Om zygoten van zuiveren S. cerevisiae Werden haploïde cellen van tegengestelde mating type gemanipuleerd om rood of groen fluorescerende eiwitten, co-geïncubeerd tot zygote vorming mogelijk te maken en gefractioneerd met een flowcytometrie-based protocol drukken. De zeer verrijkte fractie maakt daaropvolgende "-sche" studies, het herstel van de initiële nakomelingen, en systematisch onderzoek van de zygote morfogenese.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Flowcytometrie gebaseerde Zuivering van
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zygoten zijn essentiële tussenproducten tussen haploïde en diploïde staten in de levenscyclus van veel organismen, met inbegrip van gist (figuur 1) 1. S. cerevisiae zygoten resultaat van de fusie van haploïde cellen van verschillende mating type (MATa, MATalpha) en leiden tot overeenkomstige stabiele diploïde die achtereenvolgens genereren liefst 20 diploïde nakomelingen als gevolg van hun opvallend asymmetrische mitotische delingen 2. Zygote vorming georkestreerd door een complexe reeks gebeurtenissen: Hierbij oplosbare mating factoren binden aan receptoren verwant, triggering receptor-gemedieerde signaaltransductie cascades die onderbreking van de celcyclus en uitmonden vergemakkelijken cel-cel fusie. Zygoten kan worden beschouwd als een model van voorlopercellen of stamcellen functie.
Hoewel er veel is geleerd over de vorming van zygoten en hoewel zygoten zijn gebruikt om cel-moleculaire aangelegenheden van algemeen signi onderzoekenicance, bijna alle studies hebben gebruik gemaakt van de paring mengsels waarin zygoten worden vermengd met een meerderheid van de bevolking van de haploïde cellen 3-8. Veel aspecten van de biochemie van zygote vorming en de voortgaande leven van de zygote blijven dan ook niet onderzocht.
Rapporten van zuivering van gist zygoten beschreven protocollen gebaseerd op hun sedimentatie eigenschappen 9, maar dit sedimentatie gebaseerde procedure leverde geen bijna 90% zuiverheid in handen. Bovendien heeft het nadeel dat cellen blootgesteld aan hypertone sorbitol. Wij hebben een veelzijdig zuiveringsprocedure. Daartoe paren haploïde cellen die rood of groen fluorescerende eiwitten werden geco-incubeerd met zygote vorming geoogst op verschillende tijdstippen, en de resulterende zygoten werden gezuiverd met een flow cytometrie gebaseerd sorteren protocol. Deze techniek biedt een handige visuele beoordeling van zuiverheid en rijping. De gemiddelde zuiverheidvan de fractie ongeveer 90%. Volgens de timing van de oogst, kan zygoten van verschillende graden van rijpheid worden hersteld. De gezuiverde monsters zorgen voor een geschikt punt van vertrek voor "-sche" studies, voor het herstel van de initiële nakomelingen, en voor systematisch onderzoek van deze stamceltransplantatie.
Protocol
1. Haploïde Cell Growth
- Grow S. cerevisiae cellen van de S288C achtergrond (BY4741) onder standaard condities 10.
- Transformeer haploiden om ofwel drukken van de twee opvallende fluorescerende markers 10. De markers keuze oplosbaar GFP expressie in het cytoplasma (pEG220, URA3/YIp, gelineariseerd met BglII 11) en een ribosomaal eiwit, RPL25, gefuseerd met mCherry (pAJ1661, URA3/CEN van A. Johnston). We verwachten dat gelijke tweekleurige zuivering protocollen kunnen het gebruik van andere heldere fluorescente eiwitten die worden gesynthetiseerd door de ouderlijke haploïde cellen. Als alternatief kan de cel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De beschikbaarheid van gezuiverde zygoten moet biochemische studies waaronder transcriptomics, proteomics en lipidomics, alsmede onderzoek mechanismen waardoor zygoten ondergaan celcyclus opnieuw binnenkomen, celwand remodelleren budding en overerving kenmerken, enz. Alternatief vergemakkelijken, kunnen worden gegenereerd vanaf zygoten met stammen die karakteristieke mutaties in een of beide ouders. Bovendien, de gezuiverde zygoten, zoals op haploïde of diploïde cellen worden ingevroren in medium met 15% glycerol en lat.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken dr. R. Michael Sramkoski voor hulp bij flowcytometrie, Dr Purnima Jaiswal en Dr Di Wu voor eerdere input en Ilya Aylyarov voor hulp bij de illustraties. Ondersteund door NIH Grant R01GM089872 en de Cytometry & Imaging Microscopy Core Facility van de zaak Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens / Equipment | Bron | Catalogus nummer | |
| pEG220, URA3/YIp, codeert cytoplasmatische GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, codering RPL25 gefuseerd met mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropyleen buis met schroefdop | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Gekoelde microcentrifuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flowcytometrie schede oplossing | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflectie Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolutie microscoop | Toegepaste Precision | ||
| Upright epifluorescentiemicroscoop | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15.510-07 | |
| CSM glucose formulering Opmerkingen: Voor agarplaten gewoon omvatten 2% agar (Difco) | 10 |
Referenties
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
