Het gebruik van Time lapse microscopie om Anoxie-geïnduceerde Suspended Animation Visualiseer in<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryo&#39;s

Samenvatting

Hier beschreven wordt een In vivo Techniek image subcellulaire structuren dieren blootgesteld aan anoxie met een gasstroom door microincubation kamer in combinatie met een draaiende schijf confocale microscoop. Deze methode is eenvoudig en flexibel genoeg om een ​​aantal experimentele parameters en modelsystemen passen.

Samenvatting

Caenorhabdits elegans is uitgebreid gebruikt in de studie van stressbestendigheid, dat wordt vergemakkelijkt door de transparantie van de volwassene en embryo fasen alsook door de beschikbaarheid van genetische mutanten en transgene stammen die talloze fusie-eiwitten ^1-4. Daarnaast kunnen dynamische processen zoals celdeling worden weergegeven met fluorescent gemerkte reporter eiwitten. De studie van mitose kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van time-lapse experimenten in diverse systemen waaronder intacte organismen, vandaar de vroege C. elegans embryo is geschikt voor deze studie. Hier gepresenteerde een techniek waarbij in vivo beeldvorming van sub-cellulaire structuren in reactie op anoxische _(99,999% N2, <2 ppm O ₂₎ spanning kan op eenvoudige gasstroom door instellen op een krachtige microscoop. Een microincubation kamer wordt gebruikt in combinatie met stikstofgasstroom en door een draaiende schijf confocale microscoopeen gecontroleerde omgeving waarin dieren kunnen worden afgebeeld in vivo maken. Met GFP-gelabelde gamma tubuline en histon kan de dynamiek en arrestatie van celdeling worden gecontroleerd voor, tijdens en na blootstelling aan een zuurstofarme omgeving. De resultaten van deze techniek zijn hoge resolutie, gedetailleerde video's en foto's van cellulaire structuren binnen blastomeren van embryo's worden blootgesteld aan zuurstoftekort.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. Produceren of verkrijgen geschikte transgene C. elegans stam van belang het gebruik van transgene methoden of van Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) of collega. In dit geval gebruiken we stam TH32 (pie-1 :: TBG-1 :: GFP, pie-1 :: GFP :: H2B) ⁵ tot chromosomen en centrosomen visualiseren als markers voor de celdeling.
2. Genereer een gesynchroniseerde bevolking door het gebruik van een van de drie manieren: 1) desintegreren zwangere volwassenen in hypochloriet oplossing en het gebruik van de resterende embryo's ^6, 2) pick zwangere volwassenen op een geplaatste bord en laat ze liggen embryo's voor 1-2 uur, of 3) pick L4 larven van een gemengde populatie en verhuizing naar een nieuw geplaatste plaat.
3. Grow nematoden bij 20 ° C aan zwangere jonge volwassenheid, die ongeveer 96 uur duurt vanaf het uitkomen, 72 uur van L1 larven of 24 uur na L4 molt. Embryo's (2-20 cellen) in de baarmoeder bevatten grote blastomeren en kernen die optimaal zijn voor imaging sub-cellulaire en sub-nucleaire veranderingen respectievelijk. Deze methode biedt de mogelijkheid om een ​​populatie van jonge volwassenen die een overvloedig aantal vroege embryo's bevatten genereren.

2. Schuif Voorbereiding en Anoxie Kamer Set Up

1. Een vochtige kamer de bereidingen dia houden door een vochtige papieren handdoek in een grote petrischaal of bak afgedekt met een deksel van voldoende grootte.
2. Bereid gesmolten 2% agarose in gedeïoniseerd H ₂ O door het verwarmen van het mengsel in glaswerk via magnetron of waterbad.
3. Plaats 1-3 druppels van warme agarose op een schoon glas microscoopglaasje. Plaats onmiddellijk een tweede dia loodrecht omgekeerd op de top van de agarose druppel (s), drukt u op een beetje zodat de resulterende pad zal zijn dun en vrij van luchtbellen.
4. Laat de tijd om af te koelen en langzaam uit elkaar te halen de twee microscoopglaasjes het verlaten van de agarose pad intact op een van de dia's. Het is belangrijk om de agarose pad is dun genoeg om niet interferentiesgaan met de mogelijkheid om de microscoop later richten. Vermogen om monster te visualiseren is ook afhankelijk van de specifieke optische afstand van het doel in gebruik, dat kan variëren van microscopen.
5. Gebruik een schoon scheermesje aan agarose pad te vormen tot een klein vierkantje. Bewaren in de voorbereide vochtige kamer totdat klaar voor gebruik.
6. Voorzichtig, met behulp van dezelfde schoon scheermesje, neem de rand van de agarose pad en overbrengen van de dia op een ronde 25 mm micro dekglaasje, het vermijden van de accumulatie van luchtbellen onder het kussen. De ronde coverglass geselecteerd voor gebruik in de juiste past microincubator.
7. Een druppeltje anestheticum (0,5% tricaine, 0,05% tetramisool in M9 buffer) op de agarose pad voor gebruik als anestheticum. Kies vijf tot tien wormen en plaats in de druppel verdoving. Staan 1-3 min voor wormen om beweging te staken.
8. De reden voor het observeren van embryo's in de volwassen baarmoeder, in plaats van ontleed embryo's, is het minimaliseren van het potentieel van embryo desiccatie en beweging door de stroom stikstofgas in de embryo.
9. Voeg onmiddellijk een druppel Halocarbonolie bovenop de wormen de wormen voorkomen dehydratie gas stroomde door de kamer. Omdat de halogene olie is stroperig kan men gebruik maken van een pipet tip of punt van een worm kiezen om olie-and-drop te verzamelen op de wormen.
10. Zodra de circulaire dekglaasje met de wormen klaar is, de twee helften van de Leiden gesloten perfusie microincubator gescheiden en de coverglass Daarna wordt rechtop op de onderste ring. De twee zijden van de kamer worden daarna stevig samen gesloten.
11. De kamer wordt dan verbonden met het stikstofgas tank via flexibele plastic buis en geplaatst in de juiste plaats op de microscooptafel (Figuur 1C). Op dit moment de slang en microincubator moeten zorgvuldig worden gecontroleerd op lekkage door te zorgen veilige bevestiging van de slang en de poort kleppen langs de kant van de kamer. Men kan alzo licht verspreidde een kleine hoeveelheid zeep water over de slang op zoek naar bubbels, die ontstaan ​​als een lekkage aanwezig is.

3. Microscopie in Anoxie

1. Zoek dieren bij lagere vergroting, daarna, gaat u naar de gewenste hogere vergroting (64x voor deze toepassing) om de afbeelding weefsel of cellen van belang, zoals embryonale blastomeren of eicellen bij volwassenen. Zet de 488 nm laser GFP signaal bekijken en GFP fusie-eiwit in de cel (len) plaats vinden.
2. Om de arrestatie op specifieke fase van de celcyclus te visualiseren (bijv. eind profase) identificeren van een blastomeer in een eerdere fase van de celdeling (verlate interfase of begin profase). Cellulaire merkers zoals centriole positie inleiding van chromosoom condensatie chromosoom locatie en de aanwezigheid of afwezigheid van de nucleaire envelop helpen bepalen celcyclus fase (figuur 2A).
3. De kamer wordt dan geperfuseerd met stikstofgas (99,999%N _2; <2 ppm O _2). In dat geval gebruikt een druk van 6 psi echter druk kan moeten worden aangepast en geoptimaliseerd afhankelijk van de grootte van elk microincubator en diameter van buizen in gebruik. Blijf de blastomeer (s) controleren terwijl de stikstof vult de kamer, het aanpassen van het brandvlak als dat nodig is.
4. Op dit punt heeft time-lapse imaging begonnen. Imaging wordt uitgevoerd zolang als nodig verschijnsel interesse hebben, in dit geval prophase arrestatie en docking chromosomen van de binnenste nucleaire membraan. Beelden worden eenmaal elke 10 sec niet langer dan 30 minuten. Frequenties van het vastleggen van beelden en instellingen, zoals versterking en laservermogen moeten worden aangepast zoveel als nodig.
5. De tijd waarin de embryo's reageren op de zuurstofloos milieu kan variëren afhankelijk van de celcyclus fase bij anoxia blootstelling. Typisch anoxie-geïnduceerde profase arrestatie plaatsvindt binnen 20-30 min. van het begin van stikstof gasstroom. We hebben gezien anoxie-geïnduceerde cel cyclus arrest bedrijfspensioenvoorzieningrring in <20 min. Afbeeldingen kunnen worden verkregen tijdens deze periode, of specifieke beelden kunnen later van een time-lapse serie worden geïsoleerd. Een extra optie is videomicroscopie om sub-cellulaire structuren te visualiseren in embryo's.
6. Om het herstel van de anoxie-geïnduceerde gearresteerd toestand documenteren, wordt het gas uitgeschakeld en de kamer is toegestaan ​​om te normoxia terug te keren door diffusie tijdens het opnemen van een time-lapse serie. Hervatting van de voortgang van de celcyclus en loskoppelen van de chromosomen treedt meestal binnen 5-20 min. van het draaien van de stikstofgas uit.
7. Merk op dat in afzonderlijke experimenten een indicator anoxie, resazurine, werd in de doorstroom microkamer, werd vastgesteld dat de kamer wordt anoxische gemiddeld ongeveer 19 min na stikstofgasstroom begonnen.
8. Afbeeldingen en video's worden verwerkt met behulp van Imaris, Afbeelding J of Photoshop en geïmporteerd in QuickTime voor weergave.

Resultaten

C. elegans embryo's worden blootgesteld aan ernstige zuurstoftekort (anoxie) in staat zijn om te overleven met de arrestatie van biologische processen zoals ontwikkeling en celdeling ^7. De anoxie-geïnduceerde arrestatie van celdeling kan worden gecontroleerd, een sub-cellulair niveau, door een microincubation kamer in samenhang met stikstofgasstroom en door een draaiende schijf confocale microscoop om een gecontroleerde omgeving waarin dieren kunnen worden afgebeeld in vivo creëren

Discussie

Zuurstoftekort en Suspended Animation

Hoewel blootstelling aan ernstige zuurstoftekort kan fataal zijn voor een aantal organismen, sommige organismen zijn in staat om blootstelling aan zuurstoftekort te overleven. In het geval van C. elegans, overleving van anoxie blootstelling is afhankelijk van het ontwikkelingsstadium en de reactie op anoxie wordt de toegang tot een omkeerbare toestand van schijndood, waarin een aantal waarneembare biologische processen worden gearresteerd. Celdelin...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia / Apparatuur			Samenstelling
Hypochlorietoplossing			0,7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, brengen 50 ml met 2 0 ddH
M9 buffer			3 g KH 2PO 4, 11 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L 2 O ddH
Glazen objectglaasjes	Fisher Scientific	12-550-343	3 "x1" x1.0 mm
Ronde micro coverglass	Electron Microscopy Sciences	72.223-01	25 mm Diameter
Halocarbonolie 700	Sigma	H8898-100ml
Verdovingsmiddel			0,5% tricaine, 0,05% tetramisool
Leiden Gesloten Perfusie Microincubator	Harvard Apparatus	650041
UHP Stikstof	Calgaz (Air Liquide)		> 99,9990% N 2 <2 ppm O 2
Kunststof buis	VWR	89068-468	0.062 "ID x 0.125" OD
Spinning Disk confocale microscoop	McBain Systems		Zeiss omgekeerd optische microscoop, epifluorescentie verlichtingssysteem, CSU-10 Yokogawa confocale scanner, Hamamatsu elektron multiplier CCD-camera.