Het gebruik van LysoTracker tot geprogrammeerde celdood detecteren in embryo's en differentiëren van embryonale stamcellen

Samenvatting

Wij presenteren een eenvoudig protocol om gebieden van geprogrammeerde celdood (PCD) in muizenembryo's en onderscheidende embryonale stamcellen (ES) celkweken met een sterk oplosbare kleurstof genoemd LysoTracker visualiseren.

Samenvatting

Geprogrammeerde celdood (PCD) voor bij volwassenen met normaal weefsel homeostase en tijdens embryonale ontwikkeling aan weefsels en organen ^1,2,6,7 vorm. Tijdens de ontwikkeling kan giftige chemicaliën of genetische veranderingen veroorzaken een toename van de PCD of wijzigen PCD patronen resulteert in ontwikkelings-afwijkingen en aangeboren afwijkingen ^3-5. De etiologie van deze gebreken begrijpen, kunnen de studie van embryo's aangevuld met in vitro assays die gebruik differentiëren embryonale stamcellen (ES) cellen.

Apoptose is een goed bestudeerde vorm van PCD dat zowel intrinsieke en extrinsieke signalering naar de caspase enzym cascade activeren omvat. Kenmerkend cel veranderingen omvatten membraan blaarachtig, nucleaire krimpen, en DNA-fragmentatie. Andere vormen van PCD niet betrokken caspase activiteit en kan het eindresultaat van langdurige autofagie. Ongeacht de route PCD, stervende cellen moeten worden verwijderd. Bij volwassenen zijn de immuuncellen perfOrm deze functie, terwijl embryo, waar het immuunsysteem nog niet ontwikkeld verwijdering gebeurt door een alternatief mechanisme. Het mechanisme omvat naburige cellen (de zogenaamde "niet-professionele fagocyten") het nemen van een fagocytische rol, ze herkennen het signaal 'ik eet' op het oppervlak van de stervende cel en overspoelen het ^8-10. Na afblazen, wordt het puin gebracht naar het lysosoom voor degradatie. Dus ongeacht PCD mechanisme, kan een toename van lysosomale activiteit gecorreleerd met verhoogde celdood.

Om PCD, een eenvoudige test om te lysosomen in dikke weefsels en multilayer differentiëren culturen visualiseren studeren kan nuttig zijn. LysoTracker kleurstof is een sterk oplosbare klein molecuul dat wordt vastgehouden in zure subcellulaire compartimenten zoals het lysosoom ^11-13. De kleurstof wordt door diffusie en door de circulatie. Omdat penetratie is niet een belemmering, visualisatie van PCD in dikke weefsels en multi-layer culturen is mogelijk ^12,13 14 tot kleine monsters, coupes en monolaagkweken omdat de procedure is de invoer / permeabiliteit van een terminal transferase.

In tegenstelling tot Aniline blauw, die verspreidt en wordt opgelost door oplosmiddelen, LysoTracker Red DND-99 is Muur, helder en stabiel. Kleuring kan zichtbaar worden gemaakt met standaard TL-of confocale microscopie in whole-mount of sectie met behulp van water of oplosmiddelen op basis van montage media ^12,13. Hier beschrijven we protocollen het gebruik van deze kleurstof te kijken naar PCD in normale en sonic hedgehog null muis embryo's. Daarnaast tonen we analyse van PCD in differentiëren ES celkweken zijn en een eenvoudige kwantificering methode. Samenvattend kan LysoTracker vlekken zijn een geweldige aanvulling op andere methoden voor het opsporen PCD.

Protocol

1. LysoTracker Kleuring van muizenembryo's

1. Genereer muis embryo's door het plaatsen van jonge (5-6 weken oud) vrouwen in mannelijke stud kooien. Monitor op volgende ochtend voor het verschijnen van een vaginale plug aangeeft dat paring heeft plaatsgevonden. Als het vrouwtje zwanger is, wordt 's middags op de dag genaamd 0,5 dpc (dagen na coïtus). De procedure hier gepresenteerde is ideaal voor embryo's 7 tot 13 dpc.
2. Op de embryonale dag van belang, euthanaseren de vrouwelijke overeenkomstig de goedgekeurde protocollen en verwijder de baarmoeder. Verwijder de embryo's van de decidua in een 10 cm Petrischaal met Hanks BSS (zonder fenolrood). Verwijder de extra-embryonale membranen en kan ten minste eenmaal met Hanks BSS om vreemde weefsels en bloed te verwijderen.
3. Bereid LysoTracker Embryo kleuroplossing (5 mM LysoTracker in Hanks BSS). Een handige volume voor 1-2 nesten is 5 ml. Meng voorzichtig de kleurstof gelijkmatig betalen.
4. Voeg's naar de LysoTracker Embryo Staining Solution in een microfugebuis of flesje en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten.
5. Spoel heel zacht in Hanks BSS vier keer 5 min elke wasbeurt.
6. 'S nachts Fix in 4% paraformaldehyde.
7. Spoel af en Hanks BSS, 10 min, om de correctie te verwijderen.
8. Uitdrogen via een reeks methanol (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min per stap) om achtergrondkleuring te elimineren. Dit is belangrijk voor het bereiken van een goede signaal-ruis tijdens het belichten.
9. Op dit punt kun je onbeperkt opslaan van de embryo monsters in methanol bij -20 ° C, beschermd tegen licht.

Opmerking: Een weefselmonster kan worden bij elke stap van DNA genotypering echter kan het meest geschikt om een monster te nemen net voor opslag zodat tot deze stap alle monsters kan batch-verwerking. Verzamel een steekproef van weefsel uit de staart, ledematen of hoofd van elk embryo en zet alle in aparte buizen. Hydrateren het weefsel monster en voor te bereiden op genotypingen.

2. LysoTracker Kleuring van Differentiëren ES Culturen

1. Bereid embryoid lichamen via de Opknoping Drop-methode ¹⁵ met een start dichtheid van 500 cellen per 20 ul druppel.
2. Na 3 dagen overdragen embryo lichamen suspensiekweek op 10 cm niet-hechtende petrischalen (die worden gebruikt voor bacteriologische werk). Cultuur gedurende 5 dagen, het veranderen van de media om de 2 dagen.
3. Op dag 7, het embryo lichamen over te brengen naar ontsloten 8-wells-kamer dia's (voeg 0,1% gelatine aan de kamers, wacht 5 minuten, te verwijderen, en de media toe te voegen). Overdracht 1 tot 2 embryo lichamen per kamer.
4. Cultuur voor 10 dagen, het veranderen van de media om de andere dag. Zorg ervoor dat de pipet dus plaats op de hoek van de kamer dia niet verstoren het embryo lichaam verbonden aan het glasoppervlak. Ook bij het toevoegen van vers medium ook de pipet plaatsen op de hoek van de kamer en langzaam de media.
5. Na 10 dagen van culture, om apoptose als positieve controle, een deel van de putjes te behandelen met 0,1 mM en 1,0 mM H ₂ O ₂ (voeg de H ₂ O ₂ naar vers medium, mix, voeg de cellen) gedurende 60 minuten. Spoel tweemaal met D-PBS en cultuur 's nachts in de reguliere media.
6. Zuig bestaande media en voeg LysoTracker Cell kleuroplossing (500 nM LysoTracker (eindconcentratie) in media, 300 ul per kamer).
7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
8. Spoel tweemaal met D-PBS twee keer 5 min elk.
9. Fix in 4% paraformaldehyde gedurende 15 min bij RT.
10. Spoel tweemaal met D-PBS, 5 minuten.

3. Bekijk LysoTracker Stained Embryo's of ES culturen

1. Bereid de celmonsters voor microscopie door afzuigen van het D-PBS; verwijderen van de kamer uit de dia lucht drogen gedurende ongeveer 5 min, en vervolgens toevoegen van een waterige fixeermiddel (Vectashield met DAPI of dergelijke). Plaats een folie barrière, terwijl drying bleken te verlagen van de fluorofoor. Monteer embryo's in een diepe depressie-glazen schaal of kleine petrischaal in Vectashield of iets dergelijks.
2. Visualiseer met een dissectie of samengestelde microscoop uitgerust met een rhodamine of Texas Red filter (LysoTracker RED DND-99, Opwinding / Emissie: 577/590 nm). De kleuring is meestal vrij helder dus lange belichtingstijden zijn meestal niet nodig.

4. Kwantificering van de resultaten met imaging-technieken

1. Neem digitale foto's van uw monsters onder dezelfde blootstellingsomstandigheden in de handmatige modus.
2. Open de afbeeldingen in Adobe Photoshop of een vergelijkbaar imaging programma. Om de hoeveelheid LysoTracker vlekken te bepalen, selecteert u het rode kanaal en de drempel de afbeelding (de afbeelding omgezet naar zwart-wit), zodanig dat de rode vlekken nu wordt vertegenwoordigd door witte pixels. Selecteer de witte pixels en gebruik de histogram functie om de totale telling te verkrijgen.
3. Gebruik het blauwe kanaal te tellenhet aantal kernen in het veld. Het kan handig zijn om een ​​verslag van de telling te houden door annoteren het beeld.
4. Noteer de waarden en bereken dan het gemiddelde vlekken niveau per cel. Herhaal deze analyse met dezelfde drempel instelling voor alle beelden die u wilt proeven.

5. Representatieve resultaten

Er is een normaal patroon van PCD tijdens de embryonale ontwikkeling die veranderen als een groeifactor gen, zoals Sonic hedgehog (Shh), ^16,17 verwijderd. Aangezien LysoTracker is een kleine molecule kleurstof die zeer diffundeerbare, kan het hele embryo gevisualiseerd om gebieden van PCD ook diep in het mesenchym ^12,13 beoordelen Figuur 1 toont de LysoTracker kleurpatroon voor normale en Shh ^{-. / -} Mutant mouse embryo's in 10.5dpc. In dit stadium wordt PCD sterk toegenomen Shh ^{- / -} embryo mutant, vooral in de ledemaat en somiet regions. Gedeelten van het embryo kan worden afgebeeld geheel gemonteerde bij een grotere vergroting (1B) om de algehele patroon beoordelen. Ontleed porties kan ook secties met een trillende microtoom (1C) of een cryostaat (DF) om PCD's tonen in meer detail.

TUNEL analyse best op dunne secties waar penetratie van de terminal transferase minder problematisch. LysoTracker kleuring en TUNEL assay kan in hetzelfde weefsel (Figuur 1D-G). Deze resultaten tonen aan dat hoewel er geen strikte correlatie tussen 01:01 en LysoTracker TUNEL kleuring, de algemene gebieden van overlap PCD aanzienlijk. Bij een hogere vergroting, kan men zien dat puncta vlek positief met de TUNEL assay maar niet met de LysoTracker kleurstof, puncta dat alleen de vlek LysoTracker kleurstof en puncta met overlappende kleuring.

Wanneer een EB wordt uitgeplaat op een met gelatine beklede oppervlak, differentiërende cellen trekkendee naar buiten. Na 10 dagen kweken zullen cellen differentiëren naar verschillende celtypen waaronder neuronen, spiercellen en hartspiercellen. De culturen in figuur 2 bevatten gemengde populaties van deze celtypen, maar men kan aanpassen ons protocol te bestuderen PCD van een bepaald celtype van belang. Zo kan de EB worden behandeld met retinoïnezuur de differentiatie van neuronen ¹⁹ verbeteren en de LysoTracker assay kan worden gebruikt om neuronale celdood te analyseren onder verschillende omstandigheden. In de normale kweek van gedifferentieerde ES cellen, zijn er een paar cellen die PCD ondergaan en deze kunnen worden gedetecteerd met LysoTracker en / of TUNEL assays (Figuur 2A). PCD kan worden veroorzaakt door een aantal verschillende cytotoxische middelen zoals waterstofperoxide (H ₂ O ₂₎ die oxidatieve schade veroorzaakt en initieert de apoptotische route ^20,21. Een lage dosis van H ₂ O ₂ verhoogt zowelLysoTracker en TUNEL kleuring vergelijking met geen behandeling, terwijl een hoge dosis, celkrimp en wijdverbreide LysoTracker en TUNEL positiviteit. Vergelijkbaar met de resultaten in het embryo, is het mogelijk te zien dat puncta vlek positief met de TUNEL assay maar niet met de LysoTracker kleurstof, puncta dat alleen de vlek LysoTracker kleurstof en puncta met overlappende kleuring. Het gevolg van de toepassing van een cytotoxisch middel dat apopotosis induceert vergeleken met serum honger voorwaarden autophagy (figuur 2D) induceren. Cellen die een proeftijd serum verhongering (1 uur) vertonen een ander patroon waar LysoTracker en TUNEL kleuring niet sterk correleren. LysoTracker kleuring is sterk toegenomen in vergelijking met niet-behandelde kweken, maar TUNEL positiviteit is op een normaal niveau.

Gebruikmakend van standaard tools beschikbaar in Adobe Photoshop kunt LysoTracker vlekken worden gekwantificeerd met een eenvoudige drempelwaarde methodedie toelaat om bereken het gemiddelde niveau voor een kleuring celpopulatie. Figuur 3A-B toont een voorbeeld afbeelding er tijdens de kwantificering proces. Beginnend met een uitgangswaarde beeld met LysoTracker kleuring in het rode kanaal en de DAPI gekleurde kernen in het blauwe kanaal (paneel 3A), werd het rode kanaal van deze afbeelding thresholded om het beeld om te zetten in zwart-wit en de witte pixels waren geselecteerd en geteld (Figuur 3A). Een drempelwaarde niveau werd gekozen, dat staat voor de LysoTracker kleuringspatroon. Zoals met elke methode die kwantificering beelden gebruikt, is het belangrijk om overbelichting foto's, daar dit kan leiden tot over-benadrukken verschillen. Het aantal kernen in het veld kan worden geteld door naar alleen het blauwe kanaal (Figuur 3B) en het markeren van de kernen met een tekenprogramma zoals een penseel terwijl het tellen (Figuur 3B). Men kan dan uitdrukken ee mate van kleuring door het gemiddelde niveau van kleuring per cel (aantal pixels / kernen count). Wil men dit algoritme gebruiken voor high through-put screening kunnen de meeste screening pakketten meten helderheid in een bepaald kanaal en een object identifier functie die kernen tellen in een vullen, maar de meest gebruikelijke toepassingen de handmatige methode is snel en eenvoudig. Een voorbeeld werd een monster gebied van figuren 2A-C gekwantificeerd en de resultaten bevestigen dat toenemende concentraties H ₂ O ₂ resulteert in een hoger LysoTracker kleuring (Figuur 3C).

Figuur 1. LysoTracker kleuring in normale en Shh ^{- / -} embryo's. A, A 'Normal en Shh ^{-. / -} Muis embryo op 10,5 dpc, gekleurd met Red LysoTracker, gemonteerd in Vectashield en gefotografeerd ondereen epiflourescence ontleden microscoop. Haakjes geven de locatie van de voorpoten B, B 'voorpoot van normale en Shh ^{-.. / -} Embryo afgebeeld bij een grotere vergroting. Let op de normale domeinen van celdood zoals de 'Posterior Necrotische Zone "(aangegeven met een sterretje) en een gebied in het proximale mesenchym van de ledematen (gemarkeerd met een pijl). Shh null ledematen vertonen sterkere kleuring in de mediale en distale gedeelte . C, C '. Medial secties door de voorpoot knop van zowel normale als null ledematen. Let op de aanwezigheid van kleuring in de proximale mesenchym (pijl) en AER (pijlpunt) van de normale ledematen en sterke kleuring in de dorsale en ventrale en distale mesenchym in de null ledematen. DF. Hetzelfde deel (12 micron, bevroren sectie) werd afgebeeld voor LysoTracker en TUNEL kleuring (Roche 1684795). De sectie passeert het distale deel van de Shh null mesencHyme. De pijlpunt wijst naar de AER. Merk op hoe de algemene patroon is vergelijkbaar met beide methoden, maar de kleuring niet volledig overlappen. G, G '. Bij een hogere vergroting van de AER en mesenchym, kan men zowel de aanwezigheid van die puncta LysoTracker of TUNEL-positieve Alleen als puncta met overlappende kleuring.

Figuur 2. LysoTracker kleuring in gedifferentieerde ES cellen. Differentiërende cellen werden uitgeplaat op slides met 8 kamers in afwezigheid van LIF. Te tonen hoe LysoTracker en TUNEL kleuring vergelijken, werd de apoptose route geïnduceerd met 2 verschillende doses H ₂ O _2, terwijl de autophagy pathway werd geïnduceerd met 1 uur serum verhongering. Deze beelden zijn gemaakt met een Zeiss LSM5 confocale microscoop A-A'':. Onbehandeld culturen tonen enkele normale apoptose, zoals aangegeven door LysoTRacker en TUNEL kleuring. Het patroon met behulp van beide technieken vooral overlappingen (witte pijlen), echter, kan men een paar puncta die LysoTracker positief alleen (rode pijlen) zie B-B'', CC ":. Behandeling met toenemende hoeveelheden van H ₂ O ₂ stimuleert apoptose . de lagere dosis toont meer LysoTracker en TUNEL positieve puncta in vergelijking met onbehandelde cellen. hogere dosis induceert in nog LysoTracker en TUNEL positieve puncta. White pijlen overlappende kleuring, terwijl rode pijlen wijzen naar puncta die positief zijn voor LysoTracker alleen. Het is ook mogelijk om puncta die alleen positief voor TUNEL kleuring (groene pijlen) DD ":. Serum honger kan induceren autophagy, die een ophoping van materiaal in lysosomen en autophagolysosomes stimuleren. Merk op hoe veel meer LysoTracker puncta zichtbaar zijn in vergelijking met onbehandelde culturen. TUNEL positieve puncta aanwezig zijn (waarvan de meeste overlappende LysoTracker vleking, witte pijlen), maar het aantal is sterk toegenomen in vergelijking met onbehandelde omstandigheden. Bovendien is onder serum honger omstandigheden, LysoTracker alleen positieve puncta vaak voorkomen (rode pijlen).

Figuur 3. Kwantificeringsmethode het niveau van kleuren in een populatie cellen met Adobe Photoshop beoordelen. A: Een deel van figuur 2A werd gekozen en de LysoTracker (rode) en DAPI kleuring (kernen, blauwe kanaal) wordt in dit paneel A ':. Het rode kanaal van figuur 3A werd thresholded converteren naar een zwart- -wit beeld. De witte pixels kan vervolgens worden geselecteerd en geteld met behulp van het histogram functie B-B ':. De blauwe kanaal toont de kernen en terwijl ze te tellen, kan het beeld worden geannoteerd met een tekening functie zoals een penseel C:. Dit is een ex-voldoende kwantificering van monsters van panelen 2A-C. De gegevens worden weergegeven als pixels per kernen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussie

Belangrijke kenmerken van apoptose omvatten de detectie van DNA schade met de TUNEL assay, samen met de detectie van caspase activiteit (gedetecteerd met mAbs of een bindend molecuul zoals zVAD-fmk) de waarneming van cellulaire veranderingen, en de presentatie van fosfatidylserine (PS ) op het membraanoppervlak (gedetecteerd door Annexine V binding). Er zijn enkele nadelen met elk van deze assays. Bijvoorbeeld, de terminal transferase in de TUNEL assay niet doordringen dan een paar cellagen. Annexine V kan ook markeren ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap		Catalogusnummer
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	# L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Niet-essentiële aminozuren	Cellgro	25-025 CI-
Natriumpyruvaat	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Kamer dia's (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0,1% Gelatine	Millipore	ES-006-B
Dulbecco's PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Oplossing Recepten 4% paraformaldehyde Voor 100 ml: Meng 4 g paraformaldehyde, 90 ml H 2 O en NaOH (een druppel 2N NaOH). De paraformaldehyde zal niet ingaan op oplossing totdat u hebt toegevoegd een aantal NaOH om de pH te verhogen. Roer en warmte bij 60 ° C totdat al het poeder in oplossing (~ 10-20 min.). Niet oververhitten. Voeg ~ 10 ml 10x PBS tot een eindvolume van 100 ml te bereiken. Bij -20 ° C in geschikte (~ 10 ml of ~ 40 ml) porties. WAARSCHUWING: Paraformaldehyde in 'kraag' vorm (gecomprimeerd kleine pellets) minder poederachtig en kan daarom gemeten buiten een kap te worden. Maar je moet nog steeds dragen van een beschermend stofmasker (N95minstens) tijdens hantering. EB Cultuur Media Voor 500 ml EB Media: DMEM: 404,5 ml FBS: 75,0 ml L-Glutamine: 5,0 ml Penicilline / streptomycine: 5,0 ml Niet-essentiële aminozuren: 5,0 ml Natriumpyruvaat: 5,0 ml β-Mercaptoethanol: 500pl