Genaamd Een techniek C Omprehensive M Icroarray P Olymer Profiling (CoMPP) voor de karakterisering van plantencelwand glycanen wordt beschreven. Deze methode combineert de specificiteit van monoklonale antilichamen gericht tegen bepaalde epitopen-glycan met een miniatuur microarray analyse platform zodat screening van glycan voorkomen in een breed scala aan biologische context.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Plant celwanden zijn complexe matrices van heterogene glycanen die een belangrijke rol in de fysiologie en ontwikkeling van planten te spelen en bieden de grondstoffen voor de menselijke samenleving (bv hout, papier, textiel en biobrandstof-industrie) 1,2. Echter, het begrijpen van de biosynthese en functie van deze componenten blijft uitdagend.
Celwand glycanen zijn chemisch en conformationeel gevarieerd vanwege de complexiteit van hun bouwstenen, de glycosyl residuen. Deze vormen bindingen op meerdere posities en verschillen in ringstructuur isomere of anomere configuratie, en bovendien zijn gesubstitueerd met een array van niet-suikerresten. Glycaan samenstelling varieert in verschillende cel-en / of weefseltypen of subgebieden van een celwand 3. Bovendien is de samenstelling ook aangepast tijdens de ontwikkeling 1 of in reactie op omgevingsfactoren 4.
In exproces van 2.000 genen Plant celwanden zijn complex arrays heterogene glycanen voorspeld betrokken bij celwand glycan biosynthese en modificatie in Arabidopsis 5. Echter, relatief weinig biosynthetische genen functioneel 4,5 gekarakteriseerd. Reverse genetics benaderingen moeilijk omdat de genen vaak differentieel tot expressie, vaak op lage niveaus tussen celtypes 6. Ook zijn mutant studies vaak belemmerd door gen redundantie of compenserende mechanismen om te zorgen voor passende celwand functie is 7 gehandhaafd. Zo nieuwe benaderingen nodig zijn om snel te karakteriseren van de uiteenlopende glycaanstructuren en functionele genomica gebaseerde benaderingen bevorderen om te begrijpen celwand biosynthese en modificatie.
Monoklonale antilichamen (mAbs) 8,9 naar voren zijn gekomen als een belangrijk instrument voor het bepalen van glycan structuur en de verdeling in planten. Deze herkent distInCT epitopen aanwezig in grote klassen van plantencelwand glycanen, met inbegrip van pectines, xyloglucanen, xylanen, mannanen, glucanen en arabinogalactans. Onlangs het gebruik uitgebreid tot grootschalige screening experimenten om de relatieve abundantie van glycanen bepalen in een breed scala van planten en weefseltypes tegelijkertijd 9,10,11.
Hier wordt een microarray gebaseerde glycan screening methode genaamd Comprehensive Polymer Microarray Profiling (CoMPP) (figuren 1 en 2) 10,11 die meerdere monsters kan (100 sec) worden gescreend met een geminiaturiseerde microarray platform met beperkte reagens en monstervolumes. De plek signalen op de microarray kan formeel worden gekwantificeerd aan semi-kwantitatieve gegevens over glycan epitoop optreden te geven. Deze benadering is geschikt voor het bijhouden glycan veranderingen in complexe biologische systemen 12 en een globaal overzicht van celwandsamenstelling bijzonder wanneer voorkennis of deze niet beschikbaar is.
Protocol
1. Tissue Collection & voorbereiding
- Verzamel 100 mg vers gewicht van plantenweefsels (minimaal 10 mg drooggewicht) in tenminste drievoud elk weefsel plaats. De volgende stappen beschrijven de bereiding van celwandmateriaal van vegetatieve weefsels. Bij opslagweefsels is van ongewenste zetmeel enzymatisch verwijderd alvorens de extractie van celwandpolymeren zoals eerder beschreven 13.
- Homogeniseer de monsters tot een fijn poeder met vloeibare stikstof met een Qiagen TissueLyser II, met 24 buisadapter sets en 3 mm wolfraamcarbide kralen (30 Hz, 2 x 30 sec). Alternatief indien slechts enkele monsters worden verwerkt, wordt een vijzel ge....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De relatieve overvloed van glycanen in zes weefseltypen (helmknop filamenten, pollen, eierstokken, bloemblaadjes, kelkbladen en stigmatisering) van Nicotiana alata bloemen werd bepaald met behulp CoMPP. Figuur 3A toont een representatieve microarray die is gemerkt met mAb specifiek voor JIM5 gedeeltelijk (laag) methylesterified homogalacturonan (HG), een epitoop die optreedt op pecto polysacchariden 14. De JIM5 epitoop wordt gedetecteerd in CDTA extracten van bloemen weefsels echter het grootst in po.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
CoMPP is een snelle en gevoelige werkwijze voor het profileren van de glycan samenstelling van honderden plantaardige monsters in een paar dagen. Deze methode aanvulling op de reeds beschikbare bacteriën of zoogdiercellen glycan matrix platforms voor high-throughput screening van koolhydraat interacties met glycan-binding zoals lectines, receptors en antilichamen 16. Met een grote verscheidenheid van probes voor het detecteren celwand glycanen, is het mogelijk om gedetailleerde informatie te krijgen over glyc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
IEM wil graag de Deense Raad voor Onderzoek (FTP en FNU) bevestigt de voor financiering. ERL erkent de steun van een ARC DP subsidie. AB erkent de steun van het ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls subsidie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Opmerkingen (optioneel) |
| 3 mm Tungsten Carbide kralen | Qiagen | 69997 | |
| Collection microbuisjes (1,2 mm) | Qiagen | 19560 | 1,5 ml microfugebuizen kan ook |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glasparels | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmiumoxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethaan | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulosemembraan (0,22 urn poriegrootte) | GE-Water & Process Technologies | EP2HY00010 | verschillende porie grootte membranen zijn geschikt voor verschillende pin typen |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | de Xact II robot is uitgerust met een aangepaste 20 x 20 cm keramische plaat waarop de nitrocellulose membraan is bevestigd |
| Xtend RM microarray pinnen | Labnext | 0037-350 | pennen moeten geschikt zijn voor het spotten op membranen |
| 384 goed microtiterplaten (polypropyleen) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoklonale antilichamen | Plant Sondes / CarboSource / Biosupplies | Websites; PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "target =" _blank "> www.carbosource.net) en Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ). | |
| Anti-Rat IgG (volledige molecuul) - Peroxidase antilichaam geproduceerd in geiten. | Sigma | A9037 | welk secundair antilichamen afhankelijk van de gebruikte primaire antilichaam (zoals verhoogde in rat, muis, geit enz.). |
| SIGMA FAST 3,3 '-diaminobenzidine tabletten | Sigma | D4293 | het type ontwikkelend reagens afhankelijk van de gebruikte secundaire antilichamen en de detectie (colorimetrische of chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico chemiluminescentiesubstraat | Thermoscientific | 34080 | zie hierboven |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | veel software met automatische gridding hulpmiddelen zijn beschikbaarom pixelwaarde van microarray plekken te meten. |
| Plant polysacchariden | Sigma / Megazyme |
Referenties
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
