Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

Samenvatting

Beenmergtransplantatie geeft een manier om het genotype van het beenmerg afgeleide cellen. Als het gen van interesse tot expressie wordt gebracht in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen kan beenmergtransplantatie wijzigen beenmerg afgeleide cellen een ander genotype zonder de niet-beenmerg cellen genotype.

Samenvatting

Om de rol van een gen in de ontwikkeling van colitis begrijpen, vergeleken we de reactie van wild-type muizen en gen-van-belang deficiënte knockout muizen colitis. Als het gen-van-belang wordt uitgedrukt in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen van de gastheer, maar is het mogelijk om de rol van een gen van belang onderscheid in van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen door beenmergtransplantatie techniek. Het beenmerg afgeleide cellen genotype muizen veranderen, werden de oorspronkelijke beenmerg van ontvangende muizen vernietigd door bestraling en vervangen door nieuwe donor beenmerg van verschillende genotype. Wanneer wild-type muizen donor beenmerg getransplanteerd knockout muizen, kunnen we genereren knockout muizen met wild-type genexpressie in van beenmerg afgeleide cellen. Als alternatief werd toen knockout muizen donor beenmerg getransplanteerd naar wild-type ontvangende muizen, wild-type muizen zonder gen-van-een blijk van belangstellingvan beenmerg afgeleide cellen geproduceerd. Kan echter beenmergtransplantatie niet 100% volledig zijn. Daarom gebruikten we cluster van differentiatie (CD) moleculen (CD45.1 en CD45.2) als markers van donor en ontvangende cellen het percentage van donor beenmerg afgeleide cellen in de ontvangende muizen en succesvolle beenmergtransplantatie volgen. Wild-type muizen met CD45.1 genotype en knockout muizen met CD45.2 genotype werden gebruikt. Na bestraling van ontvangende muizen werden de donor beenmergcellen van verschillende genotypen ingebracht in de ontvangende muizen. Wanneer de nieuwe beenmerg geregenereerde over te nemen immuniteit, werden de muizen uitgedaagd door chemisch middel (dextran natriumsulfaat, DSS 5%) colitis te induceren. Hier bleek ook de methode colitis te induceren in muizen en evalueren van de rol van het gen van interesse tot expressie gebracht uit beenmerg afgeleide cellen. Als het gen-van-belang van het bot afgeleide cellen speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van de ziekte (zoals colitis), kan het fenotype van de ontvangende muizen met beenmergtransplantatie aanzienlijk worden gewijzigd. Eind colitis experimenten, het beenmerg afgeleide cellen in bloed en beenmerg werden gemerkt met antilichamen tegen CD45.1 en CD45.2 en de kwantitatieve verhouding bestaan ​​kunnen worden gebruikt om het succes van beenmergtransplantatie door flowcytometrie evalueren. Succesvolle beenmergtransplantatie moeten tonen een grote meerderheid van de donor genotype (in termen van CD molecule marker) over de ontvanger genotype in zowel het beenmerg en het bloed van de ontvanger muizen.

Protocol

1. Before-you-start Technische overwegingen

1. Wij raden u aan zowel C57/BL6 wild-type muizen en knock-out muizen voor experiment, omdat muizen met bijbehorende cd-moleculen kunnen worden gekocht bij de grote muis leveranciers.
2. Aangezien het moeilijk op te sporen het wild-type muizen en knockout muizen afgeleide donorcellen na beenmergtransplantatie, moet CD45.1 muizen gebruiken om wild-type muizen vertegenwoordigen. (CD45.1 C57/SJL WT muizen Jackson Laboratories voorraad # 002014).
3. De meeste muizen kolonies zijn CD45.2. Onze knockout muizen behoren tot CD45.2 genotype (als alternatief een CD45.2 WT muizen bron: Jackson Laboratories voorraad # 000664). De bepaling van CD45.1 of CD45.2 genotype kan worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie van beenmerg en perifeer bloed als bedoeld in hoofdstuk 7 van dit protocol.
4. Muizen na bestraling hebben stoornissen van het immuunsysteem. Houd muizen in pathogeenvrije faciliteit.
5. Werking van bestraler vereist speciale beveiliging clearance en training. Om tijd te besparen in de opleiding en goedkeuringsprocessen, is het het beste om samen te werken met een laboratorium met gekwalificeerde technicus die in staat is om de bestraler bedienen.
6. Veel instellingen hebben flowcytometrie laboratoria met ervaren technici. Het minimaliseren van problemen met flowcytometrie werking, is het beter om uw flowcytometrie experiment plannen te bespreken met de ervaren technicus voordat u begint.
7. Muizen kregen op deze wijze (10 muizen per groep):

Groep		Beenmerg donor tot ontvanger	Behandeling
Een	BM-uitwisseling	CD45.1 WT te CD45.2 KO	DSS colitis
B			Water normale controle
C	BM-uitwisseling	CD45.2 KO te CD45.1 WT	DSS colitis
D			Water normale controle
E	Schijn	CD45.1 WT te CD45.1 WT	DSS colitis
F			Water normale controle
G	Schijn	CD45.2 KO te CD45.2 KO	DSS colitis
H			Water normale controle

* Een korte illustratie van experimentele protocol wordt weergegeven in figuur 1.

2. Ontvangende muizen Bestraling

1. Muizen gefokt en gehouden in pathogeenvrije faciliteit. Plaats muizen in geautoclaveerd bestraling taart met filter. Plaats een muis in elke sleuf van bestraling taart. Plaats de taart in de bestraler en zorg ervoor dat de draaitafel en taart draaien.
2. Zet de luchtpompvoor ventilatie. Sluit de bestraler deur en vergrendel deze.
3. Bestralen de muizen met 1000 rad (wat overeenkomt met 10 Gy) ongeveer 10 min (afhankelijk van stralingsbron en halfwaardetijd). Vanaf dit tijdstip werd de bestraalde muizen immuno-gecompromitteerde en zwak immuniteit tegen infectie. Na bestraling, neemt u de taart buiten en plaats in een steriele container voor het transport van de bioveiligheid kast in dierlijke faciliteit. Vermijd blootstelling van de muizen om externe omgeving om de kans op besmetting te minimaliseren.
4. In bioveiligheid kabinet, de overdracht van de muizen in de autoclaaf muizen kooien met geautoclaveerd beddengoed (4 muizen per kooi nieuw steriel water toevoegen met sulfatrim vering -. 3,12 ml per 100 ml water).
5. Wikkel de waterfles met aluminiumfolie als de antibiotica zijn lichtgevoelig. Schud de sulfatrim flesje goed te mengen voordat u het aan de kooi.

3. Donor beenmerg Extractie

1. Offeren muizen met kooldioxide of isoflurAnce en dan onderdompelen in 1:200 Lysol oplossing. Spuit de muizen met 70% ethanol om de huid vochtig en open botten ontleden.
2. Week de dissectie-instrumenten in 70% ethanol voor sterilisatie.
3. Voer de dissectie in een bioveiligheid kast. Gebruik de steriele dissectie-instrumenten aan de humerus, dijbeen, scheenbeen en kuitbeen botten, vrij van hechten spieren en ligamenten bloot te leggen.
4. Knip de beide uiteinden van de botten van de rode beenmerg te tonen. Houd de botten met een pincet. Spoel de rode beenmerg uit met koude PBS met 3 ml spuit en 25G naalden om een ​​petrischaal. Spoelen van beide uiteinden van botten meer beenmergcellen leveren.
5. Gebruik 6 ml spuiten en 18G1 / 2 naalden in rood beenmerg stekkers te doorbreken door herhaalde aspiratie en uitwerpen. Overdracht beenmerg met 50 ml Falcon buizen.
6. Draai het beenmerg van 1800 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Gooi supernatant, resuspendeer pellet door vortexen gedurende 5-10 sec.
7. Verdun 10X RBC lysis-buffer met steriel water. Advertentied 1X RBC lysis buffer (5 ml per donor muis), vortex opnieuw 5 sec en houdt exact 3 min bij kamertemperatuur.
8. Na 3 min, vul de buizen met 20 ml koude PBS tot de lysis en meng stoppen. Giet de inhoud door middel van een 40 um cel zeef direct in een nieuwe 50 ml Falcon buis.
9. Spoel de originele verpakking met 5 ml PBS en transfer naar celzeef ook. Vul tot 50 ml met PBS en meng.

4. Tellen Bone Marrow Donor cellen

1. Voeg 100 ul van Trypan blauwe een Eppendorf buis en 100 ui beenmerg suspensie aan een Eppendorf buis en meng. Pipetteer de gekleurde cel mengsel in een hemocytometer.
2. De hoeveelheid cellen wordt berekend door de totale levende beenmerg cellen in de Falcon tubes = unstained celaantal in 16 vierkanten x 2 (door Trypan blauwe verdunning) x 10.000 x 50 ml
3. Spin down beenmergcellen in 50 ml Falcon buizen bij 2.000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C.
4. Verwijder het supernatant. Op basisop het totale celtellingen, resuspendeer de pellet met PBS tot 1 x 10 ⁸ cellen per ml

5. Infusie om ontvangende muizen

1. Verwarm de ontvangende muizen op een warmte-pad en onder een warming lamp. Zet de ontvangende muizen in restrainer. Injecteer 1 x 10 ⁷ cellen per muis in 100-200 pi intraveneus.
2. Injectie van donor beenmerg gedaan moet worden tussen 4 tot 24 uur na de bestraling.
3. Blijf op de 4 geïnjecteerde muizen per kooi. Handhaving van de geïnjecteerde ontvangende muizen in geautoclaveerd kooien met antibiotica behandeld water voor de eerste 4 weken in pathogeenvrije dieren faciliteit en laat de muizen weer immuniteit. Change kooien, antibiotica behandeld water en voedsel om de 4 dagen aan hygiëne.

6. Inductie van Colitis en evaluatie van colitis

1. 4 weken na bestraling en beenmergtransplantatie, naar normaal water zonder antibiotica en handhaven de muizen gedurende 2 weken te hun normale herwinnengut microflora.
2. 6 weken na beenmerg injectie meten oorspronkelijke lichaamsgewicht. Sommige muizen worden gegeven 5% dextransulfaat in drinkwater ad libitum aan colitis veroorzaken. Sommige muizen worden gegeven regelmatig drinken alleen water als normaal controlegroepen.
3. 5 dagen later, terug te trekken uit perifeer bloed, over te dragen aan heparine gecoate buizen (Vacutainer) en houd in ijs. Zwembad het bloed van 4 muizen tot 1 tube. Combineer 300 ul bloed met 300 ui buffer cel kleuring = 600 pi. Verdeel het bloed 5 Eppendorf buizen, elk met 100 pl.
4. Offeren muizen met kooldioxide of isofluraan. Evalueer macroscopische schade scores (zie andere JOVE video publicatie voor details ^1). Meet lichaamsgewicht verandering. Meet darm lengte en dikte met digitale schuifmaat. Let op kruk textuur (hard, zacht of bloederig). Bepaal occult bloed in de ontlasting met Hemooccult. Ontleden colon weefsels en vast te stellen in formaline voor H & E kleuring.
5. Prepareer een dijbeen bone per muis, uitpakken beenmerg en spoel het beenmerg met koude PBS via 25G naald en 1 ml spuit. Pool 4 beenmerg stekkers aan 1 tube en houdt in ijs.
6. Giet het beenmerg om petrischaal, afschuiving het beenmerg stekker met 18G naald en 5 ml spuit meerdere keren tot er geen beenmerg stekker aanwezig is.
7. Spin down met 1500 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer met 600 ul cel verkleuring buffer. Verdeel de geresuspendeerde beenmerg 5 Eppendorf buizen, elk met 100 pl.

7. Kwaliteitscontrole van beenmergtransplantatie door flowcytometrie

1. Label elk monster buisjes bloed of beenmerg # 1-5:
2. Bereid het antilichaam mengsel elke respectieve buis in het donker.

# 1 Geen antilichaam
# 2 30 ul FITC isotype controle + 30 pi PE isotype controle + 15 pl CD16/32 blokkeren
# 3 30 ul FITC Ab CD45.1 + 15 pl CD16/32 blokkeren
# 4 30 pi PECD45.2 Ab + 15 pi CD16/32 blokkeren
# 5 30 ul FITC Ab CD45.1 + 30 pi PE CD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blokkeren

Voeg niets aan bloed of beenmerg monster # 1

Voeg 5 ul antilichaam mengsel # 2 voor elk bloed of beenmerg monster # 2

Voeg 3 pl antilichaam mengsel # 3 bij elk bloed of beenmerg monster nr.3

Voeg 3 pl antilichaam mengsel # 4 voor de bloed of beenmerg monster nr.4

Voeg 5 ul antilichaam mengsel nr.5 elk bloed of beenmerg monster # 5

3. Houd donker ijs gedurende 30 minuten.
4. Voeg 2 ml 1X RBC lysis buffer aan elke buis. Houd in donkere op ijs gedurende 15 minuten.
5. Draai de cellen bij 1500 rpm, 5 min bij 4 ° C. (GH 3,8 rotor, 1.500 tpm = 350 xg) Verwijder supernatant. Resuspendeer de pellet met 500 ul cel verkleuring buffer in het donker, dan vortex kort.
6. Controleer de CD45.1 (die WT) en CD45.2 (vertegenwoordiger van KO) in de immuun-gekleurd bloed en het beenmerg monsters door flowcytometrie. FITC selecteren om WT CD45.1 en PE vormen voor KO CD45.2 vertegenwoordigen.
7. Analyseer de resultaten van flowcytometrie FlowJo software. Bereken de verhouding van FITC: PE ratio of PE: FITC verhouding te bepalen of donor genotype dominant genotype in bloed en beenmerg.

Resultaten

Als het gen-van-belang speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem cellen tijdens de ontwikkeling van colitis, de muizen die beenmerg van verschillende genotype door beenmergtransplantatie (WT KO KO of om WT) moet een veranderde reactie op DSS colitis. Een van de belangrijkste parameters voor het bepalen van de ernst van colitis is de H & E kleuring van de colon weefsel. Colonic weefselstructuur veranderingen en tekenen van ontsteking kan kwantitatief worden geëvalueerd door H & E histologie scoresysteem. Cr...

Discussie

Deze beenmergtransplantatie aanpak is geschikt voor immunologie van colitis, infecties, kanker, obesitas en andere aandoeningen. Dit experiment beenmergtransplantatie nodig wanneer het gen-van-belang wordt uitgedrukt in beide afgeleid beenmerg en niet-beenmerg afgeleide cellen en het gen-van-belang vermoedelijk ziekte bemiddelen door cellen van beide populatie. Bijvoorbeeld, antimicrobiële peptide cathelicidine aangetoond moduleren acute colitis. Maar wordt uitgedrukt in zowel epitheelcellen en immuuncellen (zoals macro...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer
Cel vlekken buffer	Biolegend	# 420201
10X RBC lysis buffer	Biolegend	# 420301
FITC muis isotype control	Biolegend	# 400207
PE muis isotype control	Biolegend	# 400211
PE anti-muis CD45.2	Biolegend	# 109807
FITC anti-muis CD45.1	Biolegend	# 110705
Anti-muis CD16/32 blokkerende	Biolegend	# 101301
40 urn celzeef	Fisherbrand	# 22363547
PBS 1X	MP Biomedicals	# 1860454
Heparine	Fisherbrand	# BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (fisher)
Lysol IC	Andwin Wetenschappelijke	NC9745686 (fisher)
Vaccutainer	BD	# 8000813
Muis weerhouder	Braintree Scientific	# TV-150
Bestraler	JL Shepherd and Associates	Mark I 68A
Flowcytometer	BD	BD FACSCanto II
Flowcytometer reageerbuis	Valk	# 352052
Digitale schuifmaat	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult ICT	Beckman Coulter	G0328QW