Flowcytometrie gebaseerde Zuivering van<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoten

Samenvatting

Om zygoten van zuiveren S. cerevisiae Werden haploïde cellen van tegengestelde mating type gemanipuleerd om rood of groen fluorescerende eiwitten, co-geïncubeerd tot zygote vorming mogelijk te maken en gefractioneerd met een flowcytometrie-based protocol drukken. De zeer verrijkte fractie maakt daaropvolgende "-sche" studies, het herstel van de initiële nakomelingen, en systematisch onderzoek van de zygote morfogenese.

Samenvatting

Zygoten zijn essentiële tussenproducten tussen haploïde en diploïde staten in de levenscyclus van veel organismen, met inbegrip van gist (figuur ¹⁾ 1. S. cerevisiae zygoten resultaat van de fusie van haploïde cellen van verschillende mating type (MATa, MATalpha) en leiden tot overeenkomstige stabiele diploïde die achtereenvolgens genereren liefst 20 diploïde nakomelingen als gevolg van hun opvallend asymmetrische mitotische delingen ^2. Zygote vorming georkestreerd door een complexe reeks gebeurtenissen: Hierbij oplosbare mating factoren binden aan receptoren verwant, triggering receptor-gemedieerde signaaltransductie cascades die onderbreking van de celcyclus en uitmonden vergemakkelijken cel-cel fusie. Zygoten kan worden beschouwd als een model van voorlopercellen of stamcellen functie.

Hoewel er veel is geleerd over de vorming van zygoten en hoewel zygoten zijn gebruikt om cel-moleculaire aangelegenheden van algemeen signi onderzoekenicance, bijna alle studies hebben gebruik gemaakt van de paring mengsels waarin zygoten worden vermengd met een meerderheid van de bevolking van de haploïde cellen ^3-8. Veel aspecten van de biochemie van zygote vorming en de voortgaande leven van de zygote blijven dan ook niet onderzocht.

Rapporten van zuivering van gist zygoten beschreven protocollen gebaseerd op hun sedimentatie eigenschappen ^9, maar dit sedimentatie gebaseerde procedure leverde geen bijna 90% zuiverheid in handen. Bovendien heeft het nadeel dat cellen blootgesteld aan hypertone sorbitol. Wij hebben een veelzijdig zuiveringsprocedure. Daartoe paren haploïde cellen die rood of groen fluorescerende eiwitten werden geco-incubeerd met zygote vorming geoogst op verschillende tijdstippen, en de resulterende zygoten werden gezuiverd met een flow cytometrie gebaseerd sorteren protocol. Deze techniek biedt een handige visuele beoordeling van zuiverheid en rijping. De gemiddelde zuiverheidvan de fractie ongeveer 90%. Volgens de timing van de oogst, kan zygoten van verschillende graden van rijpheid worden hersteld. De gezuiverde monsters zorgen voor een geschikt punt van vertrek voor "-sche" studies, voor het herstel van de initiële nakomelingen, en voor systematisch onderzoek van deze stamceltransplantatie.

Protocol

1. Haploïde Cell Growth

1. Grow S. cerevisiae cellen van de S288C achtergrond (BY4741) onder standaard condities ^10.
2. Transformeer haploiden om ofwel drukken van de twee opvallende fluorescerende markers ^10. De markers keuze oplosbaar GFP expressie in het cytoplasma (pEG220, URA3/YIp, gelineariseerd met BglII ¹¹⁾ en een ribosomaal eiwit, RPL25, gefuseerd met mCherry (pAJ1661, URA3/CEN van A. Johnston). We verwachten dat gelijke tweekleurige zuivering protocollen kunnen het gebruik van andere heldere fluorescente eiwitten die worden gesynthetiseerd door de ouderlijke haploïde cellen. Als alternatief kan de celwand worden gelabeld met fluorescente lectinen.
3. Op de dag voorafgaande zygote zuivering inoculeren 5 ml cultures van elk celtype en groeien ze onder schudden overnacht bij 23 ° C te bereiken A600 niet meer dan 1,0. GFP groeien transformanten (ATY4442) in volledig synthetische medium dat 2% glucose (CSM-glucose) and RPL25-mCherry transformanten (ATY4552) in synthetische selectieve medium zonder uracil ^10. Handhaven parallelle culturen van elk celtype onder schudden bij kamertemperatuur.

2. Het uitvoeren van een kruis

1. Stel de optische dichtheid (A600) van elk monster tot 1,0 in vers medium. [1 Optische dichtheid Eenheid ~ 3 x 10 ⁷ cellen / ml]
2. Meng gelijke volumes van de twee culturen, vortex kort 3 maal, gevolgd door een langere vortex gedurende 10 sec.
3. Bereid CSM-glucose platen. De platen zijn identiek aan die gebruikt voor normale groei en gedroogd zijn 45 min na gieten en stollen van de agar ^10.
4. Verdeel wel twintig 40 ml druppels van het mengsel 1 cm van de rand van het oppervlak van CSM-glucose platen. Wanneer de druppels worden eerst op het oppervlak de timer gestart meten verstreken tijd. Nadat de vloeistof is geabsorbeerd (ongeveer 30 min), betrekking hebben op de platen en laat ze ongemoeid op room temperatuur.

3. Oogsten Voorbereidingen

1. Harvest monsters na 1,75-2,5 uur bij 23 ° C door herhaald wassen individuele gedroogde druppels van de plaat met 150 ml koud CSM-glucose, waardoor de platen op ijs. Herhaaldelijk was de druppel gebied 10-20 keer met hetzelfde medium tot herstel te maximaliseren. Verzamel in 15 ml Falcon buizen op ijs.
2. Probe ultrasone trillingen de monsters 10x bij 60% amplitude met een Fisher FB120 sonicator (120Watt, 120Volt, Freq 20 kHz) op ijs.
3. Controleer in een fase microscoop die weinig of geen aggregaten blijven. 15-50% van de cellen wordt verwacht dat gevormd zygoten op dit punt.
4. Laat de buis van cellen in verticale stand ongestoord op ijs gedurende 10 min bij verdere voorzorgsmaatregel (om aggregaten te regelen).
5. Herstel de bovenste 90% van het volume en filtreer deze over het nylon gaas (BD Falcon Polypropyleen buis met schroefdop (Ref 352235)). In een typisch experiment, 10 ⁷ cellenhersteld van een plaat werden op dit punt verdund in 4 ml van CSM-glucose.

4. Flow Cytometry

1. Sorteer cellen met behulp van de Sony iCyt Reflectie Model Flow Cytometer, (Highly Automated Parallel Sort) HAPS1 met een 100 micron tip. Voor GFP excitatie met de blauwe argon-ion, 250 milliwatt laser bij 488 nm. Voor mCherry excitatie, gebruik maken van de 100 milliwatt laser op 561 nm. Hoewel we geen ervaring met andere machines, verwachten we dat Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx of Beckman Coulter MoFlo XDP zou fijn zijn wanneer uitgerust met de juiste lasers.
2. Base sorteren parameters op een naar voren ten opzichte van back scatter plot om poort aan levensvatbare cellen. Oprichting van een emissie perceel van 615 + / - 30 nm banddoorlaatfilter (mCherry) versus 525 + / - 25 nm banddoorlaatfilter (GFP) op de gebeurtenissen in vier kwadranten verdelen, "Rood + Groen-", "Rood + Groen +", "Red- Green-"en" rood-groen + "(Figuur S2). Gebruik nonfluorescent cellen als standaard fof de bepaling van de "Red-Green-" kwadrant.
3. Soort cellen met een mantel druk van 21,5 psi, een druppel frequentie van 43.400 druppels / sec, en een monster druk van 20,5 psi.
4. Initial Sorteren ("Recovery Mode"): Verzamel monsters in gekoelde Eppendorf buisjes met 250 ml koud CSM-glucose. Sediment 10 sec op volle snelheid in een microcentrifuge gekoelde (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) en zuig de stroom oplossing (Flow cytometry mantel oplossing (PBS met 1 mM EDTA) BioSure Catalog No 1027). Resuspendeer in 500 ml koud CSM-glucose.
5. Tweede Sorteer ("Zuiverheid Mode"): Voer het soort als in het initiële sorteren met behulp van de "zuiverheid modus" optie. Sediment de gezuiverde cellen en de pellets in 500 ml 1,0-ml CSM-glucose mengen. Schud gedurende 15 min in 24-well platen bij 23 ° C metabole teruggevorderd.

5. DeltaVision Microscopie

1. Bereid agarose pads als volgt: Breng een suspensie van 1,5% agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, Catalog # 15510-07) in CSM-glucose aan de kook vortex kort en breng 0,3 ml van de agarose oplossing op het oppervlak van horizontale standaard glasplaatjes en ze tegelijkertijd bedekken met een tweede slede (zonder uitoefenen van druk).
2. Na afkoelen gedurende 10 minuten verwijdert de bovenste slede door hem horizontaal zorg om een ​​glad oppervlak te verlaten en niet te laag Agarose verstoren. (Wanneer de bovenste slede is verwijderd, moet het monster van cellen toegepast binnen 1-2 min. Bij bewaring in een vochtige kamer bij kamertemperatuur zonder de bovenslede, pads kan worden bewaard tot een dag voor gebruik.)
3. Sediment monsters en deposito porties van 1 ml van de pellet op agarose pads (zonder het aanraken van het oppervlak). Onmiddellijk wordt het monster bedekt met een vierkant nr. 1 dekglaasje aan. Knip overtollige agarose met een single-edged scheermes. Sluit de voorbereidingen met vaseline vrijgesteld van een spuit.
4. Beeld met behulp van Deltavision (Precisio Toegepasten) met een 100x olie immersie objectief zonder binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5).
5. Deconvolutie z-stacks met het softWoRx 5.0.0 programma ( http://www.api.com/softworx.asp ) en verwerken minimaal. Opeenvolgende z-vliegtuigen werden over het algemeen verzameld op 0,2-0,4 micron intervallen.

6. Representatieve resultaten

Fluorescentie-intensiteit niveaus in getransformeerde haploïde cellen: Het niveau van fluorescentie in de haploïden is geïllustreerd in figuur S1. Voor het kruis, epifluorescerende onderzoek dat deze in hoofdzaak alle GFP transformanten groen waren en dat alle mCherry transformanten, maar vaak zwakker waren rood. Dat alle cellen voor het kruis inderdaad fluorescent waren we de subpopulatie met de helderste fluorescerende signaal.

Opbrengst: After de eerste soort, de rood + groen + monster (figuur S2) omvat typisch 8-20% van de input aantal cellen en een buitensporig aantal haploïde cellen, misschien te wijten aan aanhoudende cel-cel adhesie. Aangezien hoog verrijkt wordt niet bereikt met een soort moet het gedeeltelijk gezuiverde monster probe gesonificeerd tweemaal bij 60% amplitude gevolgd door re-sortering. (Recovery sorteert duren meestal tussen 1-2 uur, terwijl de tweede soort heeft slechts 15 minuten.) Van de cellen blootgesteld aan de tweede soort, de rood + groen + monsters die 23-52% van de input cellen.

Fase microscopisch onderzoek: Onderzoek door fasecontrast microscopie toonde dat de zuiverheid van het uiteindelijke preparaat zygote ongeveer 90% gemiddeld 21 preparaten (variërend van 86% tot 91%). De verontreinigingen waren groen of rood haploiden of paren van haploïden, die in contact met elkaar. Figuur 3 bevat het percentage van zygoten die moetengeen knop, mediale knoppen (Med), zijknoppen (Lat) of klem knoppen (Term), het aantal gepaarde haploiden van dezelfde kleur ("2Same") of andere kleur ("2Hap"), evenals individuele haploiden ( HAP). Wanneer cellen werden geoogst na 1.75 uur, werden meer dan 50% unbudded en de andere subcategorieën (met mediale, laterale, of terminal knoppen) zijn gelijk vertegenwoordigd. Na 2,5 uur waren er ongeveer gelijke aantallen zygoten in elk van de vier categorieën (unbudded met mediale, laterale of terminale knoppen).

Microscopische waarnemingen (figuur 4):

De structuur van zygoten lijkt ongewijzigd tijdens zuivering. Afhankelijk van de duur van het kruis, de bevolking had verschillende verhoudingen van unbudded en gebloeid zygoten, zoals hierboven uitgelegd. Aangezien zowel de groene en rode haploiden toonde een aanzienlijke variatie in fluorescerende intensiteit van het signaal, wat zygoten waren overwegend rood terwijl anderen waren overwegend groen, zoals waargenomen door comparing de eenkleurige beelden naar de gecombineerde beelden in figuur 4. Merk ook op dat de GFP (MW 26kDa) de kern binnenkomt en vindt in de kern zelfs wanneer de kern niet gefuseerd. Vacuolen onderscheiden zich als zwarte niet-fluorescerende sferen.

Het eindproduct van zuivering levert een diverse populatie in verschillende stadia van ontwikkeling. Zygoten label A hebben ondergaan fusie. Type B zygoten worden unbudded. Type C hebben een kleine knop. Type D hebben een grotere knop, en Type E zygoten gaat cytokinese ondergaan. Merk ook op dat veel van de eerdere zygoten nog niet fluorescerende mediale deellijn (*) vertonen, en dat de vacuolaire "erfenis structuur" (I) ¹² kunnen vaak worden gezien van de zygote tot in de knop. In sommige gevallen heeft het groene signaal verdeeld in de partner in veel sterkere mate dat het rode signaal. Dit geeft de vertraging van overdracht die kenmerkend polysomen (Tartakoff, in voorbereiding).

Beginnend met een paar 5 ml logaritmische kweken van haploïde cellen we terug ongeveer 1-2 x 10 ⁶ zygoten, wat voldoende is voor vele immunoblots, met chemiluminescente detectie procedures. Met fenol-chloroform isolatieprocedures we ongeveer 1,5 mg van RNA te extraheren uit deze aantal cellen.

Aangezien het gezuiverde zygoten werden gekoeld voorafgaand aan verdere analyse raden incubatie bij 23 ° C in kweekmedium.

Figuur 1. Chronologie van de zygote vorming. Zygoten als intermediair tussen haploiden en diploïden. Deze grafiek toont de klassieke activering (shmooing) van haploiden hun fusie en de vorming van de eerste bud. Knoppen kan zowel mediaal (M), laterale (L) of terminal (T).

Figuur 2. Schema van de zygote zuiveringsprotocol. Na incubatie op het oppervlak van agarplaten in compleet medium met glucose, het celmengsel werd gewonnen door wassen en vervolgens onderworpen aan een eerste soort in "recovery mode" gevolgd door een tweede soort in "zuiverheid mode. " De gele kleur geeft aan dat zowel mCherry en GFP signalen waren zichtbaar in de zygoten.

Figuur 3. Rassen van zygoten in het gezuiverde fracties. Paring mengsels werden geoogst na 1,75 of 2,5 uur tot fracties, aangerijkt met relatief vroeg vs relatief meer volwassen zygoten herstellen. Acht onafhankelijke experimenten door de verschillende kleuren, werden uitgevoerd voor elk tijdstip. De grafieken geven de relatieve aantallen van zygoten die have ruimtelijk verschillende patronen van knopvorming. Gezien de korte duur van de incubatie (minder dan 2,5 uur bij kamertemperatuur) waargenomen alle knoppen zijn oorspronkelijke zygote ontluikende events.

Figuur 4. DeltaVision onderzoek van verrijkte fracties. Een typische gebied werd onderzocht door Deltavision microscopie. De afbeeldingen tonen ofwel beide rood en groen of een kleur. De rode overeen met de polysomal label (Rpl25p-mCherry) en groen cytosolische GFP. Let op de hoge verrijking van zygoten en de aangewezen subcellulaire features: de vacuole (v), knoppen (b), nucleus (n), vacuolaire "overerving structuur" (i), en de scheidingswand (*) die lijkt te scheiden ouderlijke domeinen in relatief vroege zygoten. Hun variabele algehele kleur geeft de relatieve intensiteit van de haploïden die gefuseerd. In gevallen waarin de twee ouderlijke domeinen behoudeneen duidelijke kleur, evenwicht van de markers (cytoplasmatische GFP, mCherry-gelabeld polysomen) was onvolledig. Time-lapse studies in uitvoering tonen aan dat oplosbare GFP herverdeelt voorafgaand aan polysomen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Aanvullende Legends

Figuur S1. Fluorescentie van haploïde cellen Uiterst links:. Cellen die mCherry-tagged polysomen werden onderzocht om een groen signaal te detecteren. De rechthoekige raam werd ingesteld op de negatieve cellen te voorkomen. Midden-grafiek: Cellen die cytosolische GFP werden geanalyseerd, met de duidelijk heldere belangrijkste populatie van positieven. Uiterst rechts: Cellen die mCherry-tagged polysomen werden geanalyseerd. De rechthoek (identiek aan dat op uiterst links) omvat de helderste cellen en kunnen allenegatieven te vermijden. De aanduiding "R2" geeft het percentage cellen teruggewonnen binnen de aangegeven rechthoek.

Figuur S2. Cel distributie in de eerste en tweede sortering. Deze twee kleuren plots geven het aandeel van groen + rood + cellen in het kwadrant rechtsboven (R5). Dit percentage stijgt tot 52% in het tweede soort. Horizontale as: groen signaal. Verticale as: rood signaal.

Discussie

De beschikbaarheid van gezuiverde zygoten moet biochemische studies waaronder transcriptomics, proteomics en lipidomics, alsmede onderzoek mechanismen waardoor zygoten ondergaan celcyclus opnieuw binnenkomen, celwand remodelleren budding en overerving kenmerken, enz. Alternatief vergemakkelijken, kunnen worden gegenereerd vanaf zygoten met stammen die karakteristieke mutaties in een of beide ouders. Bovendien, de gezuiverde zygoten, zoals op haploïde of diploïde cellen worden ingevroren in medium met 15% glycerol en lat...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens / Equipment	Bron	Catalogus nummer
pEG220, URA3/YIp, codeert cytoplasmatische GFP 11)	E. Grote
pAJ1661, URA3/CEN, codering RPL25 gefuseerd met mCherry	A. Johnston
Fisher FB120 sonicator	Fisher Scientific
Polypropyleen buis met schroefdop	BD Falcon	Ref 352235
Gekoelde microcentrifuge	Tomy	MRX-150
Flowcytometrie schede oplossing	Biosure	1027
iCyt Reflectie Model Flow Cytometer	Sony
DeltaVision deconvolutie microscoop	Toegepaste Precision
Upright epifluorescentiemicroscoop	Leica
UltraPure Agarose	Invitrogen	15.510-07
CSM glucose formulering Opmerkingen: Voor agarplaten gewoon omvatten 2% agar (Difco)	10