High Throughput Sequentiële ELISA voor de validatie van biomarkers van acute graft-versus-Host ziekte

Samenvatting

High throughput validatie van meerdere kandidaat biomarkers kan worden uitgevoerd door opeenvolgende ELISA om vries / ontdooi cycli te minimaliseren en het gebruik van kostbare plasmamonsters. Hier laten we zien hoe u achtereenvolgens ELISA's voor zes verschillende gevalideerde plasma biomarkers te voeren ^{1 tot 3} Of graft-versus-host disease (GVHD) ⁴ Op hetzelfde plasma monster.

Samenvatting

Onpartijdige ontdekking proteomics strategieën de mogelijkheid om grote aantallen van nieuwe biomarkers die diagnostische en prognostische testen kan verbeteren in een klinische setting en kan helpen sturen therapeutische interventies. Wanneer grote aantallen kandidaat-eiwitten geïdentificeerd, kan het moeilijk zijn om kandidaat biomarkers in een tijdige en efficiënte wijze valideren van patiënt plasmamonsters die gebeurtenisgestuurde van eindige volume en onvervangbaar, zoals aan het begin van acute graft-versus- host disease (GVHD), een potentieel levensbedreigende complicatie van allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT).

Hier beschrijven we het proces van het uitvoeren handel verkrijgbare ELISA gevalideerd GVHD zes eiwitten: IL-2Ra ^5, TNFR1 ^6, HGF ^{7, IL-8} 8, elafin ² en REG3α ³ (ook bekend als PAP1) in een sequentiële wijze te minimaliseren vries-dooi cycli, Ontdooid plasma-tijd-en plasma gebruik. Voor deze procedure voeren wij de ELISA's in de juiste volgorde, zoals bepaald door monster verdunningsfactor zoals bepaald in ons laboratorium met behulp van fabrikant ELISA-kits en protocollen met kleine aanpassingen om een ​​optimale sequentiële ELISA te vergemakkelijken. De resulterende plasma biomarker concentraties kan dan worden samengesteld en geanalyseerd op significante bevindingen binnen een patiëntenpopulatie. Hoewel deze biomarkers zijn op dit moment alleen voor onderzoeksdoeleinden, wordt de opname daarvan in de klinische zorg op dit moment onderzocht in klinische studies.

Deze techniek kan worden toegepast op ELISA voor meerdere eiwitten / cytokines plaats uitvoeren op hetzelfde monster (s) die de monsters niet te worden gemengd met andere reagentia. Als ELISA kits komen niet met pre-beklede platen met 96 putjes half putjes of 384 putjes gebruikt kan worden ter minimalisering gebruik van monsters / reagentia.

Inleiding

Acute graft-versus-host disease (GVHD), een belangrijke oorzaak van niet-terugval sterfte (NRM) na allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT), wordt gemeten door disfunctie in drie orgaansystemen: de huid, lever en gastro-intestinale (GI) darmkanaal ^4. Acute GVHD gebeurt meestal twee tot acht weken na transplantatie maar kan later optreden en vaak klinisch onderscheiden van andere post-HSCT complicaties zoals conditionering toxiciteit, infectie of bijwerkingen van medicijnen. Door het gebruik van proteomische strategieën en high-throughput validatie sequentiële ELISA hebben we vastgesteld 6 eiwitten waarvan concentraties worden verhoogd bij het begin van klinische manifestaties van GVHD. IL-2Ra, TNFR1, HGF en IL-8 in combinatie in een 4-biomarker panel kan diagnosticeren GVHD bij het ​​begin van klinische symptomen en kan na HSCT overleving voorspellen onafhankelijk van GVHD ernst ^1. Elafin, een biomarker voor GVHD van de skin, onderscheid kan maken tussen GVHD huiduitslag en huiduitslag door andere oorzaken, zoals drug uitbarstingen en kan transplantatie overleving ² te voorspellen. We hebben onlangs geïdentificeerd REG3α als biomarker van GVHD van de lagere maag-darmkanaal, het doelorgaan het meest geassocieerd met NRM. Plasma REG3α concentratie op betrouwbare wijze kan identificeren GVHD als de oorzaak voor post-HSCT diarree en correleren met histologische ernst van GVHD op diagnostische darm biopten. REG3α concentraties op GI GVHD begin kan ook voorspellen respons op GVHD therapie en NRM ^3. De incorporatie van deze gevalideerde GVHD biomarkers in de klinische zorg wordt momenteel onderzocht in klinische studies.

Deze experimenten werden uitgevoerd op kleine plasma monsters verzameld van patiënten die HSCT tussen 2000 en 2010 op het moment van GVHD optreden die onvervangbaar en beperkte hoeveelheid. Door de kostbare aard van deze monsters hebben we een gehaaldhod meten van meerdere plasma eiwitconcentraties op een efficiënte en reproduceerbare wijze overtollige vries-dooi cycli, ontdooien tijd en plasma gebruik elimineren. Deze techniek kan worden toegepast op ELISA voor meerdere eiwitten / cytokines plaats uitvoeren op hetzelfde monster (s) die de monsters niet te worden gemengd met andere reagentia. Als ELISA kits komen niet met pre-beklede platen met 96 putjes half putjes of 384 putjes gebruikt kan worden ter minimalisering gebruik van monsters / reagentia. Dit manuscript is gericht op de technologische aspecten van het meten van GVHD biomarkers.

Protocol

1. Experiment Dag 0: Monstervoorbereiding en ELISA Test Plaat Coating met Capture Antilichaam voor IL-2Ra, REG3α en HGF

1. Plasma hoeveelheid te analyseren monsters worden getrokken, ontdooid en gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 10 min om de stolsels scheiden onderaan en bovenaan lipiden uit het plasma. 150 pi van onverdund plasma wordt van elk monster uitgeplaat op een 96-well V-bodem plaat (source plaat) door handmatige pipetteren volgens vooraf bepaalde kaarten. De monsters worden verpakt in parafilm en bewaard in een vochtige kamer bij 4 ° C gedurende het gehele proces, niet langer dan 72 uur.
2. IL-2Ra en HGF invangantilichamen wordt opgelost en verdund per fabrikantspecificatie en 50 ul wordt uitgeplaat in elk putje van de respectieve 96-well hoge binding half-well platen, die vervolgens worden afgedicht en overnacht geïncubeerd bij 4 ° C. Ook kunnen vele platen worden gedroogd bij 37 ° C en opgeslagen bij 4 ° C voor later gebruik, afhankelijkIng op de stabiliteit van het eiwit.
3. REG3α invangantilichaam wordt verdund volgens fabrikant protocol gebruikt fabrikant coating buffer en 25 pi worden uitgeplaat in elk putje van een 384 putjes Nunc Maxi-SORP plaat die vervolgens wordt afgesloten en een nacht geïncubeerd bij 4 ° C.

2. Experiment Dag 1: IL-2Ra ELISA (figuur 1)

1. De IL-2Ra testplaat wordt gewassen, geblokkeerd met BLOTTO in TBS en de standaard wordt opgelost en een 8-punts standaard curve wordt bereid per fabrikant protocol.
2. Na wassen van de plaat na de blokkeringsstap wordt 50 pi onverdund plasma uitgeplaat in tweevoud van de bron plaat aan de ELISA plaat, en 50 pi van elk van de uitgeplaat in tweevoud. De plaat wordt afgedicht en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een rotator plaat ingesteld op 300 rpm.
3. Het plasma wordt teruggewonnen uit de IL-2Ra ELISA plaat en teruggeplaatst in het unverdund plasma bron plaat. De ELISA wordt voltooid per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd.

3. Experiment Dag 1: REG3α ELISA (figuur 1)

1. 10 pi van onverdund plasma wordt overgebracht naar een afzonderlijk v-bodem source plaat. 90 ul van de fabrikant geleverde verdunningsbuffer toegevoegd aan elk putje om een ​​1:10 verdunning bron plaat maken.
2. De REG3α ELISA wordt uitgevoerd per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor 384-wells platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een bord lezer ingesteld op 450 tot 620 nm, en de gegevens worden opgeslagen en geanalyseerd.

4. Experiment Dag 1: Elafin en TNFR1 Test Plaat Coating met Capture Antilichaam

1. Elafin en TNFR1 capture antilichamen zullen opnieuw worden samengesteld en dildeeld per fabrikantspecificatie en 50 ul wordt uitgeplaat in elk putje van de respectieve 96-well hoge binding half-well platen, die vervolgens worden afgedicht en overnacht geïncubeerd bij kamertemperatuur Elafin en bij 4 ° C gedurende TNFR1.

5. Experiment Dag 1-2: HGF ELISA (figuur 1)

1. Na de IL-2Ra ELISA en verzekeren de test niet te worden herhaald, wordt 60 pl onverdund plasma overgebracht naar een nieuwe bron plaat en dan 60 pi 1% BSA in 1 x PBS wordt aan elk putje toegevoegd om te verdunning 1:2 plasmabron plaat.
2. De HGF testplaat wordt gewassen, geblokkeerd met BLOTTO in TBS en de standaard wordt opgelost en een 8-punts standaard curve wordt bereid per fabrikant protocol.
3. Na wassen van de plaat na de blokkeringsstap wordt 50 pl van 1:2 verdunde plasma uitgeplaat in tweevoud op de ELISA plaat, en 50 pi van elk van de uitgeplaat in tweevoud. De plaat wordt afgesloten enovernacht geïncubeerd bij kamertemperatuur op een rotator plaat ingesteld op 300 RPM.
4. De verdunning 1:2 plasma wordt teruggewonnen uit de HGF ELISA-test plaat en terug geplaatst in de verdunning 1:2 plasmabron plaat. De ELISA wordt voltooid per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd.

6. Experiment Dag 2: Elafin ELISA

1. 10 pi van onverdund plasma wordt overgebracht naar een nieuwe bron plaat en 190 pi 1% BSA in 1 x PBS wordt aan elk putje toegevoegd aan 200 ul plasma dluted 1:20 maken.
2. De Elafin ELISA uitgevoerd volgens fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd.

7. Experiment Day 2: ELISA TNFR1

1. 25 pi van 1% BSA in PBS toegevoegd aan de source 1:20 plaat (nu met 100 ul van 1:20 plasma) aan 125 ui van 1:25 verdund plasma verkrijgen.
2. De TNFR1 ELISA voltooid per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen met behulp van een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd.

8. Experiment Dag 2: IL-8-ELISA

1. 60 pl van 1:2 verdunde plasma wordt overgebracht naar een nieuwe bron plaat en vervolgens 180 ul van IL-8 verdunningsmiddel toegevoegd aan elk putje om een ​​1:6 verdunde plasma bron plaat te maken.
2. De IL-8 ELISA voltooid per fabrikant protocol (met volumes aangepast voor half-well platen) en de optische dichtheid van elk putje wordt gelezen door een plaatlezer ingesteld op 450-570 nm worden, en de gegevens opgeslagen en geanalyseerd.

Zodra alle ELISA's zijn afgerond, unused stock plasma wordt teruggeplaatst in de ontdooide monsters en ingevroren voor toekomstig gebruik.

Resultaten

De biomarker workflow en de tijdlijn worden gedetailleerd beschreven in tabel 1 en tabel 2, respectievelijk. Na voltooiing concentraties van 6 verschillende eiwitten zijn nu gekwantificeerd op dezelfde plasmamonster met een totaal van 150 pi plasma. Plateren de monsters in duplo per test zorgt voor interne kwaliteitszorg, met CV's minder dan 10% zijn optimaal. Als het uitvoeren van de opeenvolgende ELISA op meerdere platen, consistente optische dichtheid van het hoge niveau en de voorkeur voor verbeterde inter-plate betrouwbaarheid van de metingen; standaardcurve ODs worden vergeleken tussen de platen te zoeken beoordelen inconsistentie in ELISA resultaten (figuur 2). Ontwikkeltijden met colorimetrisch substraat tetramethylbenzidine en hoge concentratie ODs waargenomen voor elk biomarker in ons laboratorium zijn vermeld in tabel 3.

tp_upload/4247/4247fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "/>
Figuur 1. Workflow voor IL-2Ra, REG3α en HGF ELISA. Na de plasmamonsters werden uitgeplaat op de IL-2Ra ELISA platen wordt teruggevraagd verdunning bron platen maken voor andere ELISA. Voor de HGF ELISA, wordt het plasma teruggewonnen om de 1:06 verdunning plaat voor te bereiden voor IL-8. Klik hier voor een grotere afbeelding .

Figuur 2. Optische dichtheid voor de standaardcurve van 7 verschillende ELISA platen van REG3α concentraties overeenkomend met de 1084 patiënten getest voor de eerste REG3α GI GVHD biomarker verslag ^3. Consistent ODs tussen de platen zodanig zijn dat eiwitconcentratie gemeten tussen de platen. Concentraties van eiwittenin plasmamonsters worden berekend door monster optische dichtheden bij de standaardkromme optische dichtheden.

Experiment Dag 0	1. Bereid monsters
	2. IL-2Ra, HGF en REG3α capture Ab
Experiment Dag 1	1. IL-2RαELISA
	2. REG3αELISA
	3. HGF ELISA (via sample plating)
	4. Elafin en TNFR capture Ab
Experiment Dag 2	1. HGF ELISA voltooiing
	2. Elafin ELISA
	3. TNFR1 ELISA
	4. IL-8 ELISA
	5. Opnieuw invriezen ongebruikteplasma

Tabel 1. GVHD Biomarker Workflow Overzicht

Day 0		Monstervoorbereiding en overnachting capture lichaam incubatie
ELISA		IL-2Ra	REG3α	HGF	Elafin	TNFR1	IL-8
(Uur)	0,0	Het blokkeren van
	1,0	Plated Monsters
	3,0	Reclaim plasmamonsters; Detectie Ab	Het blokkeren; Prepare Monsters (1:10 verdunning)
	4,0		Monsters plated (1:10)
	5,0	Streptavidine-HRP	Detectie Ab
	5,5	TMB	Streptavidine-HRP
	6,0	Plate Reading	TMB	Het blokkeren; Prepare monsters (1:2 verdunning)
	6,5		Plate Reading
	7,0			Monsters plated (1:2)	Capture Ab (incubatie gedurende de nacht)	Capture Ab (incubatie gedurende de nacht)
Dag 2
(Uur)	0,0			Reclaim plasma, detectie Ab	Het blokkeren; Prepare monsters (1:20)
	1,0				Sample plating (1:2)	Blokkeren; Verdere verdunning van 1:20 tot 1:25 verdunning samples
	2,0			HRP		Sample plating (1:25)
	2,5			TMB
	3,0			Plate Reading	Detectie Ab
	3,5						Bereid monsters (1:6 verdunning)
	4,0					Detectie Ab	Sample plating (1:6)
	5,0				HRP
	5,5				TMB
	6,0				Plate Reading	HRP	Detectie Ab
						TMB
	7,0					Plate Reading	TMB
	7,5						Plaat lezen
Na voltooiing		Vervang bron plasma in porties en vries voor later gebruik

Tabel 2. Tijdlijn voor het uitvoeren van ELISA's.

	Plasma Verdunningsfactor	High Standard Concentratie	Substraat Ontwikkeling Tijd (min)	Hoge OD	Curve
IL-2Ra	01:01	2000 pg / ml	5	1	Lineair
HGF	01:02	4000 pg / ml	22	2,1	4-parameter
IL-8	01:06	200 pg / ml	12	2,7	4-parameter
REG3α	01:10	100 ng / ml	12	1,7	4-parameter
Elafin	01:20	2000 pg / ml	20	1,9	4-parameter
TNFR1	01:25	800 pg / ml	8	2,7	Lineair

Tabel 3. ELISA Details voor 6 GVHD Biomarkers.

Discussie

De sequentiële ELISA methode hier gepresenteerde maakt meting van meerdere plasmaeiwitten op kleine hoeveelheden plasma die moeilijk te verkrijgen en / of onvervangbare zoals monsters uit proefpersonen met zeldzame ziekten of plasmamonsters verkregen van muizen ^9,10. De sequentiële ELISA wordt typisch uitgevoerd in de volgorde van toenemende plasma verdunningsfactor met ELISA waarbij plasma verdund ≥ 1:10 doorgaans niet om worden teruggewonnen, hoewel dit kan indien gewenst. Het vermogen om sequentiële ELISA voeren wordt beperkt door ELISA kits / protocollen waarin het plasma wordt gemengd met andere reagentia of waarvoor verschillende verdunning buffers nodig zijn voor het plasma, deze sluit de ablility opnieuw een steekproef vanwege zorgen dat een incompatibele buffer / reagens interfereren met de uitvoering van een bepaalde test. Met zorgvuldige planning kan 10 of meer ELISA uitgevoerd op dezelfde plasmamonster.

ent "> elk laboratorium wellicht plasmaverdunningen passen om interpreteerbare resultaten gebaseerd op de verwachte plasmaconcentratie van het eiwit van interesse in de monsters van de proefpersonen hebben. Verschillen in laboratoriumapparatuur kan resulteren in de noodzaak om incubatie en colorimetrische ontwikkeling te verbeteren tijden, het aantal wassingen en / of was uitzettijden om een ​​bepaalde ELISA optimaliseren.

Met hoge doorvoercapaciteit en nauwkeurigheid vergroten en analyses in een kosteneffectieve wijze, het gebruik van een robot vloeistofverwerking platform kan analyse van platen met 384 putjes en een automatische plaatwasser met stapelblok aanbevolen. Deze apparatuur kan de nauwkeurigheid en juistheid van de analyse uitgevoerd door meerdere gebruikers, en hulp te bieden consistentie van analyse tot inter-en intra-assay variatie te verminderen.

We gebruikten sequentiële ELISA dan beschikbaar multiplex platforms om twee redenen: 1) Het merendeel van deantilichaam paren voor nieuwe eiwitten kunnen niet gemakkelijk worden geconjugeerd aan kralen of ander materiaal, alsmede tijdrovend en duur; 2) individuele ELISA-assays zijn nauwkeuriger dan multiplex microarray of kralen, secundair aan een gebrek aan cross-reactiviteit ^11. Indien er een betrouwbare methode aangetoond gemultiplext, bead-based microarrays vervullen, kan hij in staat om de sequentiële ELISA proces te vervangen, maar zijn beperkt door het vermogen om de antilichamen te conjugeren kralen en / of door het aantal gewenste eiwitten te geanalyseerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Humaan IL-2 R alpha Duoset	R & D Systems	DY223
Menselijke HGF Duoset	R & D Systems	DY294
Menselijk IL-8 OptEIA KIT II	Becton Dickinson	550999
Ab-Match MONTAGE Human PAP1 (REG3α) Kit	MBL International	5323
Ab-Match UNIVERSAL Kit	MBL International	5310
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset	R & D Systems	DY225
Human Trappin-2/Elafin Duoset	R & D Systelen	DY1747
96-well platen polystyreen conische bodem	Thermo Scientific	249570	Wordt gebruikt voor plasma-source platen
Costar half-en high-binding 96-well platen	Corning	3690	Voor IL-2Ra, HGF, TNFR1 en elafin ELISA
Nunc 384-wells platen MaxiSorp	Nunc	464718	Voor REG3α Elisa
HyClone fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1x	Thermo Scientific	SH30256.02
Runderserumalbumine, fractie V, behandeld Heat Shock	Fisher Scientific	BP1600-100
Blocker BLOTTO in TBS	Thermo Scientific	37530	Blokkerend middel voor IL-2Ra HGF en TNFR1 ELISA's
Dulbecco'sFosfaat gebufferde zoutoplossing	Gibco	21600-069	Wasbuffer voor IL-2Ra, HGF, Elafin en TNFR1 ELISA
TMB Peroxide Susbtrate	Kirkegaard en Perry Laboratories	50-76-00
Tween 20	Acros Organics	233362500	Wasbuffer voor IL-2Ra, HGF, Elafin en TNFR1 ELISA
Zwavelzuur	Sigma-Aldrich	84720	(Verdund tot 2N) voor stop-oplossing