Kweken neurale explantaten van ontleed Xenopus laevis Embryo's die fluorescerende fusie eiwitten tot expressie zorgt voor beeldvorming van de groei kegel cytoskelet dynamiek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het complexe axon begeleiding wordt voornamelijk veroorzaakt door de groei cone, dat de dynamische beweeglijke structuur aan het uiteinde van de groeiende axon. Tijdens axon uitgroei, moet de groei kegel integreren meerdere bronnen van begeleiding cue informatie voor het moduleren van de cytoskelet om de groei kegel vooruit te stuwen en nauwkeurig navigeren naar de specifieke doelstellingen ervan vinden 1. Hoe deze integratie vindt plaats op het cytoskelet niveau is nog steeds in opkomst, en onderzoek van het cytoskelet eiwitten en effector dynamiek binnen de groei conus kan de opheldering van deze mechanismen toe te staan. Xenopus laevis groei kegels zijn groot genoeg (10-30 micron in diameter) aan op hoge resolutie beeldvorming van levende cytoskelet dynamiek (bijvoorbeeld 2-4) en zijn gemakkelijk te isoleren en in een laboratoriumomgeving manipuleren vergelijking met andere vertebraten. De kikker is een klassiek model voor de ontwikkelingsbiologie neurobiologie studies en belangrijke vroege inzichten in de groei kegel microtubule dynamiek werden in eerste instantie gevonden met behulp van dit systeem 5-7. In deze werkwijze 8 worden verzameld en eitjes bevrucht in vitro, geïnjecteerd met RNA dat codeert fluorescent gelabeld cytoskelet fusie-eiwitten of andere constructies om genexpressie te manipuleren, en vervolgens liet men ontwikkelen om de neurale buis fase. Neurale buizen worden geïsoleerd door dissectie en vervolgens gekweekt en groei kegels op uitgroeiende neurieten worden afgebeeld. In dit artikel beschrijven we hoe u deze methode, waarvan het doel is om de cultuur Xenopus laevis groei kegels voor de volgende afbeelding in hoge resolutie analyse uit te voeren. Terwijl wij het voorbeeld van + TIP fusieproteïne EB1-GFP, kan deze werkwijze worden toegepast op een aantal eiwitten om hun gedrag verduidelijken in de groeikegel.
Protocol
Let op: We beschrijven de stappen in de eerste twee secties alleen in het kort, als uitstekende protocollen met gedetailleerde informatie is elders gepubliceerd die zich richten meer bepaald op de volgende stappen (bijv. 8-12). Daarnaast heeft de algemene protocol van het werken met Xenopus spinale neuronen in levende celculturen al eerder gepubliceerd in een gedetailleerde methoden artikel 8. We raden herziening van dat artikel als aanvulling op deze video, maar hier zijn we niet genoeg informatie om met succes uit te voeren en het oplossen van de neurale buis dissectie en plating protocol in stap 3.
1. In Vitro Fertilisatie van Xenopus Eieren
- Verkrijgen eieren van vrouwelijke kikkers die werden met choriongonadotrofine (400 eenheden / frog) 12-18 uur ingespoten voordat het ei collectie. Verzamel eieren in gemodificeerde Ringer oplossing 1X Marc (MMR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 2,0 mM CaCl2, 5,0 mM HEPES, pH 7,4 9).
- Bevruchten eieren in vitro met gehakt testes, zoals eerder beschreven negen.
- Na ten minste 20 minuten, verwijder embryo gelei coat door incubatie embryo in 2% cysteine in 1X MMR (tot pH 7,8 met NaOH) gedurende 3-5 min. Wassen met 0,1 x MMR (of 0,1 x MBS (Modified Saline, Barth's 1X recept: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 2,5 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, pH 7,8)) 3 -5 keer, en houdt embryo bij kamertemperatuur totdat injecties of desgewenst plaats embryo bij 14-18 ° C om de ontwikkeling te vertragen.
2. Micro-injectie van RNA
Opmerking: we gebruiken terwijl RNA injectie hier zijn deze technieken niet beperkt tot RNA en DNA, eiwitten of gemodificeerde nucleïnezuren voor genmanipulatie kan ook worden gebruikt en zijn eerder 12 beschreven.
- Vóór experiment, RNA voor het labelen cytoskelet of andere structuren are getranscribeerd van gelineariseerde DNA templates met de mMessage mMachine kit (Ambion). mRNA vereist 5 'cap en een 3' polyadenylatie staart vertaling en preventie degradatie in embryo's. pCS2 + is een algemeen gebruikte vector voor dit doel, en de transcriptie kit bevat een dop analoge tijdens de synthesereactie. We getranscribeerde mRNA in nuclease-vrij ddH 2 0 opnieuw in suspensie in een stock concentratie tussen 500 en 2.000 ng / pl, gevolgd door snelle opslag bij -80 ° C. Vóór injectie verdunnen RNA in ddH 2 0 de geschikte concentratie voor injectie. Aangezien slechts een klein volume worden geïnjecteerd in embryo's opnieuw suspenderen in buffer is niet nodig. De laatste injectie concentratie typisch 50-200 pg / nl, afhankelijk van de construct en we meestal zullen injecteren tot 4 nl per embryo, maar veel laboratoria traditioneel tot injecteren 10 nl, ongeveer 1% van de totale een embryo. RNA kan giftig zijn bij hoge doses, en de dosis per embryo geslachtenlly varieert van 10 pg tot 1 ng, hoewel tot 5 ng kan worden getolereerd afhankelijk van het specifieke gen en zuiverheid. Echter, voor beeldvorming eiwit lokalisatie, het laagst mogelijke niveau worden geïnjecteerd om overexpressie artefacten te vermijden. RNA voor EB1-GFP in dit protocol wordt gebruikt eindbedrag van 250 pg per embryo.
- Bereid injectienaalden door te trekken capillair met een naald trekker 9, om een tip diameter van ~ 0,2 urn. Met een Sutter P-87 trekker, gebruiken we de volgende instellingen: warmte 644, pull 125, snelheid 70, tijd 250, maar deze parameters verschillen, afhankelijk van machine en moet worden bijgesteld na het veranderen van de gloeidraad (die we momenteel gebruik van een 2,5 mm vierkante doos gloeidraad die is 2,5 mm breed). Onder een microscoop, breek naald met een pincet onder een hoek met een ganzenveer-achtige vorm te genereren. Er zijn andere methoden voor het breken en vullen injectienaalden (bijvoorbeeld 11,12), maar we vullen naald RNA door een kleine druppel (0,5 - 1 ul) aan de achterzijde van denaald. Voor microinjecting tot embryo's, zijn er een aantal commercieel verkrijgbare injectiesystemen, twee van de bekendste zijn Pico-injector (Medical Systems), en Nanoject (Drummond Scientific) (zie 11 voor meer informatie). We gebruiken de Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, die samengeperst gas gebruikt voor een digitaal ingesteld tijd om consistente nanoliter volumes te leveren. Injectievolume worden geijkt voor elke nieuwe micropipet met een micrometer en injectietijd worden aangepast aan de gewenste hoeveelheid ingespoten RNA bereiken.
- Place embryo's op de 1 - tot 4-cellig stadium in een plastic schotel met 5% Ficoll in 0,1 x MMR. Die de embryo vast met forceps of plaatsing in een holding platform (een plastic mesh, met ~ 1 mm raster gehecht aan de bodem van de schaal met plasticine of tandheelkundige wax), injecteer gewenste volume in dierlijke blastomeren (zie stap 2.1 voor meer informatie met betrekking tot injectie volumes). Verdelen in verschillende locties in embryo, ten minste een injectie in elke dier blastomeren verkrijgen meer uniforme verdeling (bijvoorbeeld voor een 4-cellig stadium embryo, we meestal 1-2 keer geïnjecteerd in elk blastomeer, terwijl in een 2-cellig stadium embryo, we injecteren 2-4 keer in elk blastomeer). Een voordeel van te wachten tot de 2-4 cel stadium is dat u ervoor zorgen het embryo is begonnen normaal aan te hangen. Echter, als de tijd is van de essentie, kunt u beginnen op de 1-cellig stadium, met weinig verschil in het eindresultaat dan meer embryo's om te worden geïnjecteerd. Oudere embryo's kunnen ook gebruikt worden, en dit is bijzonder nuttig indien specifieke celtypen zijn gericht voor injectie, maar we algemeen de voorkeur breder expressie we injecteren in jonge embryo's de behoefte aan talrijke injecties te verminderen.
- Overdracht geïnjecteerde embryo's om een plastic schotel met 0,1 x BMR en hen in staat stellen te ontwikkelen tot stadium 20 tot 23 13. Incubeer embryo 14 tot 22 ° C afhankelijk van de gewenste speed. van de ontwikkeling. (Voor het ontleden van neurale buis de volgende dag, gebruik ~ 22 ° C. Voor de dag na, gebruik dan ~ 14 ° C)
3. Neurale buis Dissection en Plating
- Voorafgaand aan het uitvoeren van de dissecties, de voorbereiding van de cultuur gerechten 14. Eerste laag dekglaasjes met voldoende oplossing van 200 ug / ml poly-lysine in PBS tot pool over het oppervlak van het dekglaasje van hetzij Mattek of Lab-Tek kweekschalen, en incubeer gedurende een uur (als alternatief kan men gebruik dekglaasjes zitten los in een petrischaal voor later plaatsing op glasplaatjes voor beeldvorming en immunocytochemie). Zuig en was met een overmaat PBS 3 keer, en laat drogen. Smeer schalen met 10 ug / ml laminine in PBS (we gebruiken 500 ul per coverslip, genoeg om pool over het oppervlak) gedurende een uur bij 37 graden. Zuig laminine oplossing weg en was 3 keer met een overmaat PBS, en let niet te laten laminine-gecoate oppervlakken worden blootgesteld aan de lucht-interface. Vervane PBS met kweekmedium (50% Ringer's, 49% L-15 media, 1% foetaal runderserum, plus 50 ug / ml penicilline / streptomycine en gentamycine, pH 7,4 en filter gesteriliseerd). (Ringer's Media, 115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 10 mM Hepes pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Terwijl onze protocol gebruikt deze media, moet worden opgemerkt dat dit een verrijkt medium gebruikelijk oudere Xenopus retinale ganglioncellen culturen, waarbij neuronen minder energie voorbehouden. Jonge ruggenmerg culturen zal overleven en groeien meer dan 24 uur in de zuivere Ringers Media zonder extra groeifactoren, en dit is inderdaad een van de voordelen van het gebruik van dit systeem. Optioneel: Voeg NT3 en BNDF (tot uiteindelijke concentraties van 25 ng / pl elk) aan kweekmedia op axon uitgroei verhogen.
- Vanwege de variabiliteit in de expressie van mRNA geïnjecteerd, kan embryo vertonen een mozaïek van fluorescentie. Voorafgaand aan het uitvoeren ontledingen, embryo scherm op de aanwezigheid van fluorescentie, die embryo's Exp identificerenruk de fluorescent eiwit in de neurale buis. Plaats fluorescent embryo's in stadium 20-23 in een agarose-coated plastic schaal gevuld met Steinberg's media (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2, 1,3 mM MgSO4, 4,6 mM Tris, pH tot 7,8 dan geautoclaveerd) 5. Om de agarose-gecoate schaal, jas bodem van kunststof schotel met gesmolten 1% agarose in 0,1 X BMR en laten uitharden te maken. Dit verschaft een zacht oppervlak dat geen schade kan optreden aan de fijne forceps en wolfraam naalden tijdens de daaropvolgende stappen dissectie. Dissectie van embryo na trap 23 is mogelijk, maar het is moeilijker als weefsels beter aan elkaar hechten en daarmee een langere behandeling met collagenase.
- Onder een ontleden scope, verwijder de vitelline membraan met fijne tang, en dan isoleren de gehele dorsale deel van het embryo, door het maken van een serie van incisies. Terwijl de ene tang houden het embryo in de plaats, gebruik maken van de tweede naar een incisie te maken op dezijde van het embryo aan het holle inwendige bloot. Gebruik vervolgens beide tang te knijpen langs het weefsel tussen de dorsale en ventrale helften van het embryo, waardoor het snijden van het embryo in de helft van de dorsale gedeelte dat de neurale buis te isoleren.
- Plaats de dorsale explantaat in een Eppendorf buis met 2 mg / ml collagenase in Steinberg media gedurende 15-20 minuten op een rotator om weefsel los te maken en dorsale explant pipet in een plastic agarose-gecoate schaal met verse oplossing Steinberg. Als alternatief kan de explant worden geplaatst in een petrischaal met de collagenase oplossing gedurende 15 min, waarbij de gehele dissectie zouden kunnen worden uitgevoerd.
- Met behulp van een pincet voorzichtig ontleden de neurale buis van de dorsale epidermis en de ventrale notochord. Schuif het uiteinde van de tang tussen de opperhuid en het onderliggende weefsel en langzaam trek de opperhuid, het openbaren van de neurale buis onder. Vervolgens gebruikt u een tang om het weefsel vast te houden en een andere om de punt tussen de schuifneurale buis en notochord. Tenslotte tang om de somieten verwijderen aan weerszijden van de buis.
- Breng de neurale buis op een agarose-gecoate schaal gevuld met kweekmedium, zoals beschreven in stap 3.1.
- Na het verzamelen van verschillende neurale buizen, snijd ze in tal van stukken (ongeveer 20, als de hele buis wordt geïsoleerd) met behulp van geslepen wolfraam naald of een tang, en dan het bord van de stukken in cultuur gerechten gevuld met medium (bereid in stap 3.1), uitspreiden de explantaten gelijkmatig in rijen.
- Na plating, niet bewegen de gerechten omdat dit zou verstoren de beslagleggende cellen. Incubeer de vergulde neurale buis explantaten rond 20-22 ° C. We meestal de schotel van cellen op de bank een nacht rusten bij kamertemperatuur. Een van de voordelen van Xenopus laevis neuronen is dat een speciaal voor celkweek incubator dat CO2 niveaus of reguleert niet nodig. Neurieten en groei kegels kunnen worden waargenomen en afgebeeld bij kamertemperatuur 12-24 Uur na het uitplaten hoewel uitgroei kan worden versneld door toevoeging van groeifactoren. In het algemeen zal expressie van een RNA of plasmide product leiden tot variabele expressie van cellen en daarom is er een waaier van fluorescentie expressieniveaus tussen groei kegels zijn. We hebben waargenomen RNA expressie van fluorescerende eiwitten blijven bestaan na 48 uur na uitplating, uiteraard afhankelijk van de specifieke construct.
4. Representatieve resultaten
Na het volgen van het protocol, dat wordt samengevat in figuur 1A, zal gezonde, goed-ontleed en gekweekt neurale explantaten sturen talrijke axons of neurieten in elke richting op laminine / poly-lysine substraat, getoond in figuur 1B. De groei kegels aan de uiteinden van de axonen kunnen worden afgebeeld door een DIC optiek, zie Figuur 1C, om beeld totale dynamiek motiliteit of hoge resolutie fluorescentiemicroscopie de lo onderzochtcalization van fluorescent gemerkte cytoskeleteiwitten, bijvoorbeeld, EB1-GFP in figuur 1D.
Figuur 1. Samenvatting van experimenteel protocol en de verwachte uitkomst. A) Protocol flow-chart. Zie filmpje voor meer informatie over dissectie op dag 3. De gehele neurale buis moet worden gesneden in ongeveer 20 gelijke grootte stukken en verspreid gelijkmatig in rijen op het dekglaasje. In deze cartoon, zijn schaar afgebeeld te vertegenwoordigen het snijden van het weefsel met fijn pincet. CG choriongonadotrofine B) DIC beeld van axonen of neurieten uit explantatie (explantatie in de linkerbovenhoek) groeien. C) Hogere vergroting beeld van de groei kegel aan het uiteinde van een groeiend axon. D) Fluorescentie microscopie afbeelding van EB1-GFP in de groei kegel. Scale bar 10 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Xenopus laevis neurale explantaten sturen neurieten in een robuuste wijze door 24 uur na het uitplaten van de laminine / poly-lysine substraat als de omstandigheden nodig. Met dit substraat groei kegels zijn zeer beweeglijke en kunnen axon lengtes bereiken 1 mm, die in alle richtingen naar buiten uit het explantaat, hoewel typische lengtes 100 urn of meer. Als neurieten niet groeien, zijn er een beperkt aantal redenen het geval. Een mogelijkheid is dat de neurale explantaten niet goed hechten aan de schotel. Zo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Bob Freeman bedanken voor de opleiding en de Kirschner lab voor het gebruik van de kikker faciliteit, en leden van de Van Vactor lab voor ondersteuning. Wij danken de Nikon Imaging Center aan de Harvard Medical School voor hulp bij lichtmicroscopie voor de afbeeldingen in figuur 1. Dit werk werd gefinancierd door het volgende: NRSA NIH gemeenschap en NIH K99 gemeenschap te LAL, Basic Science Partnership financiering ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) naar AEF, en NIH RO1 NS035909 naar DVV
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van de Reagens | Vennootschap | Catalogus nummer | |
| Choriongonadotrofine | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillaire Borosil Naalden 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma | F2637 | |
| Dumont # 5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11.252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek gerechten | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-1399 | |
| Laminine | Sigma | L2020 | |
| NT3 | Sigma | N1905 | |
| BDNF | Sigma | B3795 |
Referenties
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890(2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
