Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Samenvatting

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale plooien ^1,2. Hier beschrijven we een Ex vivo Explanteren assay om de cellulaire gedrag van de craniale mesenchym karakteriseren tijdens neurulatie. Deze test heeft vele toepassingen waaronder dat vatbaar is voor farmacologische manipulatie en live imaging analyses.

Samenvatting

Het centrale zenuwstelsel is afgeleid van de neurale plaat die een reeks complexe morfogenetische bewegingen als gevolg de vorming van de neurale buis in een proces dat neurulatie ondergaat. Tijdens neurulatie, wordt morfogenese van het mesenchym dat de neurale plaat ten grondslag ligt vermoedelijk neuraal voudige verhoging rijden. De craniale mesenchym bestaat uit de paraxiale mesoderm en de neurale lijst cellen. De cellen van de craniale mesenchym vormen een pourous meshwork uit stellaatcellen gevormde cellen en vermenging extracellulaire matrix (ECM) strengen die de neurale plooien ondersteunen. Tijdens neurulatie, de craniale mesenchym ondergaat stereotiepe herschikkingen leiden tot de uitbreiding en deze bewegingen worden verondersteld om een ​​drijvende kracht voor neurale voudige verhoging. Blijven echter de paden en cellulaire gedragingen die craniale mesenchym morfogenese rijden slecht bestudeerd. Interacties tussen de ECM en de cellen van de craniale mesenchym onderliggende These cel gedrag. Hier beschrijven we een ex vivo assay explant ontworpen om het gedrag van deze cellen te karakteriseren. Deze test is wijzigbaar de farmacologische manipulatie van de signaalroutes die live beeldvorming en analyses ontleden om verder te karakteriseren het gedrag van deze cellen. Wij presenteren een representatief experiment tonen de bruikbaarheid van deze assay karakteriseren van de migrerende eigenschappen van de craniale mesenchym op diverse ECM componenten.

Inleiding

Neurale buis sluiting in de schedel optreedt tussen embryonale dag 8.5 (E8.5) en 9,5 in de muis embryo. Als de neurale buis goed sluit in hoofd resultaten in anencefalie, een gemeenschappelijk structureel aangeboren afwijking bij mensen en is incompatibel is met leven. De krachten die Cephalic neurale buis sluiting rijden worden gegenereerd op basis van zowel de neurale weefsel zelf en de omringende epidermis en mesenchym ^3. Met name expansie van de craniale mesenchym wordt gedacht dat essentieel is voor verhoging van de craniale neurale plooien ^1,2. De craniale mesenchym is rijk aan ECM eiwitten met name geglycosyleerde eiwitten zoals heparine sulfaat proteoglycans, chondroïtine sulfaten en hyaluronate ^4-8.

Anders dan in het kippenembryo waar neurale cellen van de neurale buis dorsale emigreren na neurale buis sluiting de neurale in de muis embryo migreert tegelijkertijd de neurale plooien gaan rise (na de 5 somiet stadium). Dus tijdens neurulatie in de muis embryo wordt de craniale mesenchym uit cellen uit de neurale lijst en de paraxiale mesoderm. Neurale lijst en paraxiale mesoderm populaties worden geïnduceerd op verschillende momenten in de ontwikkeling, gelokaliseerd in verschillende posities in het embryo en zich ontwikkelen tot verschillende structuren ^9,10. De paraxiale mesoderm is afkomstig van de primitieve streep en migreert naar de voorste gebied van het embryo naar de vermoedelijke neurale plaat ten grondslag liggen. De neurale wordt geïnduceerd op het kruispunt van de neurale plaat en epidermale ectoderm, ondergaat een epitheliale naar mesenchym overgang en delamineert vlak voor neurale voudige verhoging in de knaagdieren embryo. Neurale lijst cellen migreren langs stereotype paden in de subectodermal paraxiale mesoderm aan de branchial boog, frontonasal en perioculaire mesenchym. De paraxiale mesoderm zal bijdragen aan een deel van de beenderen van de schedel kluis en spieren van het gezicht en dat ee neurale lijst zal bijdragen aan andere beenderen van de schedel en het gezicht in aanvulling op hersenzenuwen ^9-11. De paraxiale mesoderm en de neurale lijst lineages kan verschillend worden gekenmerkt door de Mesp1-cre en Wnt1-cre transgene muis lijnen, respectievelijk ^9.

De essentiële rol van de craniale mesenchym in neurale buis sluiting is afgeleid uit experimenten waarbij de behandeling van knaagdieren embryo's met ECM verstoren middelen zoals hyaluronidase, chondroïtinase ABC, heparitinase of Diazo-oxo-norleucine (DON) tijdens neurulatie verminderde neurale buis sluiting ^{7, 12-14.} In deze experimenten histologische analyse van vaste gedeelten na neurulatie bleek geassocieerd dysmorphogeneis van de craniale mesenchym ^7,12-14. Aangezien de teratogene stof hadden toegang tot meerdere weefsels, moet nog worden vastgesteld of de craniale mesenchym echt het doelweefsel. Ter ondersteuning van de conclusie dat dit weefselis essentieel voor neurulatie, de craniale mesenchym abnormaal lijkt op histologische analyses in sommige muizenmutanten met exencefalie ^15-17. Nog in de meeste gevallen is het effect van de mutatie op de cellulaire gedrag van de craniale mesenchym niet verholpen.

We hebben bedacht een ex vivo assay explant direct onderzoeken gevolg zijn van genetische mutatie of farmacologische manipulatie van het gedrag van craniale mesenchymcellen ^15. Deze test is vergelijkbaar met die welke door Tzahor et al 2003 de differentiatie potentieel van de craniale mesenchym toegang die ten grondslag de rhombomeres ¹⁸ behalve wij het ​​explantaat dissectie aangepast om de trekkende eigenschappen van meer anterior populaties van craniale mesenchym bestuderen die de voorzijde neurale grondslag plaat. Onze methode is ook een wijziging van explantatie testen uitgevoerd in het kippenembryo het migrerende gedrag van de neurale lijst analyseren met key verschillen. Vorige voorbereidingen geëxplanteerd de neurale lijst of de meer posterieure paraxiale mesoderm ^19,20. Verder is tijdens neurale voudige verhoging bij het kippenembryo, heeft de neurale lijst nog niet geëmigreerd uit het dorsale neurale buis en dus explantaten gehouden met de voorste paraxiale mesoderm zou niet bevatten neurale lijst cellen. In onze assay worden craniale mesenchym explantaten bestaande uit paraxiale mesoderm, neurale en oppervlakte ectoderm bereid en uitgeplaat op een substraat. Experimentele manipulatie inclusief isolatie van explantaten van genetische mutanten, plating explantaten op verschillende ECM of farmacologische behandelingen kunnen worden uitgevoerd. Cellen migreren van de explantatie en de afstand, het aantal en het gedrag kan worden geanalyseerd en vergeleken tussen de behandelingsgroepen. Bovendien, dit preparaat amendeerbaar voor een analyse van cellulaire migratie door levende beeldvormingstechnieken. Na de migratie experiment, kan explantaten worden vastgesteld en onderworpen aan immunohistochemische analyses te bontpoort aansluiten verduidelijken het effect van behandelingen. Over het algemeen de hier gepresenteerde protocol is een eenvoudige ex vivo assay om het gedrag van de craniale mesenchym onderzoeken. Als een representatief experiment gebruiken we deze assay de migratie van craniale mesenchym op verschillende extracellulaire substraten onderzocht.

Protocol

1. Voorbereiding van ECM Coated Cultuur gerechten of Dekglaasjes

1. Bereid ECM stock oplossing door oplossen ECM substraat in PBS (Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing, Invitrogen, # 14040-133). Filtreer een 0,2 mm spuitfilter (VWR, # 28145-495) en vries in aliquots bij -80 ° C.
2. Verdun ECM stock oplossing in PBS gewenste concentratie. Voor MaxGel verdunnen in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen, # 11995-065).
3. Als immunofluorescentie zal worden uitgevoerd, steriliseren 12 mm ronde dekglaasjes (VWR, # +89,015-724) door dompelen in ethanol en laat aan de lucht drogen. Dit dient te gebeuren in de steriele laminaire kap. Als immunofluorescentie wordt niet uitgevoerd doorgaan naar 1,5 stap.
4. Plaats gesteriliseerd dekglaasjes in elk putje van een plaat met 24 putjes (Corning, # 3526).
5. Voeg 0,5 ml van het verdunde substraatoplossing aan elke well van 24 wells-plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
6. Zuig uit de ECM-oplossing en was three keer in PBS.
7. Aspireren uit PBS en gebruik onmiddellijk of verpakt in parafilm en bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.

2. Voorbereiding van Dissectiemateriaal

Sylgard platen met toegevoegde houtskool worden bereid volgens het protocol van de fabrikant. De resistente zwarte achtergrond van deze platen biedt ondersteuning voor beetgepakt het embryo en de kleur biedt een goed contrast dat vergemakkelijkt het visualiseren van de doorschijnende embryo.

1. Om platen te bereiden wegen direct in een tri-giet bekerglas op een evenwicht 150 g, deel A, vloeibare 15 g deel B en 1 g houtskool poeder (World precisie-instrumenten, # SYLG184). Meng met behulp van een houten ijslolly stok of tongspatel. Giet in glazen of plastic 100 cm gerechten. Gebruik een kleine butaan fakkel gehouden ongeveer 10 tot 12 centimeter boven de gerechten te branden uit alle bubbels. Plaats deksels op platen en laat zitten voor ten minste 24 uur in te stellen.
2. Om dissectie-instrumenten voor te bereiden insert een Minutien pin (0,1 mm diameter) in een penhouder (schone wetenschappelijke instrumenten, # 26002-10 en # 26018-17, respectievelijk) alternatief 26 gauge naalden (BD, # 309597) rechthoekig omgebogen met behulp van forceps kan worden gebruikt als ontleden instrumenten. Geslepen Student Dumont # 5 tang (Fine Science Tools, # 91150 tot 20) met behulp van een slijpsteen (Fine Wetenschappelijke Gereedschappen, # 29,008-22).
3. Steriliseer alle dissectie-instrumenten met 70% ethanol voor gebruik.

3. Winnen van embryo

1. Euthanaseren de getimede zwangere muis op 8,5 dagen na coitum volgens het gebruik van dieren commissie regelgeving en verwijderen baarmoeder.
2. Plaats baarmoeder in een plastic petrischaal met steriele PBS.
3. Ze wast baarmoeder met steriele PBS.
4. Onder een dissectie microscoop verwijder embryo van deciduas met behulp van een pincet.
5. Verwijder extra-embryonale membranen en sparen voor genotypering indien nodig.
6. Stage embryo door het tellen van somieten. De ideale stappen om explantaten voor cellulaire analyse behAvior tijdens neurale voudige verhoging zou zijn tussen de 6 en 10 somiet stadia, wanneer de neurale plooien net beginnen te verheffen en voor de grote morfogenese van de craniale mesenchym plaatsvindt.
7. Was embryo in PBS. Leg ze in een zwarte Sylgard plaat met DMEM dat er geen fenol rood (Invitrogen, # 21.063-029) bevat. Verwijder de extra-embryonale membranen en sparen voor genotypering indien nodig.

4. Bereiding van explantaten

1. Heroriëntatie de microscoop bij de maximale vergroting over het hoofd gebied van de embryo.
2. Maak sneden met een dissectie naald in elke hand. Gebruik een naald om het weefsel op zijn plaats en de andere ingedrukt om bezuinigingen te maken.
3. Snijd de kop van het embryo anterior aan de rhombomeres.
4. Knip langs de middellijn aan het hoofd halveren in twee gelijke helften.
5. Snijd rond de buitenste rand van het hoofd en middellijn. Deze besparingen zullen verwijderen van de premigratory kuif en de oppervlakte ectoderm aan de buitengrens ende prechordale plaat op de middellijn. De resterende weefsel het explantaat en zal de migratie craniale neurale paraxiale mesoderm en ectoderm oppervlak bevatten.
6. Omdat het weefsel wordt gesneden, verwijder ontleed puin van de schaal met behulp van een steriele pasteur pipet. Dit voorkomt verwarring het explantaat met puin ontleed.
7. Voorzichtig wassen de explantatie door pipetteren op en neer met een 20 ul pipet tip en Pipetman. Hiermee verwijdert u losjes bevestigde cellen en het voorkomen van scherpe randen op de explantaten.
8. Zorgvuldig halen elk explantaat in ongeveer 10 ui vloeistof met een 20 pi pipetpunt en Pipetman en in het middelpunt van de beklede kweekputje.
9. Voeg 20 ul kweekmedium aangevuld met 15% FBS om de explant dekken.
10. Plaat in een bevochtigde weefselkweek incubator _(5% CO2, 37 ° C) gedurende 1-2 uur om het explantaat te hechten aan de bodem van de schaal. Zie regelmatig dat de explant niet uitdroogtuit.
11. Wanneer het explantaat is bevestigd, Voeg aan elk putje 250 ui DMEM aangevuld met 10% FBS dat is verwarmd tot 37 ° C in een waterbad. Zodra explantaten hebben bevestigd dat ze niet bewegen wanneer plaat wordt voorzichtig geschud onder de microscoop.
12. Terug schotel naar weefselkweek incubator.
13. Na 24 uur wordt de explantaten stevig zijn bevestigd en cellen begint te emigreren. Momenteel farmacologische middelen kunnen worden toegevoegd aan de media.
14. 48 uur na het plateren zullen cellen gemigreerd van de explantaten. Gemigreerd De afstand kan worden gevisualiseerd en afgebeeld. We normaal gesproken niet meer de cultuur op dit punt sinds explantaten beginnen te tekenen van verminderde levensvatbaarheid met een langere incubaties tonen. Een vitale kleurstof zoals acridine oranje of trypan blue kan ook worden gebruikt om de levensvatbaarheid van het explantaat controleren.
15. Op dit punt beelden kunnen worden verkregen om de afstand en aantal cellen die migreren uit de explantaat documenteren. Als alternatief werden als explantaten uitgeplaat op dekglaasjes,ze kunnen worden vastgesteld en immunohistochemische analyses uitgevoerd om eiwitten van belang te visualiseren.

Kritische stappen in het protocol

1. Snij explantaten van ongeveer dezelfde grootte.
2. Wis alle dissectie puin van de dissectie plaat als u ontleden tot verwarrende puin te vermijden met de gewenste geëxplanteerd weefsel.
3. Wanneer plating explantaten in putten of op dekglaasjes moet u druppel media plaatsen bij explantatie in het centrum van goed.
4. Laat explanteren voldoende tijd te bevestigen voordat overstromingen het goed met media.
5. Behandeling voorwaarden moeten worden gestandaardiseerd voor elke test substraat en farmacologisch middel gebruikt.
6. Twee explantaten kan van elk embryo (van links en van rechts van de neurale buis).
7. Bij het testen migratie van cellen uit mutantmuis lijnen onder verschillende experimentele condities, zet een mutant explant in de controlegroep en de andere in de behandelde groep.

Problemen oplossen

1. Als explantaten niet bevestigen, verhoging van de toegestane tijd voor de bevestiging. In onze ervaring, denk ongeveer de helft van de explantaten niet bevestigen en grotere explantaten zich efficiënter.
2. Als explantaten hechten aan de omtrek van de put zullen zij moeilijk beeld. Zorg ervoor dat explantaten plaatsen in het midden van de put.
3. Idealiter explantaten zal ongeveer van dezelfde grootte zijn. Desalniettemin kunnen afwijkingen in explant maat worden gecorrigeerd met de diameter van de explantaten als correctiefactor bij quanitating migratie van cellen uit explantaten.
4. Mocht contaminatie optreden zeker steriele werkomstandigheden worden gebruikt. Alle gereedschappen en werkoppervlakken moeten worden gesteriliseerd met 70% ethanol. Pipetten en petrischaaltjes moeten nieuw zijn en steriel.
5. Als explantaten krijgen verloren tijdens de dissectie, periodiek verwijderen van afval tegen het verlies van explantatie.
6. Het beheersen van de dissectie is tijdrovend en vergt oefening. Optimal vergroting, scherpe dissectie-instrumenten en naalden hulp.

Resultaten

Het verschijnen van cellen migreren van craniaal mesenchym explantaten is getoond in figuur 2. We testten migratie op diverse ECM substraten die aanwezig zijn in de schedelholte mesenchym tijdens neurulatie zoals fibronectine (100 mg / ml; Sigma # F1141), laminine (100 mg / ml; Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 verdunning in DMEM ; Sigma # E0282) en hyaluronzuur (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Cellen niet te migreren van het explantaat wanneer er geen ECM aanwezig is (gegevens niet getoond) en alle substraten getest ondersteunde migratie van de cellen. Zowel de vorm en de grootte van cellen die migreren uit de explantaten afhankelijk van de ondergrond. Dit is verwacht aangezien eerdere studies blijkt dat de mechanische krachten die ontstaan ​​door interactie van cellen met verschillende ECM zowel de vorm als trekkende eigenschappen van cellen ²¹ te beïnvloeden.

Figuur 1. Voorbereiding van explantaten. (A) Om explantaten voor te bereiden, zijn E8.5 embryo's ontleed uit deciduas en extra-embryonale weefsels. (B) Embryo koppen geprepareerd uit het lichaam anterior de rhombomeres. Explantaten worden bereid door verwijderen van weefsel van de middellijn en de buitenranden van het hoofd naar prechordale plaat verwijderen op de middellijn en de premigratory neurale en ectoderm oppervlak aan de grens, respectievelijk. (C) Explantaten worden bereid door het wegsnijden van weefsel van de middellijn en buitenste randen van het hoofd naar prechordale plaat verwijderen op de middellijn en de premigratory neurale en oppervlakte ectoderm aan de grenzen. (D) Explantaten worden in een klein volume media ECM beklede schalen / coverslips en toegestaan ​​te hechten vóór toevoeging van meer media.

Figuur 2. Migratie van craniale mesenchymcellen van explantaten geplaat op verschillende substraten. Explantaten werden uitgeplaat op fibronectine, laminine, MaxGel ECM of hyaluronzuur en gefotografeerd na 48 uur in cultuur. Grootte bar = 200 mm.

Discussie

De toegepaste methode hier een krachtige assay om het gedrag van craniale mesenchymcellen onderzoeken. Naast de statische analyses hier gepresenteerde experimenten imaging leven helderveld of in combinatie met expressie van GFP-gemerkte eiwitten kunnen worden gebruikt om het gedrag van cellen in real time onderzoeken als ze migreren uit het explantaat. Voor levende imaging experimenten konden explantaten worden gelabeld met DiI of migratie van neurale onderscheiden van de paraxiale mesoderm, ROSA-YFP, Mesp1-cre of ROSA-YFP, Wnt1-cre of andere transgene lijnen kunnen worden gebruikt. Cranial mesenchym-ECM interacties kunnen ook worden onderzocht gebruik te maken van deze explantatie test. Hier plaat explantaten op verschillende ECM substraten die aanwezig zijn in de schedelholte mesenchym aangetoond dat cellen die migreren in verschillende mate en de ECM beïnvloedt de morfologie van de cellen. Bovendien kunnen explantaten worden ingebed in een driedimensionale matrix om het gedrag van cel openenls in deze context. Deze assay is wijzigbaar explant de analyse van het effect van genetische en farmacologische manipulaties op craniale mesenchym gedrag om intrinsieke en extrinsieke signalen die kunnen reguleren en wijzigen migratie analyse. Zo gebruikten we deze assay in onze studies om de rol van overtollige Hsp90 secretie onderscheiden in het abnormale cellulaire gedrag in Hectd1 mutant craniale mesenchym ^15. In deze experimenten, behandelden wij explantaten met anti-Hsp90 antilichaam, Hsp90 eiwit geldanamycine en DMA (dimethyl amelioride) om secretie van Hsp90 te tonen dat het abnormale gedrag van Hectd1 mutant cellen door overmatige extracellulaire Hsp90 ¹⁵ blokkeren. Soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt om extra farmacologisch ontleden pathways onderliggende normaal of abnormaal morfogenese van de craniale mesenchym. Nadat de assay is voltooid, kan explantaten en migrerende cellen worden geanalyseerd door een groot aantal methoden. Bijvoorbeeld immunohistochemische analyses cEen worden om lokalisatie van eiwitten belangrijk voor celbewegingen onderzoeken. Transcriptoomanalyses kunnen ook worden gebruikt om te bepalen hoe behandelingen genexpressie beïnvloeden.

Een belangrijke beperking van deze techniek is dat het niet model gedrag in drie dimensies omdat zij voorkomen in vivo. Modificatie van het protocol waarbij explantaten worden in een driedimensionale matrix (bijv. matrigel) ingebed met expressie van fluorescent protein gemarkeerde cellulaire compartimenten kunnen worden gebruikt moet dit probleem. Zelfs indien deze wijzigingen uitgevoerd, verdere experimenten gedrag gezien in deze ex vivo assay met de in vivo correleren noodzakelijk. Andere beperkingen zijn het grote aantal embryo's moet voldoende statisch significante gegevens te genereren. Het belangrijkste is dat de dissectie is relatief eenvoudig, het vereist de praktijk te beheersen.