Ondanks de uitstekende mechanische en biochemische eigenschappen van spin zijde, kan dit materiaal worden geoogst in grote hoeveelheden op conventionele wijze. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om kunstmatige spinnenzijde vezels, die is een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen van spinnenzijde productie en het gebruik ervan als next-generation biomaterialen te laten draaien.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Naarmate de samenleving vordert en de middelen schaarser worden, wordt het steeds belangrijker om nieuwe technologieën te ontwikkelen die ingenieur volgende generatie biomaterialen met een hoge prestatie-eigenschappen. De ontwikkeling van deze nieuwe structurele materialen moet snel, kostenefficiënt en te betrekken verwerking van methoden en producten die milieuvriendelijk en duurzaam. Spinnen spinnen een veelheid van verschillende soorten vezels met verschillende mechanische eigenschappen en biedt een rijke bron van de volgende generatie technische materialen voor biomimicry die wedijveren met de beste door de mens veroorzaakte en natuurlijke materialen. Omdat het verzamelen van grote hoeveelheden natuurlijke spindraad is onpraktisch, synthetische productie van zijde heeft het vermogen om wetenschappers te voorzien van toegang tot een onbeperkt aanbod van draden. Daarom, als de draaiende proces kan worden gestroomlijnd en geperfectioneerd, kunstmatige spin vezels hebben het potentieel gebruik voor een breed scala aan toepassingen, variërend van kogelvrije kleding, chirurgische hechtingens, touwen en kabels, banden, snaren voor muziekinstrumenten, en composieten voor lucht-en ruimtevaart technologie. Met het oog op de synthetische zijde productieproces te bevorderen en de vezels die lage variantie weer te geven in hun materiële eigenschappen van draai te draaien geven, ontwikkelden we een natspinnen protocol dat de expressie van recombinante spindraad eiwitten in bacteriën, zuivering en concentratie van de eiwitten integreert , gevolgd door extrusie vezels een mechanische na rotatie behandeling. Dit is de eerste visuele voorstelling dat een stap-voor-stap proces openbaart te spinnen en te analyseren kunstzijde vezels op laboratoriumschaal. Het biedt ook gegevens aan het minimaliseren van de invoering van de variabiliteit onder vezels gesponnen uit dezelfde draaiende dope. Gezamenlijk zullen deze methoden voort te bewegen het proces van kunstzijde de productie, wat leidt tot hogere kwaliteit vezels die de natuurlijke spin zijde overtreffen.
Inleiding
Spider zijde heeft een buitengewone mechanische eigenschappen die uit voert een aantal door de mens gemaakte materialen, waaronder staal met hoge treksterkte, Kevlar en Nylon. 1 Spiders draaien minimaal 6-7 verschillende soorten vezels, dat diverse mechanische eigenschappen weer te geven, elk ontworpen met verschillende hoeveelheden van de treksterkte en uitbreidbaarheid om specifieke biologische taken uit te voeren. 2 Onderzoek wetenschappers in hoog tempo het nastreven van het gebruik van de spin zijde als de volgende generatie biomaterialen omwille van hun uitstekende mechanische eigenschappen, hun biocompatibiliteit, en hun niet-toxisch en groen-materiële aard. 3,4 Vanwege de kannibalistisch en giftige karakter van de spinachtigen, oogsten spin zijde door de landbouw is niet een praktische strategie om aan de eisen die noodzakelijk zijn voor industriële schaal productie te voldoen. Daarom hebben onderzoekers zich tot de productie van recombinante eiwitten zijde in transgene organismen gekoppeld met vitro spinnen van kunstvezels dese gezuiverde eiwitten. 5-8 Expressie van volledige lengte recombinante spinnenzijde eiwitten is technisch moeilijk gezien de intrinsieke eigenschappen van hun gen-sequenties, die hun zeer repetitief karakter en de fysieke lengtes (> 15 kb) omvatten, GC-rijke inhoud en tendentieuze alanine en glycine codongebruik. 9-11 Tot op heden hebben de meeste labo's gericht op het uiten afgeknotte vormen van de belangrijkste ampullate zijde proteïnen MaSp1 of MASP2 met behulp van partiële cDNA sequenties of synthetische genen. 12-15 Spinning synthetische spin zijde is een uitdagend proces dat vereist beheersing en kennis van verschillende wetenschappelijke disciplines, en de fijne kneepjes van het draaien, niet zijn volledig geopenbaard aan het grote publiek door video vertegenwoordiging. In feite is slechts een handvol van laboratoria over de hele wereld hebben de expertise om de spin zijde cDNA's uit te drukken, te zuiveren van de zijde proteïnen, spin synthetische vezels en voer de post-spin tekenen, en dan uiteindelijk testen hun biomateriaal eigenschappen. 8,16,17 Verschillende benaderingen voor het spinnen van synthetische vezels zijn omgeven natte en droge spinnen en electrospinning methoden 16,18,19 Alle procedures hebben een doel gemeen -. Ontwikkeling van een protocol dat synthetische spinnenzijde produceert met mechanische eigenschappen die rivaal natuurlijke onderwerpen die voor grootschalige commerciële productie processen.
Hier beschrijven we de procedure om kunstmatige spin zijde op laboratorium schaal met behulp van een natspinnen methodiek te genereren. Ten opzichte van andere spinnen methoden, heeft natspinnen geproduceerd de meest consistente resultaten voor vezels analyse. Wij beschrijven deze procedure begint met de expressie van de recombinant eiwitten zijde in bacteriën, gevolgd door zuivering ervan, en een beschrijving van de eiwitpreparaat stappen voor het spinnen met een post-spin draw methode toegepast op "zo gesponnen" vezels draden oplevert met eigenschappen van het materiaal dat de kwaliteit van de natuurlijke spin zijde te benaderen. Onze methodologischey is ontworpen om de voet na te bootsen de natuurlijke spinproces van zijde vezels en het trekt een zware wissel op onze kennis van de architectuur en de functie van de zijde-producerende klieren van bol-en cob-weven spinnen. 20-22 Verder sluiten we af met de nodige stappen van de materiaaleigenschappen van de synthetische vezels met een tensometer stress-rek krommen, waardoor onderzoekers de uiteindelijke sterkte, uiteindelijke spanning en taaiheid van vezels berekenen uitzetten bepalen. Ten slotte, maar van aanzienlijke waarde, kan de spinnen, wikkelen, en tekenen apparaten thuis te zijn gebouwd met behulp van commercieel verkrijgbare onderdelen, in plaats van de aankoop van ingewikkelde en kostbare apparatuur op maat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Grafische Overzicht: Biomimicry van het spinproces
Biomimicry van de natuurlijke spindraad Traject voor de productie:. Een route naar synthetische zijde produceren Deze afbeelding toont de belangrijkste ampullate klier uit de gouden bol wever, Nephila clavipes, en de componenten gebruikt voor natuurlijke zijde productie (witte tekst). De staart regio synthetiseert grote hoeveelheden van zijde eiwitten die worden vervoerd naar de ampulla, een opslaggebied voor de spinnen dope. Deze geconcentreerde dope is geëxtrudeerd door de draaiende buis waar de oplossing ervaart ion-uitwisseling en uitdroging voorafgaand aan de vezels extrusie. De biomimetische processen in ons laboratorium worden aangegeven door de rode tekst. Recombinant zijde productie komt transgene bacteriën, gevolgd door zuivering van eiwitten met behulp van chromatografie. Vervolgens wordt het gezuiverde eiwit subonderworpen aan vriesdrogen om het materiaal te concentreren. Tenslotte wordt het eiwit opnieuw opgelost in HFIP en geëxtrudeerd uit een naald in een isopropanol bad.
1. Plasmide Bouw en bacteriële cel Cultuur Voorbereiding
- Voer PCR met behulp van de gewenste spinnenzijde cDNA en specifieke primer sets. Gel-extract en ligeren het versterkte cDNA in een prokaryotische expressie-vector bijvoorbeeld pBAD / TOPO ThioFusion (Fig. 1A). Deze vector heeft een N-terminale thioredoxine tag eiwit zijde oplosbaar en een C-terminaal 6x His-tag voor eiwitzuivering vergemakkelijken. Transformeer de ligatieproducten in competente E. coli-cellen.
- Kies kolonies dat de recombinante klonen vector bevatten en gebruiken kolonie 200 ml steriele LB aangevuld met ampicilline (Fig. 1B) te inoculeren. Groei deze cultuur nachts verzadigd door schudden met 200 tpm in een orbitale incubator bij 37 ° C.
- Combineer de 200 ml saturated cultuur met 800 ml vers LB cultuur. Laten spinnenzijde eiwitexpressie 4 uur door toevoeging 0,2% arabinose (w / v). Zorg ervoor dat de cultuur te houden onder antibiotische selectie.
- Pellet de cellen bij 16.000 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C (Fig. 1C). Voor de eenvoud pellet het gehele volume een container. Meerdere centrifugeren stappen nodig zijn, afhankelijk van de hoeveelheid capaciteit van de centrifugatie buizen. Indien nodig, decanteren het vloeistofvolume na centrifugeren en opnieuw pellet extra materiaal voor de gehele cel pellet in een container te verzekeren. Celpellets kan worden bewaard bij -80 ° C tot nodig.
- Voor het weggooien van de uitgegeven cultuur media, toe te voegen bleekmiddel of autoclaaf te steriliseren.
2. Cell Lysis
- Voeg 20 ml lysisbuffer 1x de 1 L celpellet (Fig. 2A). Zorg ervoor dat u volledig resuspendeer de celpellet.
- Voeg lysozym tot een concentratie van 1 mg / ml verder te bevorderencellysis. DNase kunnen ook worden toegevoegd in deze stap op chromosomaal DNA verwerken om de viscositeit van de oplossing te verminderen. Het monster wordt op een rondschudapparaat en schud gedurende 20 minuten.
- Ultrasone trillingen de oplossing maximaal 1 minuut.
- Aan de oplossing, centrifuge bij 16.000 xg te verduidelijken gedurende 10 minuten bij 4 ° C (Fig. 2B).
3. Protein Purification: Ni-NTA Affinity kolomchromatografie
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en breng deze in een schone 25 ml chromatografiekolom. Zorg ervoor dat de supernatant is niet-viskeus en duidelijk. Als de oplossing viskeus en bewolkt, voeg meer DNase of met ultrasone trillingen en / of re-pellet het supernatant (herhaal de stappen +2,3 tot +2,4).
- Voeg 1 ml Ni-NTA slurry (0,5 ml beads) in de kolom. Stevig vast de dop en kraan, en vervolgens op een rocker in evenwicht gedurende 1 uur, om het binden van de 6x His-tag aan de Ni-NTA kralen (fig. 3A).
- Rechtop Stel de kolom op eenstaan en laat de Ni-NTA kralen om zich te vestigen voor ongeveer 2 minuten. Een lichtblauwe laag is te zien aan de onderkant als de kralen volledig afgewikkeld.
- Verwijder de dop en laat de oplossing stromen door de kraan. Verzamelen deze oplossing voor verdere analyse (Fig. 3B).
- Voeg 20 ml 1x wasbuffer en laat de kralen om zich te vestigen. Open de kraan en laat de oplossing stromen. Verzamelen deze oplossing in vier 5 ml porties voor verdere analyse Opmerking: Extra wassen hoeveelheden kunnen worden gebruikt om contaminerende eiwitten verminderen, maar er is een mogelijkheid een afname in de uiteindelijke eiwitrendement..
- Voeg 20 ml 1x elutiebuffer en laat de hars om zich te vestigen. Open de kraan en laat de oplossing stromen. Verzamel deze oplossing in vier aliquots van 5 ml voor verdere analyse. Opmerking: Extra elutie volumes kunnen worden afgehaald bij de Ni-NTA-hars als de elutie niet is voltooid.
- Monsters worden opgeslagen in 4° C of -80 ° C voor korte-of lange termijn opslag, respectievelijk.
- Grootte-fractioneren van de monsters met behulp van SDS-PAGE-analyse. Visualiseren eiwitten met zilver of Coomassie Brilliant Blue R-250 (fig. 3C). Alleen zuivere fracties worden gebruikt voor de volgende stappen. Opmerking: Western blot analyse kan worden gebruikt om de identiteit van het gezuiverde eiwit bevestigen.
4. Dialyse en vriesdrogen
- Dialyze de monsters tegen althans 100x het monstervolume (gebruik gedeïoniseerd water) gedurende 2 dagen. Wijzigen water oplossing om de 6 uur alle zouten te verwijderen. Opmerking: Het molecuulgewicht grootte cut-off van de dialysebuis afhankelijk van de grootte van het recombinante eiwit zijde.
- Weeg zes 1,5 ml leeg microcentrifuge buizen en opnemen van hun massa's. Het kan nuttig te prikken van gaatjes of sleuven kappen van de buizen voor het wegen van vriesdrogen aan lyofilisatie vergemakkelijken (Fig. 4A).
- After dialyse, Breng 1 ml van de gedialyseerd monster in elk van de 6 vooraf gewogen microcentrifuge buizen (Fig. 4B). Flash bevriezen met vloeibare stikstof en droog de monsters beneden met een vriesdroger (fig. 4C).
- Na droging overdragen een 1 ml van de dialyse monster in elk van de zes pijpen. Herhaal dit tot de hele dialyse monster is gedroogd in de microfuge buizen.
- Gevriesdroogde monsters worden opgeslagen bij -80 ° C voor langdurige opslag.
5. Spinning Dope Voorbereiding
- Weeg elk van de microfugebuizen buizen met de gedroogde eiwit poeder. Trek de aanvankelijke massa van de lege buizen aan de totale droge eiwit massa te bereiken. Opmerking: Afhankelijk van eiwitrendement, moet u mogelijk extra materiaal te zuiveren voor het spinnen proces.
- Bereken het volume hexafluorisopropanol (HFIP) toegevoegd aan elke buis 200 mg / ml tot 500 mg / ml of 20% tot 50% gewicht per volume te verkrijgen. Voeg de daarvoor bestemdeaten hoeveelheid HFIP in elke buis (afb. 4D). Opmerking: HFIP is zeer vluchtig en giftig, pipet zorgvuldig en klap op de vuurpijl de buis zo snel mogelijk. HFIP dienen te worden behandeld onder een beschermkap.
- Parafilm de buizen en leg ze op een rocker aan het eiwit oplosbaar te maken. Vortex en centrifuge af te oplosbaar vergemakkelijken. Dit kan tot 2 dagen.
6. Spuit Voorbereiding en Apparatuur Setup
- Plaats ten minste 25 pi van de opgeloste draaiende dope in de injectiespuit. Zorg ervoor dat er geen aggregaten te presenteren als het kan de spuit verstopt raken. Opmerking: Dit monster is ongelooflijk stroperig, dus neem voorzichtig bij het pipetteren.
- Duw de dope naar de voorkant van de spuit verticaal, het verwijderen van alle luchtbellen (afb. 5A). Opmerking: Luchtbellen leiden tot inconsistenties in de vezel.
- Zet de spuit op de pomp. Hef een bekerglas van 400 ml gevuld met 95% isopropanol op, zodat de punt van de spuitwordt slechts het breken van de oppervlakte van de alcohol (Fig. 5B).
- Zet de spuit pomp tot 15 pL / min en start het programma. Laat de zo gesponnen vezels in de isopropanol zitten 20 minuten om evenwicht. Opmerking: Deze vezels kunnen nog door MS / MS-analyse om de identiteit van de eiwitten bevestigen de vezels.
7. Post-spin-Draw en Monstername
- Pas dubbelzijdige plakband op beide zijden van de kam aan de wachtrij apparaat. De spooling apparaat is gemaakt van lijmen metalen kammen met een digitale schuifmaat (fig. 6A). Bevestig de spooling apparaat aan op een motor (Fig. 6B). Wij raden spoolen de draden op 2 toeren per minuut. Opmerking: sneller spooling tarieven resulteren in grote hoeveelheden van variatie in vezel kwaliteit en reproduceerbaarheid.
- Behulp van een tang zacht pak een uiteinde van de vezel en trek het uit de isopropanol, verbonden aan de rand van een van de kam armen op de spoel (Fig. 6C). De volgende stappen moeten worden gedaan zonder een onderbreking om de vezels niet uitdroogt.
- Zet de motor en voorzichtig de vezel te leiden naar het in de wachtrij apparaat. Opmerking: Tijdens de wachtrij plaatsen, staan niet toe dat de vezel te verdubbelen en op elkaar te stapelen.
- Zodra de gehele vezel wordt gespoold, maak de spoel van de motor en breng lijm aan op de rand van elke zijde vezel op de dubbelzijdige tape (Fig. 6D). Dit vastgemaakt de spin zijde op het apparaat. Opmerking: Door de lijm aan de dubbelzijdige plakband voor na rotatie tekening, dat de gehele vezel wegglijden en maakt selectieve rekken van de inwendige segmenten van de vezels in de klauw armen.
- Sluit de spoel de lineaire actuator (Fig. 7A). Neem de initiële lengte van de vezels met behulp van de dikte Merk op dat dit de inwendige lengte van de vezel. Niet gelijmd zijn lengte gewikkeld arond de spoel.
- Laat de spoel in een 75% isopropanol bad. De vezels in evenwicht 10 minuten. Opmerking: Andere dehydratatie oplossingen kunnen gebruikt worden voor het spinproces, zoals methanol, aceton en ammoniumsulfaat.
- Stel de lineaire actuator snelheid tot 1,5 mm / sec. Op basis van de aanvankelijke lengte, berekenen de uiteindelijke lengte van de gewenste na spinverstrekking. Uitgerekt het bedrag kan worden geregeld op basis van de snelheid of de lengte afhankelijk van de opstelling. Bijvoorbeeld, met een beginlengte van 15 mm en een gewenste na rotatie strekverhouding van 3x dient de uiteindelijke lengte 45 mm. Dit kan ook worden berekend aandrijven van de lineaire actuator 20 seconden met een snelheid van 1,5 mm / sec.
- Als de gewenste functie spin-loting is voltooid, langzaam verhogen van de spoel uit het isopropanol. Laat de druppels van isopropanol te drogen gedurende 1 minuut en verzamelen monsters (Fig. 7B). De monsters moeten worden gemonteerd op karton of folie frames voor het testen van PURposes.
- Als verdere post spin-loting ratio's gewenst zijn, verlagen de spoel terug in de 75% isopropanol bad. De vezels equilibreren 10 minuten en vervolgens de volgende post spinverstrekking gaan.
8. Trekproeven
- Het verzamelde monsters tot de standaard laboratorium milieu equilibreren ten minste 1 uur voor mechanische testen. De luchtvochtigheid en temperatuur moet worden als ze kunnen de vezels de mechanische eigenschappen. Standaard vochtigheid en temperatuur moeten ongeveer 40% en 25 ° C respectievelijk,.
- Lijm de randen van de kaarten of folie op de vezel op de houder vast. Let op de grootte van de opening van het frame. Dit is de initiële lengte van het geteste vezels. A 1 inch (25,4 mm) opening frame hier (Fig. 8A).
- Behulp van een lichtmicroscoop met een of meer 100x vergroot, nemen diameter metingen de lengterichting vezelas.Ten minste 3 metingen moet worden geregistreerd. Hoe hoger de vergroting gebruikt en meer metingen, hoe nauwkeuriger.
- Bevestig het frame aan een tensometer mechanische belasting frame (afb. 8B). Snij het frame aan beide zijden, zodat de spanning slechts doorheen de vezel. Tarra de tensometer en het verzamelen van de gegevens. Een standaard stam van 2% per seconde.
- Met behulp van de verzamelde gegevens en de gemiddelde diameter, kan een stress-rek curve worden uitgezet.
- De gebroken vezel kan nu worden gemonteerd op een scanning elektronenmicroscoop (SEM) aansluiting voor morfologische analyses en breekpunt diameter metingen. De vezel segment vanaf het knikpunt worden gebruikt voor het schatten en controleren van de eerste diameter gemeten door de lichtmicroscoop.
9. Representatieve resultaten
Van stap 3, dienen de verschillende fracties worden geanalyseerd door SDS-PAGE analyse en eiwitten gevisualiseerd met zilverof Coomassie Brilliant Blue R-250. Van een standaard Ni-NTA kolom omstandigheden kan elutie fracties met> 90% zuiverheid worden verkregen (Fig. 9). Kleine contaminerende eiwitten kunnen verder worden verwijderd door dialyse uitgebreid. Met 25 pl spinnen dope 20% (w / v), kan tenminste 30 afzonderlijke vezels monsters verzameld uit de continue wond vezel op de spoel (uitgegaan van een beginlengte van 13 mm wordt gebruikt). De mechanische eigenschappen kunnen worden geanalyseerd tensometer tests (Fig. 10). Afhankelijk van de recombinant eiwit zijde voor het spinproces, dan de maximale na rotatie strekverhouding moeten empirisch worden bepaald. In het algemeen, plaatsen spin-trekken ratio's van 4,0 x kan worden bereikt zonder vezels falen (afb. 10). Gesponnen vezels vóór of nà centrifugeren draw kan worden geanalyseerd met een scannende elektronenmicroscoop de ultrastructuur visualiseren (Fig. 11A, B). Gesponnen vezels kan ook worden gebruikt voor mechanische testen tonen resultatendat met geringe variatie in een bericht spinverstrekking steekproef (Fig. 10).
Figuur 1. Expressie van de spindraad cDNA in bacteriën. A) De pBAD TOPO / Thio vector die de spin zijde cDNA van belang is getransformeerd in competente E. coli-cellen. B) een kolonie wordt geënt in 200 ml LB en gekweekt tot verzadiging nacht. Na inenting, ligt op 800 ml vers LB toegevoegd en de cultuur wordt veroorzaakt voor expressie met behulp van arabinose. C) Aan het einde van inductie, de cultuur is gepelleteerd door centrifugeren. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Lysis van bacteriële cellen na spinnenzijde eiwit inductie. A) Twintig milliliters van 1x lysisbuffer en DNase toegevoegd aan de celpellet en geplaatst op een schudapparaat en gesonificeerd de cellen lyseren. B) De cel lysaat wordt gesponnen in een centrifuge om het supernatant van cellulaire puin te ruimen, en het supernatant wordt verzameld. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Zuivering van spindraad recombinante eiwitten met behulp van affiniteitschromatografie. A) Het cellysaat supernatant en Ni-NTA korrels worden toegevoegd aan een chromatografiekolom en gedurende 1 uur. B) na het doorstroomsysteem zijn verzameld, worden 20 ml wasbuffer en 20 ml elutiebuffer in volgorde en verzameld in 5 ml fracties. C) De verschillende fracties worden geanalyseerd door SDS-PAGE, de zuivere monsters die het doeleiwit worden overgebracht naar een dialysezak en gedialyseerd tegen DI watervoltooiing. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Voorbereiding van het gezuiverde spindraad eiwit voor natspinnen. A) Het gedialyseerde product wordt overgedragen naar vooraf gewogen centrifugebuizen in 1 ml fracties. B) De 1 ml fracties zijn knipperen bevroren met vloeibare stikstof. C) De bevroren monsters gevriesdroogd en dialyse monster wordt toegevoegd. D) Gedroogde massa wordt berekend en HFIP toegevoegd aan de poeder met 20% (w / v) spinnen dope produceren. klik hier grotere figuur zien .
Figuur 5. Het laden van de draaiende dope in het glas spuit voor natspinnen. A) Terwijl u de syringe verticaal wordt het spinnen dope geduwd naar de top van de injectiespuit kolom luchtbelletjes verwijderd. B) Het beladen spuit is aan de injectiespuit pomp verlaagd in de 95% isopropanol bad zodat de punt is slechts breken het oppervlak van het bad.
Figuur 6. Spoolen van de synthetische spindraad vezels op een custom afgehaspeld apparaat. A) De spooling apparaat is opgebouwd uit een digitale schuifmaat met aangehechte metalen kammen. Dubbelzijdige plakband wordt aangebracht op beide zijden van de kam naar de vezeluiteinden bevestigen. B) De spoel wordt aan de langzame motor met een krokodilklem. C) De vezel wordt langzaam getrokken van de alcohol bad en gewikkeld rond de spoel. D) Lijm wordt toegevoerd aan de rand van elke vezel segmenten te houden op hun plaats. Getoond zijn twee verschillende vezels gesponnen uit verschillende eiwitten.
Figuur 7. Post-spin te trekken van de synthetische vezels met behulp van een zelfgemaakte apparatuur. A) De spooling apparaat is aangesloten op de lineaire aandrijving setup met alligator clips. B) Na een post rotatie draw stap wordt de spoel opgetild het bad. Isopropanol druppels mogen verdampen voordat vezels collectie.
Figuur 8. Monteren van de synthetische vezels zijde op een karton voor mechanische studies. A) verzamelde vezels zijn gemonteerd op karton frames met 1 "x 1" uitsparing. De vezels worden in eerste instantie op hun plaats gehouden met dubbelzijdige tape, en dan vast met lijm. B) De kaarten frame is bevestigd op een tensometer. De zijkanten worden dan geknipt, zodat de spanning en draait alleen maar de vezel.
Figuur 9. Maat fractionering van gezuiverde recombinante MaSp1 protein fracties met behulp van SDS-PAGE-analyse gevolgd door een visualisatie met zilverkleuring. Eiwit ladder is weergegeven in kDa. De twee spoelmonsters tonen niet-specifieke binding aan de korrels, terwijl de monsters elutie het nodig blijken 6 collecties totaal eiwit herstel te garanderen.
Figuur 10. Stress rek kromme van vezels gesponnen uit recombinante eiwitten TuSp1. 8 Kleuren zien vezels die werden onderworpen aan verschillende spin-bericht gelijkspel ratio's, variërend van 2,5 x tot 6x. Vezels tonen geringe variatie in de verhouding groep als na rotatie strekverhouding verhoging van de sterkte van de vezel wordt verhoogd terwijl plasticiteit wordt verlaagd.
Figuur 11. Scanning elektron microscopie beelden van vezels gesponnen uit recombinant TuSp1 eiwitten. A) Bij 500x vergroting, de goede externeoppervlak zichtbaar. B) op 5000x, kan de dichte interieur kern in acht worden genomen van een natuurlijke pauze van vezels.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Synthetische vezels gesponnen van deze methode zijn mechanisch op dezelfde orde van grootte vergeleken met de natuurlijke vezels. Door het verminderen van de hoeveelheid van menselijke fouten door mechanisatie van het in de wachtrij en na de spin-loting processen, de experimentele variatie tussen monsters zijn meer gecontroleerd en sterk verminderd.
Onze methodologie biedt het potentieel om de mechanische eigenschappen van andere vezels die worden gesponnen uit recombinante eiwitten gecodeer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NSF RUI Subsidies MCB-0950372 en de DMR-1105310 getiteld "moleculaire karakterisering van Black Widow Spider zijde en mechanisch gedrag van Spider Glue Silks," respectievelijk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens / Equipment | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| pBAD / TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| Fastbreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Inclusief instructies voor buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| Freezone vriesdroger | Labconco | 7960041 | Freezone 12Plus |
| Hexafluorisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Injectiespuit | Hamilton | 7657-01 | 250 pi |
| Naald | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt einde verwisselbare naald |
| Spuitpomp | Harvard Apparatuur | 702208 | 11Plus |
| Digitale schuifmaat | Carrera | CP5906 | 0-150 mm bereik |
| Roestvrij staal tang | Wereld Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont # M5S |
| Motor | Natuur Mill | 7090529 | 12VDC, 2 toerental |
| Lineaire actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch aanbod |
| Het ontleden van microscoop | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digitale MicroscOpe camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas schaar | Wereld Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Wetenschappelijk | 310C | 5N Dual-Mode-systeem |
Referenties
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382(2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
