Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen

Samenvatting

Hier beschrijven we een werkwijze voor het activeren en uitbreiden menselijke NKT cellen van bulk T-celpopulaties met kunstmatige antigen presenterende cellen (AAPC). Het gebruik van CD1d gebaseerde AAPC een gestandaardiseerde werkwijze voor het genereren van grote aantallen functionele NKT cellen.

Samenvatting

Natural killer T (NKT) cellen zijn een unieke subset van T cellen die markers kenmerk van zowel natuurlijke killer (NK) cellen en T cellen ¹ weergegeven. In tegenstelling tot klassieke T-cellen, NKT cellen herkennen lipide antigeen in de context van CD1 moleculen ^2. NKT cellen brengen een invariant chain TCRα omlegging: Vα14Jα18 in muizen en Vα24Jα18 in mensen, die gepaard gaat met Vβ ketens van beperkte diversiteit ^3-6, en worden aangeduid als canonieke of invariante NKT (i NKT) cellen. Soortgelijke conventionele T cellen NKT cellen ontwikkelen van CD4-CD8-T-cellen thymus precursor na de passende signalering door CD1d ^7. Het potentieel om NKT cellen te gebruiken voor therapeutische doeleinden is sterk toegenomen met de mogelijkheid te stimuleren en menselijke NKT cellen uit te breiden met α-galactosylceramide (α-GalCer) en verschillende cytokines ^8. Belangrijk, deze cellen hun oorspronkelijke phenotype, uitgescheiden cytokinen en weergegeven cytotoxische werking tegen tumor cellijnen. Aldus ex vivo geëxpandeerde NKT cellen functioneel blijven kan worden toegepast voor adoptieve immunotherapie. Echter NKT-cellen gebaseerde immunotherapie beperkt door het gebruik van autoloog antigeen presenterende cellen en de kwantiteit en kwaliteit van deze stimulator cellen aanzienlijk variëren. Monocyt-afgeleide DC van kankerpatiënten werden gerapporteerd verlaagde costimulatoire moleculen uitdrukken en minder inflammatoire cytokines produceren ^9,10. In feite hebben murine DC dan autologe APC gebruikt om de functie van NKT cellen van CML patiënten ¹¹ testen. Dit kan echter slechts worden gebruikt voor in vitro testen, omdat NKT cellen kunnen niet worden uitgebreid door muizen DC en toegepast voor adoptieve immunotherapie. Zo kan een gestandaardiseerd systeem dat is gebaseerd op kunstmatige antigeen presenterende cellen (AAPC) produceren de stimulerende effecten van DC zonder de valkuilen van allo-of xenogene ceLLS ^{12, 13.} Hierin beschrijven we een werkwijze voor het CD1d gebaseerde AAPC. Aangezien de betrokkenheid van de T cel receptor (TCR) van CD1d-antigen complexen een fundamenteel vereiste van NKT cel activatie antigeen CD1d-Ig complexen een betrouwbare methode te isoleren, activeren en vergroten effector NKT celpopulaties.

Protocol

1. Generatie AAPC

1. Voor het toevoegen eiwitten aan beads, bereiden alle reagentia en buffers: 0,1 M boraatbuffer, 1X D-PBS (zonder ^{Ca2 + en} Mg2 ^+); Bead Wash Buffer (1X PBS +5% menselijk AB serum + 0,02% natriumazide) ; compleet medium (RPMI medium +100 mM natriumpyruvaat, 10 mM niet-essentiële vitamines, 100 mM MEM vitamine oplossing, 1% 2-mercaptoethanol, 10 uM ciprofloxacine, 5% menselijk AB serum) MACS buffer (1 L PBS free van ^{Ca2 + en} Mg2 ^+, 5 g BSA, en 2 mmol EDTA).
2. Spoel 1 ml Dynabeads M-450 Epoxy kralen met 3 ml steriele 0,1 M boraatbuffer (boorzuur en water, pH 7.0-7.4) in een 5 ml helder borosilicaatglas schroefdraad flacon.
3. In een afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuisje, voeg 100 ug hCD1d-Ig dimeer en 20 ug costimulatoire moleculen (bijvoorbeeld anti-CD28mAb) naar 1 ml PBS w / o ^{Ca2 + of} Mg2 ^+.
4. Plaats kraal met daarin glazen flesje op de magneet en zuig boraatbuffer van kralen. Voeg eiwit mengsel van stap 1,2 tot glazen flacon en vervang dop. Meng onmiddellijk door het buisje, bedek de dop met parafilm, en op een rotator en incubeer overnacht bij 4 ° C.
5. De volgende dag, plaats glazen flesje op de magneet en verwijder eiwitmengsel, terwijl zorgvuldig vermijden van kralen. Was de kralen door 3 ml bead wasbuffer (PBS met 5% AB serum +0.02% natriumazide) en incubatie bij 4 ° C op een rotator gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen.
6. Kralen kunnen worden opgeslagen in deze kraal wash mengsel. Om functionele AAPC te maken, verwijdert u een kleine hoeveelheid en tel de kralen met behulp van een hemacytometer. Controleer of de eiwitten stabiel worden geplaatst op de parels door kleuring met antilichamen (ex. PE-geconjugeerd anti-muis IgG1) en het uitvoeren van flowcytometrische analyse.
7. Om kralen te laden met antigeen, verwijdert u 5 x 10 ⁷ kralen, en toe te voegen aan een kleine 1,5 ml glazen injectieflacon, spoel kralen met 1 ml steriele PBS. Resuspend gewassen kralen met 1 ml steriele PBS en voeg antigeen; voorbeeld: Load met α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Opmerking: Tijdens het, we hebben niet gedetecteerd eventuele problemen met vetoplosbaarheid of micelvorming, lipiden dient te worden behandeld volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Specifiek werd KRN7000 gereconstitueerd in DMSO (1mg/ml) voor deze studies. KRN7000 en glycolipide antigenen kunnen ook worden opgelost in 0,2 mg / ml PBS die 0,5% Tween-20 (ultrasone trillingen 2 uur. Bij 37 ° C). BELANGRIJK-De AAPC moeten worden geladen ten minste 48-72 uur voor gebruik.

2. Isolatie van CD161 ⁺ CD3 ⁺ cellen

1. Verzamel perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Voor Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie scheiding van lymfocyten uit een buffy coat of leukoferese pack, eerst verdunnen gehepariniseerd bloed met een gelijk volume van 1X PBS bij kamertemperatuur.
2. Voeg 15 ml Ficoll (opgewarmd tot kamertemperatuur) tot 50 ml conische buizen. Langzaam overlay25 ml van het verdunde bloed mengsel op de Ficoll. Centrifugeer bij 2000 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur met de rem uit.
3. Verwijder voorzichtig de lymfocyt-interface (witte ring tussen de media en Ficoll) met een Pasteur pipet en over te dragen aan een nieuwe 50 ml conische buis.
4. Spoel de cellen door het opvullen van de buis 50 ml met PBS en centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en combineren de buizen van een persoon aan een buis en nawassen het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) met 20 ml PBS. Vervolgens telt de PBMC en resuspendeer in een concentratie van 5 x 10 ⁷ cellen / ml in MACS buffer (1 L PBS zonder ^{Ca2 + en} Mg2 ^+, 5 g BSA, en 2 mmol EDTA).
5. Om de T-cel fractie te isoleren, te beginnen met 2 ml van PBMC (10 ⁸ cellen) en voeg 100 ul Pan T cel verrijkingscocktail oplossing uit de EasySep Human T Cell Enrichment Kit. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
6. Voeg 100 ul van magnetische deeltjes aan de oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende nog 10 minuten. Breng het uiteindelijke volume van het oplosmiddel tot 2,5 ml en plaatst de buis in de paarse magneet gedurende 5 minuten. Snel giet het CD3 ⁺ fractie in een 15 ml conische buis.
7. Spoel de cellen door toevoeging van 5 ml koud MACS buffer, telt het aantal levensvatbare cellen en verwijderen van een aliquot van FACS kleuring.
8. De CD161 ⁺ cellen, eerste hersuspenderen verrijkte T cellen te selecteren in 980 ul ijskoude MACS buffer, voeg 10 ug anti CD161 mAb, en incubeer in de koelkast gedurende 10 minuten.
9. Centrifugeer de cellen bij 1500 rpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Vervolgens reconstrueren de celpellet in 800 ui MACS buffer. Voeg 200 ul van anti-muis IgG1 microbeads en incubeer de oplossing gedurende 10 min bij 4 ° C.
10. Tijdens deze incubatiestap equilibreer een LS kolom door 3 ml MACS buffer.
11. Vervolgens was de cellen door centrifugeren 1500 rpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Automabrengen de cellen in 3 ml MACS buffer. Pipetteer dan de cellen in de LS MACS scheidingskolom. Zorg ervoor dat u het genereren van luchtbellen te vermijden door pipetteren langzaam. Spoel de kolom door 3 ml MACS buffer. Tweemaal herhalen.
12. Voeg 3 ml verse MACS buffer en verwijder kolom van magneet. Plaats de kolom in een 15 ml conische buis. Plaats zuiger en duwen inhoud aan gezuiverd CD161 ⁺ CD3 ⁺ cellen te verkrijgen. Graaf NKT cel verrijkt fractie. Je moet over 2-4 miljoen cellen.

3. AAPC-gemedieerde NKT celexpansie

1. In co-cultuur door 10 ⁶ verrijkte CD161 ⁺ CD3 ⁺ T-cellen en 10 ⁶ AAPC in 16 ml compleet medium (compleet medium + IL-2, 100 U / ml). Plate dit mengsel door het toevoegen van 160 ul / putje eindvolume van een 96 well weefselkweek behandeld polystyreen, U-bodemplaat met lage verdamping deksel. Voer medium uitwisseling elke ⁷ de dag door het toevoegen van 80 pl vers medium.
2. Oogstcellen, tellen, en het uitvoeren van FACS-kleuring op dag 12-14.
3. De geëxpandeerde NKT cellen worden opnieuw uitgeplaat zoals hierboven beschreven in stap 3.1, specifiek 10 ⁶ geëxpandeerde T-cellen en 10 ⁶ AAPC resuspenderen in 16 ml compleet medium. Plaat dit mengsel door toevoeging van 160 ul / putje van een 96 putjes U-bodemplaat. Blijven co-cultuur medium vernieuwen elke ⁷ de dag door het toevoegen van 80 pl vers medium.
4. Het beste is om extra NKT cellen in te vriezen na de tweede ronde van expansie (1 x10 ⁶ / Cryovial in 1 ml-5% DMSO / 95% FBS.)

4. Functionele Test: AAPC-gemedieerde stimulatie van NKT-cellen

1. Stel 5x10 ⁴ NKT cellen / putje met 5x10 ⁵ AAPC in 200 ul eindvolume (compleet medium) in 96 en U-bodemplaat.
2. Harvest celkweeksupernatant voor ELISA na 24-48 uur.

Resultaten

Hierin beschrijven we een werkwijze voor het CD1d-Ig based AAPC, door covalente koppeling van CD1d-Ig en anti-CD28 mAb aan magnetische kralen NKT cellen te stimuleren als standaardmethode voor de vermeerdering van NKT cellen (Figuur 1). Eerste moet men aantonen dat de CD1d-Ig-fusie-eiwitten stabiel worden geïmmobiliseerd op het oppervlak van de magnetische korrels. Zoals getoond in Figuur 2A, CD1d-Ig en anti-CD28 antilichamen werden zowel op het oppervlak van de magnetische korrels. De stimulerende capaciteit van de AAPC onderzoeken we samen gekweekt NKT-hybridoma 's nachts met AAPC, geoogst en de kweeksupernatanten gemeten IL-2 door ELISA. We vonden dat CD1d-Ig based AAPC konden de NKT-hybridoma stimuleren op gelijk aan of hoger dan hun cellulaire tegenhangers (Figuur 3, gegevens niet getoond). Interessant vonden we dat onze muis NKT-hybridoma gestimuleerd door menselijke CD1d gebaseerde AAPC (Figuur 2B), die eenvoudige methode voor het testen van elke partij AAPC biedt.

Vervolgens zochten we de mogelijkheden van verspreiding AAPC tonen, werden aldus humane T-cellen geïsoleerd uit het perifere bloed. Eerste CD161 ⁺ CD3 ⁺ T celfractie werd verrijkt door magnetische korrels scheiding. Daarna werden de T-cellen gestimuleerd met tweewekelijkse α-GalCer-geladen AAPC. Belangrijker vonden we dat zelfs met een relatief lage initiële NKT-celpopulatie (0,03%), konden we de cellen uit te breiden tot ~ 67% Vα24 ^{+ +} Vβ11 (figuur 3). We hebben uitgebreid NKT cellen uit de PBMC van vele gezonde vrijwilligers en kankerpatiënten en hebben gevonden dat α-GalCer loaded AAPC konden de NKT cellen uitbreiding populatie in beide groepen. Met name de uitbreiding tarief was zeer donor afhankelijk. Zoals verwacht hoe hoger de initiële populatie van Vα24 ⁺ cellen, hoe groter het percentage expansie. Bovendienbij gebruik van een uitgangspopulatie van 2 miljoen cellen CD161 ⁺ CD3 ⁺ T-cellen kan men> 10 ⁷ cellen te verkrijgen na twee expansie (tabel 1). Ongeveer 80-90% van de geëxpandeerde NKT cellen CD4 ^+, ~ 5% CD8 ⁺ en de resterende zijn waarschijnlijk CD4-CD8-dubbelnegatieve NKT cellen. Deze uitgebreide NKT cellen kunnen worden gebruikt voor functionele studies zie figuur 4A-C. We hebben gevonden dat onze ex vivo geëxpandeerd NKT cellen kunnen reageren op α-GalCer stimulatie en zijn krachtige producenten van IL-17A, TNF-α en IFN-γ. Er zij opgemerkt dat indien de initiële T-cel verrijking bevolking laag en een niet in staat is de tweede CD161 verrijkingsstap te voeren, de AAPC gemedieerde expansie niet de verwachte resultaten (zie figuur 4D, Donor 1) verkregen. Echter, indien het percentage van circulerende NKT cellen hoger is dan 0,1%, moet men nog steeds een aanzienlijke expansie verkrijgeni NKT cellen. Tezamen zijn deze gegevens aan dat CD1d based-AAPC kan worden gebruikt om effectief vergroten en stimuleren primaire humane NKT cellen.

Figuur 1. Schematische weergave van CD1d: Ig-gebaseerde aAPCs extracellulaire gedeelten van de CD1d molecule worden gefuseerd aan het constante gebied van een immunoglobuline zware keten eiwit gescheiden door een korte aminozuur linker. Deze moleculen kunnen eenvoudig worden geladen lipide antigenen, zoals α-GalCer, eenvoudigweg door te incuberen met een overmaat van het lipide van belang. AAPC werden gemaakt door koppeling CD1d-Ig en anti-CD Abs aan magnetische korrels. In dit systeem wordt CD1d-Ig gebruikt om de cognate antigen-specifiek signaal levert via de TCR en anti-CD28 mAb geeft het co-stimulerende signaal.

Figuur 2. . FACS kleuring van oppervlakte-eiwitten op aAPCs A) aAPCs werden getest op de aanwezigheid van CD1d: IgG dimeer (via kleuring met PE-geconjugeerd anti-muis IgG1) en anti-CD28 antilichaam (met FITC-geconjugeerd anti-muis IgG2a) . Open histogrammen geven isotype controle; gevulde histogrammen geven de aangegeven antilichamen. CD1d-Ig uitdrukken AAPC kunnen stimuleren IL-2 productie door NKT cellen. B) De Vα14 ⁺ muis NKT cel hybridoma, DN32.D3, werd gekweekt samen met ofwel medium, oplosbaar antigeen (α-GalCer), gelost AAPC of α-GalCer-loaded AAPC. Kweeksupernatanten werden geoogst en standaard sandwich ELISA werd gebruikt om IL-2 productie te meten.

Figuur 3. Uitbreiding NKT cellen door CD1d-Ig beklede kunstmatige antigen presenterende cellen. (A) Primaire CD3 ⁺ CD161 ⁺ dubbele positieve cellen werden geïsoleerd uit PBMC met magnetische scheiding. De gesorteerde cellen werden gestimuleerd met α-GalCer loaded, CD1d-Ig beklede AAPC gedurende 14 dagen. De cellen werden gekleurd voor Vα24 en Vβ11 volgende AAPC stimulatie. (B) primaire humane NKT cel gemedieerde lysis van B-cellymfoom lijn. C1R-CD1d NKT cellen geïncubeerd met cellen in de aangegeven verhoudingen in de aanwezigheid of afwezigheid van antigen, a-GalCer (100 ng / ml) in 96-well U-bodem platen gedurende 20-24 uur. NKT cel gemedieerde lysis werd bepaald door volgens standaard 51Cr-release assay.

Figuur 4. Cytokine profielen van AAPC-geëxpandeerde NKT cellen. Na stimulatie met α GalCer geladen AAPC gedurende twee weken, de uitgebreide NKT cellen (1 x 10 ⁵ / putje) werden gekweekt samen met oplosbare α-GalCer, PMA / Ionomycine, anti-CD3/28 microbolletjes, of α-GalCer geladen AAPC (2 x 10 ⁵ / putje) gedurende 48 uur. (A) IL-17A, (B) TNF-α en (C) IFN-γ productie werd gemeten door standaard ELISA cytokine. De getoonde gegevens zijn netto cytokine productie na aftrek van de negatieve controles (media en leeg kralen). (D) Primaire T-cellen werden geïsoleerd uit PBMC met magnetische korrels scheiding. De gesorteerde cellen werden gestimuleerd gedurende twee weken met de aanduiding a-GalCer geladen-AAPC. De cellen werden gekleurd met specifieke Abs voor Vα24 ⁺ en ⁺ Vβ11 en geanalyseerd door flowcytometrie.

Discussie

AAPC kan worden gebruikt om de basis voor NKT celactivering bestuderen en heeft potentiële klinische waarde voor ex vivo expansie van NK T cellen voor adoptieve immunotherapie. Mescher et al.. Beschreef een van de eerste kraal systemen waar gebiotinyleerde muizen MHC klasse I-peptide-constructen werden enkele keten gecombineerd met gebiotinyleerd costimulatoire moleculen B7.1 en B7.2 via streptavidine op het oppervlak van latex microsferen ^{14, 15.} Deze aanpak is succesvol gebruikt om antigenspecifieke T-cellen uit transgene muizen te stimuleren. Bovendien, omdat deze benadering gebruikt een enkele keten MHC-peptide complex te zorgen voor een homogene belasting van de MHC moleculen zou elk doel antigen peptide dat een nieuwe transfectie voor expressie van het gewenste enkele keten MHC-peptide complex, waardoor het algemene karakter van de aanpak. Belangrijk is dat Dr Schneck groep een pionier in de kraal op basis-AAPC, door het ontwikkelen van een andere niet-cellulaire kraal op basis van AAPC, Gemaakt door koppeling HLA-Ig, signaal 1 en anti-CD28, signaal 2, op magnetische beads. HLA-Ig, een unieke multimere vorm van HLA gefuseerd aan een immuunglobuline moleculaire scaffold ^{16, 17} is ontwikkeld door zijn groep. Vervolgens ontwikkelden ze MHC-Ig based AAPC, waarvan is aangetoond effectief vergroten CMV en MART-1 specifieke CTL ^18. Hier hebben we aangetoond dat CD1d-Ig based AAPC kan worden gebruikt om functionele NKT cellen vergroten. Een studie gebruikt een gelijkaardig systeem dat de fysische interactie van NK cellen onderzoeken met CD1d ^19.

Met name hebben we speciaal een kunstmatige antigen presenterende cel die is aangepast aan de eisen er nodig zijn voor optimale NKT celproliferatie. De AAPC uitbreiding methode biedt een eenvoudige en betrouwbare methode voor het uitbreiden en verrijken menselijke NKT cellen. Onze AAPC kan worden aangepast aan systematische evaluatie van de rol van een reeks van potentiële co-stimulerende moleculen en beoordelen hun rol op NKT cel proliferatietie en functie. Zo AAPC vormen een solide veelzijdige technologie nuttig is voor het induceren en het uitbreiden van NKT-cellen. Het genereren van aAPCs duurt minder dan een week en is geschikt voor de productie van grote hoeveelheden kralen. Een kritische stap in het genereren van de AAPC bevestig dat CD1d-Ig stabiel is geïmmobiliseerd op het oppervlak van de korrels en hun functionaliteit te beoordelen consistentie van partij tot partij. Een mogelijke beperking van het systeem is dat er geen mechanisme is dat schakelen stimulatie, andere dan mechanische verwijdering van de korrels. Specifiek, de betrokkenheid van de T cel receptor (TCR) met het antigeen: CD1d/MHC complex genereren doorgaans de immunologische synaps in overleg met toebehoren / adhesie moleculen, wat kan resulteren in de inductie van remmende of onderdrukkende factoren op zowel de T-cel en antigen presenterende cel. In het AAPC systeem kunnen deze factoren worden verhoogd door de T-cel, maar de hiel niet uitdrukken verwante ligandenvoor deze receptoren.

Bovendien CD4 ⁺ NKT-cellen is aangetoond antitumor responsen bij muizen en mensen te onderdrukken, dan is het mogelijk dat niet-selectieve activering van NKT cellen (dwz global stimulatie met α-GalCer) of activering van het verkeerde deelverzameling kan leiden tot ongewenste immunologische uitkomsten. Bijgevolg moet men fenotypisch en functioneel karakteriseren van de AAPC-geëxpandeerde NKT celpopulatie. Zoals getoond in figuur 4, hebben wij gevonden dat stimulatie met α-GalCer-geladen AAPC expressie anti-CD28 kan NKT cellen die Th1, Th2 en Th17 type cytokinen leiden. Murine studies hebben gemeld dat uitdaging met IL-33, een recent geïdentificeerde cytokine, resulteerde in verhoogde niveaus van circulerende inflammatoire cytokines zoals IL-5 en IL-13. Behandeling van NKT cellen met IL-33 vergroot hun cytokine productie ^20. IL-33 is een specifieke ligand voor ST2 en het is aangetoond dat oplosbare ST2 can blok IL-33 signalering. Dus, als een voorbeeld van een toekomstige toepassing, kan AAPC expressie ST2 worden gegenereerd en gebruikt om te bepalen of kon selectief remmen de productie van Th2 cytokines induceren terwijl Th1 cytokine secretie door NKT cellen. Ook is gemeld dat iv injectie van Kb-expressie AAPC in C57BL / 6 muizen resulteerde in verminderde longmetastase van tumor ^21. Belangrijk, deze gegevens demonstreren dat AAPC verkeer naar de longen en kunnen effector T-cel subsets te activeren. Daarom zou men genereert meerdere soorten AAPC en onderzoekt de wisselwerking tussen antigeen specifieke T-cel subsets. Samengevat, deze studies tonen aan dat CD1d-Ig based AAPC kunnen worden gebruikt om normale cellulaire APC vervangen en moet het potentieel om de huidige klinische benaderingen voor NKT-cellen gebaseerde adoptieve immuuntherapie verbeteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17-1440
EasySep humane T-cel Enrichment Kit	StemCell Technologies	19051
Allophycocyanine CD161 menselijke mAb	Pharmingen	550968
EasySep Magneet	StemCell Technologies	18002
Anti-muis IgG 1 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-047-101
Dimeer XI recombinant oplosbaar Dimere Mouse CD1d: IG Fusieproteïne	BD Biosciences	557599
Anti-CD28 mAb	Biolegend	302914
M-450 Epoxy beads	Life Technologies	150-11
Alpha-galactosylceramide (KRN7000)	Axxora, LLC	BML-SL232-0100
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R 0883
Natriumpyruvaat	Gibco	11360-070
Niet-essentiële aminozuren	Gibco	11140-050
Vitamine Solution	Gibco	11120-052
2-mercaptoethanol	Gibco
Ciprofloxacine	Alexis Biochemicals	380-288-G025
PE-Vα24Jα18	Biolegend	342904
PE-Vα24 (Clone C15)	Beckman Coulter	A66907
FITC-Vβ11 (Clone C21)	Beckman Coulter	A66905
PE-CD1d	Biolegend	123510
PE antimurien lgG1	BD Biosciences	556650
FITC anti-muis IgG2a	Biolegend	407105
DPBS, geen calcium, magnesium no	Life Technologies	14190250
Natriumazide	Sigma Aldrich	S8032
Bovine Serum Albumine	Amerikaanse Bioanalytisch	AB00440-00100
EDTA	Sigma Aldrich	431788
IL-2 (Proleukin)	BD Biosciences	354043
Human AB Serum	Atlanta Biologicals	S40110
Labquake Tube Rotator	Fisher Scientific	13-687-10Q
BD Falcon 5 ml polystyreen ronde bodem buizen	Fisher Scientific	14-959-1A
Wheaton Glas Monsterflesjes met Cap	Fisher Scientific	Kleine (03-343-6A) Grote (03-343-6E)