerd door middel van het volwassen stadium. Embryonale hemocyten zijn betrokken bij celmigratie gedurende de ontwikkeling en chemotaxis regelgeving tijdens de ontsteking. Zij nemen ook deel in cel apoptose en zijn essentieel voor embryogenese 2. Hemocyten bemiddelen de cellulaire arm van het insect aangeboren immuunrespons die verschillende functies, zoals celspreiding, cel aggregatie, vorming van nodules, fagocytose en inkapseling van indringers 3 omvat. Zij zijn ook verantwoordelijk voor het orkestreren specifieke humorale afweer insect tijdens infectie, zoals de productie van antimicrobiële peptiden en andere effectormoleculen 4, 5. Hemocyte morfologie en functie zijn voornamelijk bestudeerd in genetische of fysiologische insect modellen, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster 6, 7, de muggen Aedes aegypti en Anopheles gambiae 8, 9 en de tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. Er is echter weinig informatie bestaat momenteel over de diversiteit, classificatie, morfologie en functie van hemocyten in niet-model insectensoorten, met name die uit het wild gehaald 12.

Hier beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor de extractie van hemocyten van wilde rupsen. We gebruiken voorlaatste instar Lithacodes Fasciola (geel-schouders slug mot) (figuur 1) en Euclea delphinii (spiny eiken slug) rupsen (Lepidoptera: Limacodidae) en laten zien dat er voldoende hoeveelheden hemolymfe (insect bloed)kan worden geïsoleerd en hemocyte aantal getelde van individuele larven. Deze methode kan worden gebruikt om efficiënt onderzoeken hemocyte types in deze soorten en in andere lepidoptera rupsen geoogst van het veld, of het kan eenvoudig worden gecombineerd met immunologische assays ontworpen hemocyte functie onderzoeken na infectie met bacteriën of parasitaire organismen 13.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Materiaal Voorbereiding

  1. Bereid naalden (1-2 micrometer tip en 3-4 mm conus) van borosilicaatglas capillaire buizen en een micropipet trekker. Instrument instellingen: helling: 561; snelheid: 20; warmte: 560; vertraging: 1; pull: 100; druk: 500.
  2. Bereid de verzameling oplossing: 60% Medium Grace's (GM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 20% antistollingsmiddel buffer (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA en 41 mM citroenzuur, pH 4,5 ). De bovenstaande oplossing wordt vers bereid onder steriele omstandigheden en op ijs gehouden te allen tijde.
  3. Bereid de incubatiebuffer oplossing: 90% van GM aangevuld met 10% van FBS. Dez....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier beschreven staat de inzameling toe van een minimaal volume van 10-20 ul van insecten hemolymfe van individuele rupsen. Hemocyten verzameld via deze werkwijze zijn vrij van cellen klonteren, melanisatie gebreken weefsel vuil of andere verontreinigingen. Daarom hemocyten gemakkelijk kunnen worden waargenomen en geteld onder de microscoop en diverse insecten kunnen worden waargenomen binnen een paar Hosur. We hebben waargenomen dat de meeste hemocyten in onze monsters bestonden uit plasmatocytes 3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Werkwijzen voor het extraheren van hemocyten medisch belangrijke lepidoptera insecten en insecten model eerder gemeld 9, 14. Hemocyte extractie zijn aangepast op basis van de insectensoorten, de ontwikkelingsfase van het insect en de morfologische kenmerken. Zo kan hemolymfe isolatie van Manduca larven gemakkelijk worden uitgevoerd door knippen de gebogen hoorn het einde van de buik 15. Omdat slug rupsen (Limacodidae) missen deze buik structuur, hebben we een aparte protocol voor hemolymfe.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TMS werd gesteund door de Harlan Trust Fellowship (GWU) tijdens deze studie. Financiering voor veld verzamelen en kweken van L. Fasciola en E. delphinii werd verstrekt door NSF subsidie ​​DEB 0642438 naar JTL.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer Reacties
Micropipet trekker Sutter Instrumenten P-1000
Borosilicaatglas buizen Sutter Instrumenten B100-50-10 OD: 1,0, ID: 0,50 mm
Grace's Medium Sigma G8142
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH3007102 Hitte geïnactiveerd
Dumont # 5 Forceps Fine Science Tools 11.252-40
Neubauer hemocytometer Hausser Wetenschappelijke 3200
Plastic Tubing Tri-Tech TT-3-32OD OD: 3/32'', ID: 1/32 '
Glas medische spuit Fortuna Optima D-97877 50 ml volume
Stomp uiteinde naald Kleine onderdelen NE-162PL-25 16 Gauge x 1 "lengte

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).
  2. Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemocyte ExtractionCaterpillar HemolymphInsect Immune ResponseHemocytometer CountingAnesthetizing CaterpillarsShallow Incision TechniqueBuffer Solution InjectionHemolymph CollectionWild Caterpillar AnalysisCellular Immune Assays

Related Articles