Genaamd Een techniek C Omprehensive M Icroarray P Olymer Profiling (CoMPP) voor de karakterisering van plantencelwand glycanen wordt beschreven. Deze methode combineert de specificiteit van monoklonale antilichamen gericht tegen bepaalde epitopen-glycan met een miniatuur microarray analyse platform zodat screening van glycan voorkomen in een breed scala aan biologische context.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Plant celwanden zijn complexe matrices van heterogene glycanen die een belangrijke rol in de fysiologie en ontwikkeling van planten te spelen en bieden de grondstoffen voor de menselijke samenleving (bv hout, papier, textiel en biobrandstof-industrie) 1,2. Echter, het begrijpen van de biosynthese en functie van deze componenten blijft uitdagend.
Celwand glycanen zijn chemisch en conformationeel gevarieerd vanwege de complexiteit van hun bouwstenen, de glycosyl residuen. Deze vormen bindingen op meerdere posities en verschillen in ringstructuur isomere of anomere configuratie, en bovendien zijn gesubstitueerd met een array van niet-suikerresten. Glycaan samenstelling varieert in verschillende cel-en / of weefseltypen of subgebieden van een celwand 3. Bovendien is de samenstelling ook aangepast tijdens de ontwikkeling 1 of in reactie op omgevingsfactoren 4.
In exproces van 2.000 genen Plant celwanden zijn complex arrays heterogene glycanen voorspeld betrokken bij celwand glycan biosynthese en modificatie in Arabidopsis 5. Echter, relatief weinig biosynthetische genen functioneel 4,5 gekarakteriseerd. Reverse genetics benaderingen moeilijk omdat de genen vaak differentieel tot expressie, vaak op lage niveaus tussen celtypes 6. Ook zijn mutant studies vaak belemmerd door gen redundantie of compenserende mechanismen om te zorgen voor passende celwand functie is 7 gehandhaafd. Zo nieuwe benaderingen nodig zijn om snel te karakteriseren van de uiteenlopende glycaanstructuren en functionele genomica gebaseerde benaderingen bevorderen om te begrijpen celwand biosynthese en modificatie.
Monoklonale antilichamen (mAbs) 8,9 naar voren zijn gekomen als een belangrijk instrument voor het bepalen van glycan structuur en de verdeling in planten. Deze herkent distInCT epitopen aanwezig in grote klassen van plantencelwand glycanen, met inbegrip van pectines, xyloglucanen, xylanen, mannanen, glucanen en arabinogalactans. Onlangs het gebruik uitgebreid tot grootschalige screening experimenten om de relatieve abundantie van glycanen bepalen in een breed scala van planten en weefseltypes tegelijkertijd 9,10,11.
Hier wordt een microarray gebaseerde glycan screening methode genaamd Comprehensive Polymer Microarray Profiling (CoMPP) (figuren 1 en 2) 10,11 die meerdere monsters kan (100 sec) worden gescreend met een geminiaturiseerde microarray platform met beperkte reagens en monstervolumes. De plek signalen op de microarray kan formeel worden gekwantificeerd aan semi-kwantitatieve gegevens over glycan epitoop optreden te geven. Deze benadering is geschikt voor het bijhouden glycan veranderingen in complexe biologische systemen 12 en een globaal overzicht van celwandsamenstelling bijzonder wanneer voorkennis of deze niet beschikbaar is.
Protocol
1. Tissue Collection & voorbereiding
- Verzamel 100 mg vers gewicht van plantenweefsels (minimaal 10 mg drooggewicht) in tenminste drievoud elk weefsel plaats. De volgende stappen beschrijven de bereiding van celwandmateriaal van vegetatieve weefsels. Bij opslagweefsels is van ongewenste zetmeel enzymatisch verwijderd alvorens de extractie van celwandpolymeren zoals eerder beschreven 13.
- Homogeniseer de monsters tot een fijn poeder met vloeibare stikstof met een Qiagen TissueLyser II, met 24 buisadapter sets en 3 mm wolfraamcarbide kralen (30 Hz, 2 x 30 sec). Alternatief indien slechts enkele monsters worden verwerkt, wordt een vijzel gebruikt.
- Breng de homogenaten in 10 ml plastic conische buizen.
- Bereid celwandmateriaal door wassen van de homogenaten in 10 ml 80% v / v ethanol bij kamertemperatuur en krachtig vortexen gedurende 2 minuten.
- Centrifugeer monsters op 3.500 xg en verwijder het supernatant. Herhaal de 70% ethanol wast minstens drie keer of totdat de supernatant helder, vooral voor weefsels die chlorofyl.
- Voer een laatste wasbeurt met 100% aceton en laat de pellets die Alcohol onoplosbare residu (AIR) aan de lucht drogen.
- Zeef de luchtmonsters met een 0,4 mm 2 mesh tot een fijn, homogeen poeder te bereiken en te verwijderen grotere, slecht gemalen deeltjes die ergens blijven in de homogenaat.
- Weeg 10 mg AIR monster in microbuizen, die elk een 3 mm glaskraal het mengen van monsters steun.
2. Extractie van celwand Glycanen
- Pectinen en polymeren verbonden pectines worden uit de monsters door toevoeging van 500 ul van 50 uM CDTA (pH 7,5) aan elk monster.
- Kort vortex de buizen te zorgen het oplosmiddel in contact met het monster en meng met de TissueLyser gedurende 3 uur bij 8 Hz.
- Centrifugeer monsters bij 12.000 xg, zorgvuldig rchrap het supernatants en bewaar bij 4 ° C.
- Was pellets in 1 ml gedeïoniseerd water te verdunnen en te verwijderen alle resterende oplosmiddel, vortex en centrifugeer bij 13.000 x g. Herhaal deze stap zonder de pellet en verwijder alle vloeistof uit de buizen alvorens de volgende stap.
- Verknoping glycanen worden achtereenvolgens uit de resterende celwand pellet met 500 pi 4M NaOH met 0,1% w / v NaBH4, volgens dezelfde procedure beschreven in stap 2,1 tot 2,4 voor de extractie CDTA. NaBH4 toegevoegd aan het aldehyde (of keto) groep aan het reducerende einde van de polysachariden reduceren tot een alcohol waardoor ze base schil van polysacchariden.
- Na centrifugatie worden supernatanten weer verwijderd, bewaard bij 4 ° C en de pellets tweemaal gewassen in gedeïoniseerd water alvorens de volgende extractie.
- Als een optionele stap zijn resterende polymeren, zoals cellulose geëxtraheerd met 500 ul cadoxen (31% v / v 1,2-diaminoethane met 0,78 M CdO) volgens dezelfde procedure als beschreven in stappen 2.1 - 2.4. Als alternatief kan absoluut cellulose-gehalte in resterende pellets worden bepaald met behulp van azijnzuur / Nitric assays (zie bespreking).
3. Afdrukken Microarrays
- Centrifuge supernatanten bevattend gewonnen celwandpolymeren bij 13.000 xg om vaste deeltjes te verwijderen.
- Plaats 50 ul van elk monster in een polypropyleen 384 putjes microtiterplaat met een vooraf ontworpen aangepaste indeling waar monsters worden geordend weefseltype en extractie type.
- Verdun de celwand polymeermonster in een 0, 5 en 25 x seriële verdunningsreeks met gedeïoniseerd water.
- Parameters zoals pin hoogte, verzameling en de duur, en het wassen stappen worden ingesteld op de software die de microarrayer.
- De vochtigheid van de gedrukte kamer geregeld op 60% sample verdamping te voorkomen.
- De afdruktaak wordt gestart met behulp van LabNEXT software en een programma dat overeenkomt met de microarray layout.
- De robot gebruikt capillaire kanalen kunnen oplossingen van de monsterplaat afdrukken op 20 x 20 cm nitrocellulose membraan dat is bevestigd aan een vlakke plaat in de machine. Elke spot op de array bevat 15 nl oplossing en wordt gedrukt in drievoud.
- Identieke microarrays worden naast elkaar afgedrukt op het membraan en snijd ze in afzonderlijke arrays nadat de afdruktaak is voltooid.
- In elk experiment de arrays kunnen worden gemodificeerd om meer of minder samples, of verdunningen repliceert tegemoet.
4. Probing van Glycan Microarrays
- Na het afdrukken blokkeren individuele microarrays in 5% w / v magere melkpoeder opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (MPBS) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om niet-specifieke binding te verminderen.
- Probe microarrays met monoklonale antilichamen specifiek voor celwand glycan epitopen gedurende 2 uur in MPBS. De meeste monoklonale ANTIBodies tegen celwand glycanen zijn verkrijgbaar bij drie bedrijven; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Services ( www.carbosource.net ) en PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
- Onder een negatieve controle, een microarray geïncubeerd met alleen MPBS en geen primair antilichaam.
- Was de microarrays 3 maal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 min niet-specifieke binding te verwijderen.
- Probe de microarrays met secundair antilichaam geconjugeerd aan mierikswortel peroxidase (HRP) in MPBS gedurende 2 uur. De meeste monoklonale antilichamen tegen celwand glycanen een anti-muis of anti-rat secundair antilichamen.
- Herhaal de wasstappen 3 keer met PBS-buffer gedurende 5 min niet-specifieke binding te verwijderen.
- Ontwikkel de microarrays met behulp van chromogene (3,3-diaminobenzidine) of chemiluminecent (luminol) substraten.
5. Kwantificatie
- Na ontwikkeling, scan de individuele microarrays met behulp van een hoge-resolutie (1.200 dpi) desktop scanner en sla de afbeeldingen als negatief, 16-bits TIFF-bestanden (figuur 3).
- Bereken de integraal intensiteit van elke plaats met behulp van Xplore beeldbewerkingssoftware (LabNEXT) uitgerust met een geautomatiseerde rooster tool. De geïntegreerde intensiteit spot is afgeleid van de som van pixels in het raster omgeving vlekken.
- Het raster gegevens voor elke microarray wordt geëxporteerd als een txt-bestand en kan handmatig worden geïmporteerd in een Excel-spreadsheet voor analyse. Een online tool ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) is ontwikkeld om automatisch te vertalen en gegevens van individuele txt-bestanden te verwerken.
- De integrale plek intensiteit wordt gemiddeld over het afdrukken repliceert en verdunningen te verkrijgen van een 'gemiddelde spotintensiteit "waarde voor elk monster (figuur 2). Soms worden spot die corresponderen met slechts een verdunning waarde op de array gebruikt om de relatieve abundantie glycan epitoop voor elk monster te kwantificeren.
- De relatieve gemiddelde plek intensiteiten tussen de verschillende monsters worden gepresenteerd als een heatmap (figuur 4) met behulp van voorwaardelijke opmaak in excel of online heatmapper tools ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). De gegevens voor elk type antilichaam gecorrigeerd 100 en een 5% grenswaarde wordt opgelegd achtergrondsignaal en valse positieven verwijderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De relatieve overvloed van glycanen in zes weefseltypen (helmknop filamenten, pollen, eierstokken, bloemblaadjes, kelkbladen en stigmatisering) van Nicotiana alata bloemen werd bepaald met behulp CoMPP. Figuur 3A toont een representatieve microarray die is gemerkt met mAb specifiek voor JIM5 gedeeltelijk (laag) methylesterified homogalacturonan (HG), een epitoop die optreedt op pecto polysacchariden 14. De JIM5 epitoop wordt gedetecteerd in CDTA extracten van bloemen weefsels echter het grootst in po...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
CoMPP is een snelle en gevoelige werkwijze voor het profileren van de glycan samenstelling van honderden plantaardige monsters in een paar dagen. Deze methode aanvulling op de reeds beschikbare bacteriën of zoogdiercellen glycan matrix platforms voor high-throughput screening van koolhydraat interacties met glycan-binding zoals lectines, receptors en antilichamen 16. Met een grote verscheidenheid van probes voor het detecteren celwand glycanen, is het mogelijk om gedetailleerde informatie te krijgen over glyc...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
IEM wil graag de Deense Raad voor Onderzoek (FTP en FNU) bevestigt de voor financiering. ERL erkent de steun van een ARC DP subsidie. AB erkent de steun van het ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls subsidie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Opmerkingen (optioneel) |
| 3 mm Tungsten Carbide kralen | Qiagen | 69997 | |
| Collection microbuisjes (1,2 mm) | Qiagen | 19560 | 1,5 ml microfugebuizen kan ook |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glasparels | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmiumoxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethaan | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulosemembraan (0,22 urn poriegrootte) | GE-Water & Process Technologies | EP2HY00010 | verschillende porie grootte membranen zijn geschikt voor verschillende pin typen |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | de Xact II robot is uitgerust met een aangepaste 20 x 20 cm keramische plaat waarop de nitrocellulose membraan is bevestigd |
| Xtend RM microarray pinnen | Labnext | 0037-350 | pennen moeten geschikt zijn voor het spotten op membranen |
| 384 goed microtiterplaten (polypropyleen) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoklonale antilichamen | Plant Sondes / CarboSource / Biosupplies | Websites; PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "target =" _blank "> www.carbosource.net) en Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ). | |
| Anti-Rat IgG (volledige molecuul) - Peroxidase antilichaam geproduceerd in geiten. | Sigma | A9037 | welk secundair antilichamen afhankelijk van de gebruikte primaire antilichaam (zoals verhoogde in rat, muis, geit enz.). |
| SIGMA FAST 3,3 '-diaminobenzidine tabletten | Sigma | D4293 | het type ontwikkelend reagens afhankelijk van de gebruikte secundaire antilichamen en de detectie (colorimetrische of chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico chemiluminescentiesubstraat | Thermoscientific | 34080 | zie hierboven |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | veel software met automatische gridding hulpmiddelen zijn beschikbaarom pixelwaarde van microarray plekken te meten. |
| Plant polysacchariden | Sigma / Megazyme |
Referenties
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506(2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , In Press (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
