Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode C. elegans

Samenvatting

We laten zien hoe u de RNAi voeden techniek te gebruiken om knock down doelwitgenen en score lichaamsgrootte fenotype in C. elegans. Deze methode kan worden gebruikt voor een grote scherm potentiële genetische componenten van belang, zoals die welke in lichaamsgrootte regulering door DBL-1/TGF-β signalering identificeren.

Samenvatting

Dubbelstrengs RNA-gemedieerde interferentie (RNAi) is een effectieve strategie om knock down doelwit genexpressie ^1-3. Het is toegepast op vele modelsystemen zoals planten, invertebraten en vertebraten. Er zijn verschillende methoden om RNAi bereiken in vivo ^4,5. Bijvoorbeeld, het doelwitgen kan worden omgezet in een RNAi vector, en vervolgens permanent of tijdelijk omgezet in cellijnen of primaire cellen gen knockdown effecten te bereiken, als alternatief gesynthetiseerde dubbelstrengs oligonucleotiden van specifieke doelgenen (RNAi oligos) kan tijdelijk worden omgezet in cellijnen of primaire cellen doelgenen zwijgen, of gesynthetiseerde dubbelstrengs RNA moleculen worden gemicroinjecteerd in een organisme. Aangezien de nematode C. elegans gebruikt bacteriën als een bron van voedsel, het voeden van de dieren met bacteriën die dubbel-strengs RNA tegen target genen biedt een levensvatbare strategie ^6. Hier presenteren we een RNAi voedenmethode om lichaamsgrootte fenotype scoren. Lichaamsgrootte in C. elegans wordt primair gereguleerd door de TGF-β - zoals ligand DBL-1, zodat deze test is geschikt voor identificatie van TGF-β signaleringscomponenten ^7. We verschillende stammen gebruikt, waaronder twee RNAi overgevoelig stammen aan de RNAi voeden experimenten te herhalen. Onze resultaten laten zien dat RRF-3 stam gaf ons de beste verwachte RNAi fenotype. De methode is eenvoudig uit te voeren, reproduceerbare en gemakkelijk gekwantificeerd. Verder is onze protocol minimaliseert het gebruik van gespecialiseerde apparatuur, dus het is geschikt voor kleinere laboratoria of aan degenen met voornamelijk undergraduate instellingen.

Protocol

1. Het voorbereiden van RNAi voeden Platen uitvoeren Target gensequentie

1. Bij gebruik van in de handel verkrijgbare RNAi bibliotheken (bijv. vanuit de Bron BioScience LifeSciences), ga dan verder met stap 1.4. U kunt ook klonen target-gen-sequenties in vector L4440, een veelgebruikte worm RNAi plasmide ^8, door standaard klonen protocol.
2. Transformeren het recombinant plasmide in bacteriële stam HT115 (DE3) kweken ervan op LB-agarplaten met 25 mg / ml carbenicilline en 12,5 pg / ml tetracycline en kies een enkele kloon voor toekomstig gebruik.
3. Ondertussen transformeren de lege vector L4440 in bacteriële stam HT115 gebruikt als controle voor de experimenten.
4. Cultuur zowel recombinant en lege L4440-dragende bacteriën in 1 ml LB-bouillon met 100 ug / ml ampicilline overnacht bij 37 ° C. Tetracycline is niet te wijten aan het feit dat het rendement af RNAi toegevoegd.
5. Voeg een 5 ml LB-bouillon met 100 ug / ml ampicilline overnacht in de culture, incubeer een 4-6 uur bij 37 ° C.
6. Zaad 0,5 ml recombinant of lege L4440-dragende bacteriecultuur op de RNAi worm platen. Label alle platen met kloon naam.
7. Markeer de platen en incubeer overnacht bij 37 ° C tot bacteriedek groeien, zijn de RNAi platen met of zonder doelgen sequentie. Minstens 2 platen moeten worden voorbereid voor elke conditie.

2. Cultuur Worms op de RNAi Feeding Platen

1. Flame steriliseren de punt van een platina draad worm keuze. Gebruik de worm pakken op te halen zes-tien vierde larvestadium is gekomen (L4) hermafrodieten aan elk RNAi plaat die ofwel recombinant of lege L4440 bevat; zullen de dieren de bacterie te gebruiken als een bron van voedsel.
2. Laat hermafrodieten groeien bij 20 ° C (standaard kweekomstandigheid voor C. elegans) nacht, zullen ze jongvolwassenen de volgende dag.
3. Overdracht 6 tot 10 jonge volwassenen in een nieuwe navenant gelabeld en bereid RNAi plaat.
4. Laat devolwassenen leggen eieren voor 4-6 uur, en verwijder vervolgens alle volwassenen van de plaat, deze stap is het synchroniseren van de nakomelingen. Zodra de moeders worden verwijderd, start de tijd te tellen. Dit tijdstip nul.
5. Incubeer de platen bij 20 ° C te laten dieren groeien op specifieke ontwikkelingsfase, in dit protocol, kiezen we jonge volwassenen voor fenotypische analyse. Voor knockdowns die zich ontwikkelen in een normaal tempo, 72 uur incubatie is voldoende voor dieren te worden jonge volwassenen. Echter, verschillende genen beïnvloeden dierlijke ontwikkeling anders. Als RNAi veroorzaakt dieren om te groeien in een ander tempo, kunnen jonge volwassenen worden geïdentificeerd als die niet meer dan 24 uur voorbij L4 met afgerond vulva ontwikkeling en 2-6 embryo's in de baarmoeder (indien vruchtbaar). Om andere ontwikkelingsstadia te identificeren, moet de onderzoeker gonadale en vulva ontwikkeling gebruiken als een gids.

3. Score Lichaam Grootte fenotypen van RNAi behandeld Worms

1. Worden twee lagen gekleurde label tapes op een glasplaatje. Maak twee van dese glazen dia's. Dan, plaats een nieuw glasplaatje in tussen de twee dia's met tape. Smelt 2% agarose in water, een druppel naar het centrum van de nieuwe glasplaatje, vandaar de tweede glaasje druk op de top van een dunne laag van 2% agarose zoals eerder beschreven ^negen maken.
2. Zodra agarose is gestold, verwijder de bovenste glasplaatje, de dia met agarose pad is klaar om wormen te laden. Label dia met kloon naam.
3. Voeg 10 ul 25 mM NaN ₃ om de agarose pad; halen 30 tot 40 dieren in het NaN ₃ oplossing om ze te immobiliseren, dan dekglaasje op de top; herhaling voor zowel recombinant en lege L4440-dragende RNAi-behandelde dieren.
4. Afbeelding van de wormen onder dissectiemicroscoop met 2.5x objectief, hier hebben we Leica digitale camera met ondersteunende software Qcapture.
5. Voor het kalibreren, eerst een opname van een standaard micrometer heerser. Vervolgens opent u de afbeelding in Image-Pro software, klik op "maatregel" en kies "kalibratie" en kies"Ruimtelijke kalibratie wizard". Met "het kalibreren van de actieve afbeelding" geselecteerd, klikt u op "volgende". Voer de naam voor de kalibratie en ervoor te zorgen dat de ruimtelijke referentie-eenheden zijn ingesteld op micrometer. Controleer vervolgens de "een verwijzing kalibratie" knop en klik op "volgende". Klik op "draw referentielijn." Een verwijzing schaal balk verschijnt. Plaats de schaalbalk aan de uiteinden van de micrometer overeenkomen, dan blijkt dat de verwijzing 1.000 eenheden aangeeft. Klik op "OK", "Volgende" en "Voltooien".
6. Zodra de software is gekalibreerd, opent een worm beeld. Selecteer vervolgens onder de "maatregel" menu, selecteer "kalibratie" en klik vervolgens op "select ruimtelijke". In het pull down menu, selecteer de bestandsnaam gemaakt voor de micrometer kalibratie. Vervolgens onder de "maatregel" menu, selecteer "metingen." In het venster dat opent, selecteert u de gratis-draw tool en trek een lijn door het midden van het dierlijk lichaam van kop tot staart met computermuis (figuur 1). De lengte zal worden gerapporteerd in het venster. Nuje hebt twee groepen gegevens: lichaamslengte van dieren die zijn behandeld met target-gen RNAi en controle dieren behandeld met lege L4440 vector.
7. Exporteer de lengte metingen naar een Microsoft Excel-bestand, of een andere geschikte statistische software. Analyseren van de gegevens door het berekenen van het gemiddelde en standaardafwijking voor elk monster. Vergelijk monsters met Student's t-test.

Resultaten

In ons onderzoek richten we ons op de lichaamsgrootte regulering door de DBL-1/TGF-β pad. Het verlies van functie van de DBL-1-route resulteert in kleine lichaamsgewicht, met een kortere lengte vergeleken met wild-type dieren ^7,10,11. Zo schermen voor C. elegans lichaamsgrootte mutanten kunnen identificeren TGF-β signalering componenten en modificatoren. DBL-1-signalering wordt gemedieerd door een geconserveerd TGF-β signaaltransductieroute die celoppervlak receptoren en intracellulaire Smad signaal ...

Discussie

In dit protocol beschrijven we onze methode voor de identificatie van lichaamsgrootte defectieve mutanten van C. elegans door RNAi voeden. Deze methode is van toepassing op de identificatie van TGF-β uitschakeling. Aangezien dergelijke onderdelen worden geconserveerd door evolutie ^15, zoals schermen relevant zijn voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van TGF-β signalering in alle metazoa. Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een dergelijk scherm is de uitgangsstam. We hebben ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
			RNAi worm platen 17,7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Voeg H 2 O tot 3 liter. Autoclaveren. Voeg 3 ml 1M IPTG (steriel) en 3 ml 25 mg / ml carbenicilline (steriel) giet in 60 mm petrischalen. Worm platen 17,7 g Worm Medium Mix 0,6 g streptomycinesulfaat 60 g Agar Voeg H 2 O tot 3 liter. Autoclaveren. Giet het mengsel in 60 mm petrischalen. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg cholesterol 200 g NaCl Meng grondig en zorgt ervoor dat brokken voorkomen, dit poedervormig mengsel kan worden opgeslagen gedurende vele maanden voor gebruik. 2% agarose 0,5 g Agarose Advertentied 25 ml dH 2 O. Hitte in de magnetron totdat het is opgelost. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Los IN10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaN3 Voeg dH 2 O tot 100 ml 25 mM NaN3 2,5 ml 1M NaN 3 Voeg dH 2 O tot 100 ml Caenorhabditis elegans van Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmide (draagt ​​ampicilline-resistentiegen) Bacteriënstam HT115 (DE3) (bevat IPTG induceerbare T7 polymerase, deficiënt voor RNAse III-gen (a dsRNAse) waarop ook tetracycline-resistentiegen) 16 60 mm Petrischalen 100 mm Petrischalen 14 ml ronde bodem Falcon kweekbuisjes objectglaasjes dekglaasjes 1 tot 20 ul pipet 20 tot 200 ul pipet 200-1000 ulpipet 1 tot 200 ul pipet tips 200-1000 ul pipet tips 1,5 ml Eppendorf buisjes platina draad worm pick