Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Samenvatting

We beschrijven de snelle isolatie van primaire murine type II alveolaire epitheelcellen (AECII) door flowcytometrische negatieve selectie. Deze AECII vertonen hoge levensvatbaarheid en zuiverheid en zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies over hun rol bij luchtwegaandoeningen zoals auto of infectieziekten.

Samenvatting

In de afgelopen jaren, is de bijdrage van alveolaire type II epitheelcellen (AECII) diverse aspecten van immuunregulatie in de longen vaker erkend. AECII is aangetoond dat deel cytokine productie in ontstoken luchtwegen en zelfs als antigen-presenterende cellen in zowel infectie en T-cel gemedieerde auto-immuniteit ^1-8. Daarom zijn ze bijzonder interessant ook binnen klinische vraagstellingen, zoals hyperreactiviteit van de luchtwegen bij buitenlandse en zelf-antigenen alsook infecties die direct of indirect richten AECII. Echter ons begrip van de gedetailleerde immunologische functies bediend door alveolaire type II epitheelcellen van gezonde long en in ontsteking blijft fragmentarisch. Veel studies over AECII functie worden uitgevoerd met behulp van de muis of mens alveolaire epitheliale cellijnen ^9-12. Werken met cellijnen biedt zeker een aantal voordelen, zoals de beschikbaarheid van een groot aantal of cellen voor uitgebreide analyses. Echter, wij geloven het gebruik van primaire muriene AECII zorgt voor een beter begrip van de rol van dit type cel in complexe processen, zoals een infectie of auto-immuun ontsteking. Primaire murine AECII direct geïsoleerd uit dieren die lijden aan dergelijke ademhalingsproblemen, wat betekent dat ze zijn onderworpen aan de aanvullende extrinsieke factoren een rol spelen in de geanalyseerde setting. Als voorbeeld kan levensvatbare AECII worden geïsoleerd uit muizen intranasaal geïnfecteerd met influenza A-virus, die voornamelijk deze cellen richt voor replicatie ^13. Belangrijker door ex vivo infectie van AECII geïsoleerd uit gezonde muizen, kan studies van de cellulaire responsen bevestigd na infectie worden verlengd.

Onze protocol voor de isolatie van primaire murine AECII is gebaseerd op enzymatische afbraak van de muizenlong gevolgd door etikettering van de resulterende celsuspensie met antilichamen specifiek voor CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 en CD16/CD32. Granulaire AECII worden vervolgens geïdentificeerd als ongelabelde en zijwaartse verstrooiing hoog (SSC ^hoog) celpopulatie worden gescheiden door fluorescentie geactiveerde celsortering ^3.

In vergelijking met andere werkwijzen voor het isoleren primaire epitheelcellen muizenlongen, ons protocol voor flowcytometrische isolatie van AECII door negatieve selectie levert ongerepte zeer levensvatbare en zuivere AECII in relatief korte tijd. Bovendien, in tegenstelling tot conventionele methoden van isolatie door panning en uitputting van lymfocyten via binding van antilichaam-gekoppelde magnetische korreltjes ^{14, 15,} flowcytometrische cell-sortering maakt onderscheid door celgrootte en granulariteit. Aangezien instrumentatie voor flowcytometrische celsortering beschikbaar is, kan de beschreven procedure worden toegepast tegen relatief lage kosten. Naast standaard antilichamen en enzymen voor long desintegratie geen extra reagentia zoals magnetischebeads vereist. De geïsoleerde cellen zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies, waaronder in vitro kweek en T-cel stimulatie assays en transcriptoom, proteoom of secretoom analyses ^{3, 4.}

Protocol

Details over de vereiste reagentia en materialen worden vermeld in de tabel aan het einde van het protocol hieronder. Vóór aanvang bereiden 15 ml buisjes (een per muis) met 4 ml dispase en voorverwarmen ze tot 37 ° C in een waterbad. In een verwarmingsblok kort verwarmen kleine hoeveelheden van 1% laag smeltpunt agarose (in water) tot 95 ° C tot vloeibaar en vervolgens afkoelen tot 45 ° C tot gebruik.

1. Voorbereiding van de Muis Lung

1. Offer de muis door CO ₂ stikken. Opmerking: Voer geen cervicale dislocatie omdat dit de luchtpijp verwonden, zodat volgende stappen van het protocol, zoals de installatie van de long met vloeistof, kan niet met succes worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat het verlies van nociceptieve reflexen.
2. Spuit de muis met ethanol en een lange snede langs de ventrale middenlijn van het lichaam. Trek de ventrale vacht en huid en vervolgens ook zorgvuldig te schrappen en het buikvlies.
3. Exsanguinate demuis door het snijden van de linker en rechter halsader (vena jugularis) en de nierslagader (Arteria renalis). Verwijder stromend bloed met weefsel.
4. Zorgvuldig lekke band en verwijder het membraan naar het hart en de longen worden blootgesteld door het wegsnijden van de ribben. Wees extra voorzichtig dat u de longen beschadigen.
5. Met een canule 26G en 10 ml spuit met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), doorboren de rechter ventrikel van het hart en de longen perfuseren met PBS tot deze bloed.
6. Snij en verwijder de speekselklieren van de luchtpijp bloot te leggen. Ook zorgvuldig knippen de spieren rond de luchtpijp.
7. Plaats een 22G inwoning canule in de luchtpijp, verwijder de naald en druk de plastic catheter in de richting van de longen. Bevestig de katheter door koppelverkoop een klein stukje draad om luchtpijp en de katheter.

2. Enzymatische afbraak van het longweefsel

Desgewenst kan een bronchoalveolaire lavage vloeistof monsterbereid door spoelen van de longen door de catheter ingebracht in de trachea met PBS of medium voor de volgende stap.

1. Een 2 ml spuit voorzichtig inboezemen een maximaal volume van 2 ml dispase (4 ml van het monster) in de long via de katheter zodat alle lobben volledig geëxpandeerd. Wisselen spuit met een 1 ml spuit met 0,5 ml van de vloeibare agarose en druppelen in de longen.
2. Laat de spuit op de katheter om terugstroming van de agarose te voorkomen en deze onmiddellijk de long met laboratorium tissuepapier en ijs. Laat de agarose gel een paar minuten.
3. Verwijder het zijdepapier, ijs, spuit en catheter, snijd de luchtpijp en accijnzen de longen, het hart en de thymus van de borst. Spoel daarna de long in een schaal met PBS en verwijder het hart, de thymus en de resterende luchtpijp.
4. Plaats de longen naar de resterende 2 ml dispase en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.

3. Bereiding van de LungCelsuspensie

1. Verwijder de longen van de dispase en breng deze in een schotel met 7 ml anti-CD16/32 antilichaam (1 pg / ml eindconcentratie) in DMEM medium en 100 ul DNase.
2. Behulp van een tang, volledig uiteenvallen het longweefsel van elkaar te trekken en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder voorzichtig schommelen op een rocker ingesteld op 200 rpm. Desgewenst kan de celsuspensie dan bewaard bij 4 ° C tot de volgende stap.
3. Filter de celsuspensie door nylon mazen eerst met 100 urn en vervolgens met 70 urn, 48 urn en 30 urn poriën. Zorg elke maas spoelen en de buizen en gerechten grondig met DMEM om verlies van cellen te minimaliseren en te maximaliseren. Als u poolen van monsters, kan dit hier worden bereikt door vervolgens het passeren van cellen schorsingen van muizen van de ene groep door dezelfde filter stromen. Vernieuw het filter in het geval van verstopping.
4. Afhankelijk van het volume, Breng het filtraat aan een of meer 50 ml buizen encentrifugeer 15 min bij 160 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant.
5. Resuspendeer de celpellet in 2 ml erytrocyten lysis buffer (0,15 M _NH4Cl, 0,01 M _KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) en snel lysis beëindigd door toevoeging van 13 ml DMEM medium. De oplossing wordt naar een 15 ml en centrifugeer gedurende 12 minuten bij 160 xg en 4 ° C.

4. Antilichaam Kleuring voor flowcytometrische cell-sortering

1. Resuspendeer de cellen in 3 ml primair antilichaam cocktail, bereid in DMEM medium bij verdunningen geschikt voor flowcytometrie. (Antilichamen werden voorheen getitreerd voor optimale werkverdunningen door kleuring 1 x 10 ⁶ splenocyten in een volume van 100 ul. Gebruik 3 ml van het primaire antilichaam cocktail met de optimale concentratie voor elk van de gebruikte antilichamen cellen samengevoegd uit maximaal vijf muizen. Als er meer muizen worden samengevoegd tot een monster, het volume aanpassen).
2. Voor kleuring Incubeer de cellen gedurende 10 min in het donkerbij 4 ° C.
3. Spoel de cellen door het vullen van de buis met 15 ml DMEM medium en centrifugatie gedurende 12 min bij 160 xg en 4 ° C.
4. Bij ontkoppeld of gebiotinyleerde antilichamen werden gebruikt in 4.1: Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 - 3 ml secundair antilichaam cocktail. Vlek gedurende 10 min bij 4 ° C in het donker.
5. Spoel de cellen door het vullen van de buis met DMEM en centrifugatie gedurende 12 min bij 160 xg en 4 ° C.
6. Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM en voorfilter door een 50 urn filter in een buis voor cel-sortering. Optioneel: Tel de cellen van het totale aantal cellen in de long celsuspensie te verkrijgen.

5. Cell-sortering

1. Meng de cellen door vortexen voor sortering. Gebruik een 100 um mondstuk voor cel-sortering van AECII. Mantelvloeistof druk en laser emissie-en detektieinrichting golflengten afhankelijk van het instrument voor flowcytometrische cell-sortering en de fluorochromen in de ANTIBody kleuringsprocedure.
2. Hek aan de SSC ^high cellen die negatief zijn voor de fluorochromen voor kleuring en sorteren in een buis die DMEM. Gebruik voorwaartse verstrooiing hoogte (FSC-H) vs gebied (FSC-A) en zijwaartse verstrooiing hoogte (SSC-H) vs gebied (SSC-A) vensters om alle doubletten of celaggregaten sluiten (zie details van de gating strategie in Figuur 1 a).
3. Om de gesorteerde cellen centrifuge inzamelen voor 20 min bij 280 xg en 4 ° C.
4. Resuspendeer de cellen in kweek-medium of buffer als voor latere analyse.

Resultaten

Bij het sorteren longcelsuspensies geïsoleerd uit gezonde muizen, zal de AECII poort doorgaans goed zijn voor ongeveer 42 ± 10% van alle gebeurtenissen. Dit percentage kan aanmerkelijk lager bij muizen met ademhalingsaandoeningen zoals een virale infectie worden gebruikt als de oorspronkelijke celsuspensie een aanzienlijk hoger percentage lymfocyten en andere cellen aangetrokken om de luchtwegen bevatten. Voor AECII geïsoleerd uit IAV geïnfecteerde longen op dag 3 na infectie we hebben waargenomen verlaging van de frequ...

Discussie

Onze protocol voor de isolatie van muizen AECII door flowcytometrie biedt een snelle manier toegang primaire cellen uit de muizenlong voor een hele reeks van functionele en moleculaire studies. De beschreven procedure levert zeer levensvatbare en zuivere populaties van AECII die voldoende in aantal directe latere analyses zoals RNA isolatie (zie figuur 2b) en transcriptoom studies. Voor functionele toepassingen, is het ook mogelijk om cultuur de geïsoleerde cellen, waardoor bijvoorbeeld het gen...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
verblijfscanule Introcan 22G	Braun	REF 4252098B
Dispase, 100 ml (5000 caseïnolytische eenheden)	BD Biosciences	354235	aliquot tot 4 ml in 15 ml buizen, bij -20 ° C
Biozym Plaque Agarose	Biozym	840101	1% w / v in H 2 O
Deoxyribonuclease I uit runderpancreas, 2000 Kunitz eenheden / flacon	Sigma-Aldrich	D4263	vers Los de inhoud van 1 injectieflacon in 300 ul DMEM
DMEM	Gibco	22320-022	gebruikt zoals bepaald door de fabrikant (Low Glucose, Pyruvaat, HEPES)
cell zeven (100 urn, 75 urn)	BD Falcon	352360, 352350
nylon mesh (48 urn, 30 pm)	Bückmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 urn filter	Partec	04-0042-2317
anti-muis CD16/CD32	BioLegend	101302	kloon 93; gezuiverd
anti-muis F4/80	BioLegend	123116	kloon BM8; APC gekoppelde
anti-muis CD11b	BioLegend	101208	kloon M1/70; PE gekoppelde
anti-muis CD11c	BioLegend	117310	kloon N418; APC gekoppelde
anti-muisCD45	BioLegend	103102	kloon 30-F11; gezuiverd
anti-muis CD19	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3; PE gekoppelde
polyklonaal geit anti-rat IgG	BD Pharmingen	550767	polyklonale, gekoppeld PE
			Antilichamen gekoppeld aan andere fluorochromen worden gebruikt, afhankelijk van de stromingscytometer en lasers beschikbaar.