Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen

Samenvatting

Een high-content screening methode voor de identificatie van nieuwe signalering bevoegde transmembraanreceptoren beschreven. Deze methode is ontvankelijk voor grote schaal automatisering en maakt voorspellingen In vivo Eiwitbinding en de subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen in zoogdiercellen.

Samenvatting

Signaaltransductie door groeifactorreceptoren essentieel is voor cellen proliferatie en differentiatie behouden en heeft strakke controle. Signaaltransductie geïnitieerd door de binding van een ligand aan een externe transmembraan receptor en de activering van stroomafwaartse signalering cascades. Een van de belangrijkste regulator van mitogene signalering is Grb2, een modulair eiwit bestaat uit een interne SH2 (Src homologie 2) domein geflankeerd door twee SH3 domeinen die enzymatische activiteit ontbreekt. Grb2 wordt constitutief geassocieerd met de GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via de N-terminale SH3 domein. De SH2 domein van Grb2 bindt aan groeifactorreceptoren op gefosforyleerde tyrosineresiduen aldus koppeling receptor activatie van de SOS-Ras-MAP kinase signalerende cascade. Daarnaast zijn andere rollen voor Grb2 als positieve of negatieve regulator van signalering en receptor endocytose beschreven. De modulaire samenstelling van Grb2 suggereert dat het kan koppelen aan verschillende receptoren en transduce signalen langs een veelheid van verschillende paden ^1-3.

Hier beschreven is een eenvoudige test die microscopie werving van Grb2 bewaakt naar de plasmamembraan. Het is een bewerking van een test waarmee veranderingen in subcellulaire lokalisatie van groen-fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Grb2 in reactie op een stimulus ^4-6 meet. Plasmamembraan receptoren die Grb2 zoals geactiveerde Epidermale Groei Factor Receptor binden (EGFR) werven GFP-Grb2 aan het plasmamembraan op cDNA expressie en vervolgens verplaatsen naar endosomale compartimenten in de cel. Ter identificatie in vivo eiwitcomplexen van Grb2 Deze techniek kan worden gebruikt om een genoomwijde high-content scherm gebaseerd op veranderingen in Grb2 subcellulaire lokalisatie voeren. De bereiding van cDNA expressieklonen, transfectie en beeldacquisitie worden hieronder in detail beschreven. Vergeleken met andere genomische methoden voor eiwit interactie te identificeren partners, zoals gist-twee-hybrid, deze techniek kan de visualisatie van eiwitcomplexen in zoogdiercellen de subcellulaire plaats van interactie met gewone microscopie gebaseerde bepaling. Vandaar dat beide kwaliteitskenmerken, zoals patronen van lokalisatie kan worden beoordeeld, en de kwantitatieve sterkte van de interactie.

Protocol

1. Picking cDNA Expression Clones

1. De cDNA-bibliotheek wordt als losse bacteriële klonen in glycerol voorraad in een 96-well formaat. Met de Rearray commando in het menu van de picker Norgen CP7200, kies bacteriële klonen van de bron plaat en ent in 1,5 ml LB / amp in een 96-deepwell (1 ml well) plaat.
2. Dicht de deepwell platen met een gasdoorlatend afdichting en incubeer overnacht bij 37 ° C in een shaker.

2. Bereiding van cDNA Expression Library

1. Draai de deepwell platen die de bacteriën bij 2000 rpm gedurende 20 min met adapters plaat in een tafelcentrifuge.
2. Zuig de putjes van media, waarbij de bacteriële pellet intact.
3. Configureert het dek van het Lab Automation werkstation zoals getoond in figuur 2. Oplossingen voor plasmidebereiding worden verdeeld in bakken 1-5 en de deepwell plaat aan dek. Een trog met multiwell elutieoplossinggeplaatst naast de deepwell plaat. Tips worden geladen in de punt rekken.
4. Monteer de vacuum manifold. Het plasmide verbindingsplaat is geplaatst in het verdeelstuk en het plasmide filter plaat wordt boven op het verdeelstuk.
5. Resuspendeer pellets met 250 ul Oplossing 1 (Resuspensie buffer) door op en neer pipetteren.
6. Lyse de bacteriën door toevoeging van 250 pi Oplossing 2 (lysisbuffer). De plaat wordt afgesloten en omgekeerd om volledige menging.
7. Start 2 min. timer.
8. Voeg 350 ul Oplossing 3 (neutralisatie buffer). Sluit de plaat en omkeren 3 keer.
9. Breng de bacteriële lysaten het plasmide filterplaten.
10. Toepassing vacuum gedurende 5 minuten.
11. Verwijder het filter en plaats de bindende plaat op de top van het spruitstuk. Toepassing vacuum gedurende 1 min.
12. Voeg 500 ul van extra wassen (AW) buffer.
13. Toepassing vacuum gedurende 2 minuten.
14. Voeg 900 ul van wasbuffer Oplossing 4. Toepassing vacuum gedurende 2 minuten.
15. Herhaal step 2.14. Toepassing vacuum nog 15 min.
16. Plaats DNA collectie plaat in het spruitstuk. Voeg 100 ul elutiebuffer de verbindingsplaat en incubeer gedurende 2 minuten.
17. Vacuüm gedurende 10 minuten.
18. Verwijder de collectie plaat en meet DNA-concentratie met behulp van de NanoDrop 8000. Typisch een opbrengst van ~ 100 ng / ul te verwachten met deze methode.

3. Cel Zaaien

1. HEK293 cellen getrypsineerd en geteld.
2. 2 x 10 ⁴ cellen gedispenseerd in elk putje van een PerkinElmer Viewplate met de ThermoFisher 96-well multidrop.
3. Cellen worden overnacht geïncubeerd bij 37 ° C en _5% CO2.

4. Transfectie

1. Bereid een mix van 100 ng GFP-Grb2 plasmide DNA met 100 ng cDNA in 25 ul serumvrij medium per putje in een ronde bodem 96-well plaat.
2. Voeg 25 ul serumvrij medium met 0,5 pl per well Transfectin.
3. Meng en start timer for 30 min.
4. Breng 50 pl cDNA / Transfectin mix aan cellen met een zachte afgifte methode. Als alternatief kan de transfectie mix eerst verdeeld in platen en cellen toegevoegd geplaatst (reverse transfectie).
5. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C en _5% CO2.

5. Image Acquisition

1. Start Opera software. Een scherm snapshot van het experiment instelling wordt getoond in figuur 3. Selecteer de "Configuratie" tabblad en selecteer 20x objectief en de juiste plaattype. Zorg ervoor dat "kraag" is ingesteld op de juiste waarde van het doel mogelijk te maken richten met verschillende soorten platen.
2. Selecteer de "Microscoop" tabblad. Definieer blootstelling 1 als FITC (488 laser) en blootstelling 2 als UV (365 laser). Activeer de UV-filter op beide blootstellingen en wijs blootstelling 1 tot en met camera 1 en blootstelling 2 tot camera 2. Stel belichtingstijden tot 800 msec voor blootstelling 1 en 40 msec voor blootstelling 2.
3. Selecteer de "Microscoop" tabblad. Definieer eXposure 1 als FITC (488 laser) en blootstelling 2 als UV (365 laser). Activeer de UV-filter op beide blootstellingen en wijs blootstelling 1 tot en met camera 1 en blootstelling 2 tot camera 2. Stel belichtingstijden tot 800 msec voor blootstelling 1 en 40 msec voor blootstelling 2.
4. Selecteer blootstelling 1. Stel richten hoogte 0 micron. Selecteer "Focus". Eenmaal gefocust, bloot camera 1. Pas de focus hoogte om de belichting vliegtuig te optimaliseren en op "Take hoogte" klikken. Wijzig de belichtingstijden en laservermogen tot een maximum pixel intensiteit van ~ 3.000 te geven. Sla blootstellingsparameters. Herhaal dit voor blootstelling 2.
5. Selecteer "Experiment Definitie" tabblad. Maak lay-out en sublayout. Sleep de desbetreffende lay-out, de belichting, referentiebeeld, skewcrop bestand en sublayout. Opslaan experiment.
6. Selecteer "Automatisch Experiment" tab en het verwerven van beelden.

6. Image Analysis (Gebaseerd op ImageJ 1.46h versie.)

1. Converteer de eigen PerkinElmer. Flex-bestanden te Tagged Image Format. Tif-bestand met behulp van deFlex2Volocity Acapella script.
2. 1. Beelden importeren in ImageJ een reeks afbeeldingen, resulterend in een stapel.
   2. Zet de stapel in een 2-kanaals HyperStack door het selecteren van de afbeelding / HyperStack / Stack om HyperStack menu-item. Het aantal segmenten moet worden ingesteld op de helft van de geïmporteerde stapel.
   3. Dupliceer de GFP kanaal met de Image / opdracht Dupliceren: kruis het dupliceren HyperStack selectievakje in en geef kanalen: 1-1. Hierna gebruikt de gedupliceerde stack.
3. Selecteer Proces / Enhance Contrast met 0,01% verzadigde pixels, met behulp van stapel histogram en om te zetten in 8 bit met Image/Type/8-bit.
4. Definieer een 15 pixel straal lokale adaptieve segmentatie met behulp van de Bernsen algoritme met contrast drempel (parameter 1) q = 30. Vink de Witte voorwerpen op zwarte achtergrond selectievakje in de Afbeelding / Aanpassen / Auto Lokaal Drempel menu.
5. Segmentatie kwaliteitscontrole: het genereren van gesegmenteerde object contour overlay op de originele beelden.
6. Featuopnieuw extractie door het analyseren van deeltjes: meetgebied, gemiddelde en totale intensiteit van elke organel. Sla resultaat bestanden.
7. Open de eigenschappen resultaat bestand in R en het genereren van een histogram.

7. Representatieve resultaten

Onder normale omstandigheden Grb2 gelokaliseerd in de hele cel. Na stimulering van een groeifactor receptor is verplaatst naar de plasmamembraan en wordt vervolgens geïnternaliseerd in endosomen zoals weergegeven in figuur 4. De expressie van een celoppervlak receptor kan binden Grb2 voldoende is om deze translocatie induceren. In een typisch experiment screening is geen verandering in GFP-lokalisatie Grb2 waargenomen. Wanneer echter een eiwit tot expressie dat rekruten Grb2 een subcellulaire site, een verandering in lokalisatie die gemakkelijk gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Bijvoorbeeld, expressie van de EGFR resulteert in herlokalisatie van GFP-Grb2 aan endosoom structuren (Figuur4). Dus bij toepassing van een genoomwijde bibliotheek kan worden verwacht dat nieuwe Grb2-bindende eiwitten van het celoppervlak worden geïdentificeerd.

Deze methode is niet beperkt tot de detectie van celoppervlakteproteïnen. Zo Dynamin2 induceert een verandering in subcellulaire lokalisatie van GFP-Grb2 getoond endosoom-like recruitment (Figuur 5). Dynamin2 bindt aan de C-terminale SH3 domein van Grb2 en is betrokken bij dit complex endocytose van ^9,10. Dus als uitgangspunt kan de identificatie van algemene eiwitbinding complexen en is niet beperkt tot de identificatie van interactiepartners voor het SH2-domein.

Verschillende typen translocatie kan worden verwacht zoals lokalisatie naar de plasmamembraan te endosomen andere cytoplasmatische vesiculaire structuren of de kern. Derhalve wordt aanbevolen dat alle beelden ook gecontroleerd door oog. Echter, bij het screenen van grote hoeveelheden cDNA geautomatiseerdebeeldanalyse algoritme is meer praktisch. In dit geval wordt een combinatie van algoritmen wenselijk zoals spot detectie endosomen cytoplasma / nucleus detectie identificeren nucleaire shuttling en algemene morfologische algoritmes identificeren celvorm veranderingen te identificeren. Het gebruik van deze verschillende fenotypische detectiemethoden is besproken in meer detail elders ^11.

Figuur 1. Algemeen schema van het experiment. Het experiment details een compleet high content workflow te beginnen met de versterking en de voorbereiding van de cDNA-bibliotheek, transfectie van cDNA vectoren plus reporterconstructen, beeldacquisitie en beeldanalyse met behulp van de gratis open software ImageJ.

Figure 2. Configuratie van de Tecan Deck. (1) Op de linkerkant, vijf 100 ml troggen moeten worden gevuld met buffers 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) en A4 (100 ml). Trog A4 moet eenmaal worden gevuld tijdens de procedure. (2) De vacuümbehuizing ligt op positie 14 in dit voorbeeld. (3) De plaat met deepwell bacteriële pellets ligt op positie 30, naast de elutiebuffer trog met 25 ml elutiebuffer. (4) Wegwerp tips voor de 8-kanaals head moeten worden geladen in de tip rekken aan de linkerzijde en tips voor de multichannel hoofd moeten worden ingevuld op positie 40. De Tecan FreedomEvo vloeistof handler die wordt gebruikt in dit experiment is uitgerust met 500 ul spuiten. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Figuur3. Automatisering van beeldacquisitie op de Opera LX. A) Selecteer het tabblad Configuratie (1). Laser activeren lijnen vereist voor het experiment (2). Selecteer de camera's voor beeldopname (3). Selecteer het plaattype en objectieflens voor de experiment (4). B) Selecteer de microscoop tab (1). Definieer de lichtbron en belichtingstijd voor blootstelling 1 (2,3). Focus op een goed en neem hoogte (4). C) Selecteer het Experiment tabblad Definitie (1). Sleep blootstelling, skewcrop, referentie, lay-out en sublayout bestanden (2). Sleep het experiment bestand (3). D) Selecteer Automatisch Experiment (1). Sleep experiment-bestand (2). Toekenning van passende barcode (3). Start beeldacquisitie door te klikken op de startknop (4). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4. GFP-Grb2 translocatie van cDNA expressie. GFP-Grb2 verhuist van een overheersende cytoplasmatische lokalisatie naar endosoom structuren bij overexpressie van een transmembraan groeifactor receptor en vervolgens internaliseert te endosomen. Aan de linkerkant zijn microscopiebeelden van COS M6 cellen aangetoond dat tijdelijk waren getransfecteerd met GFP-Grb2 (boven) of GFP-Grb2 plus EGFR (onder). Co-expressie van de EGFR resulteert in verplaatsing van GFP-Grb2 aan endosoom structuren.

Figuur 5. Voorbeeld van cDNA-geïnduceerde translocatie van GFP-Grb2. De GTPase Dynamin2, die betrokken is bij Grb2 endocytose, verplaatst GFP-Grb2 aan endosoom structuren (omcirkeld). In dit experiment werd GFP-Grb2 gecotransfecteerd met DNM2 in HEK293T cellen. Cellen werden gekleurd met Hoechst 33342 na 24 uur en beelden werden verkregen op Opera LX. Een zichtveld van de groene (GFP) kanaal en de UV (blue; Hoechst 33342) wordt weergegeven.

Discussie

Expressieklonering is een krachtig hulpmiddel dat gebruikt is in het verleden nieuwe cellulaire componenten zoals virus receptoren en antigenen bloedcel ¹² te identificeren. We beschrijven een methode voor de identificatie van nieuwe kandidaat signaaltransductie receptoren die binden aan Grb2 vergemakkelijken.

Er zijn een paar kritische stappen in het protocol.

1. Voor geautomatiseerde plasmide voorbereiding is het absoluut noodzakelijk om volledige resuspensie van de bacteriële pellet. Soms moet een strenge schudden stap of verder mengen met pipetten omvatten.
2. Na toevoeging van oplossing 2 en 3, volledige menging is essentieel en we hebben gevonden dat handmatig inverterende de gesloten plaat is efficiënter dan het gebruik van een geautomatiseerde shaker. Pipetteren dient vermeden te worden bij deze stap omdat het zou leiden tot afschuiven van het DNA.
3. In alle vacuum stappen men ervoor zorgen dat de vloeistof volledig wordt afgetaptvan de plaat. Anders lage opbrengsten te verwachten.
4. Na elutie is heel gebruikelijk dat eluaat vorm onderaan het plasmide verbindingsplaat verlaagt. Deze druppels moeten worden verzameld in de elutie plaat, dus het is aan te bevelen dat het plasmide binding plaat zorgvuldig wordt opgeheven en eventuele resterende druppels aan de onderkant worden zorgvuldig overgebracht naar het eluaat plaat.
5. Tijdens transfectie, de tijd van complexvorming is kritisch. We gewoonlijk voldoen aan 20-30 min. Langere tijden tot 1 uur zijn goed zonder vermindering in opbrengst, terwijl kortere tijden niet aanbevolen.
6. Voor de microscopie, de keuze van vergroting is belangrijk. Op de Opera LX-systeem hier wordt gebruikt, resolutie bij 20x is voldoende om beelden van hoge kwaliteit te krijgen. Als hogere resolutie vereist, het doel kan worden gewijzigd, maar om statistisch significante aantallen cellen te zijn een groter aantal velden en hogere Zoektijden vereist. In het algemeen streven wijten minste 100 cellen per putje afgebeeld te krijgen.

De Grb2 translocatie assay is gebruikt door andere groepen kleine molecule inhibitoren van EGFR kinase activatie ⁶ identificeren. In dat geval wordt de EGFR ligand specifiek geactiveerd waardoor werving van Grb2 naar de plasmamembraan. Verstoring van deze interactie kan vervolgens worden onderzocht met kleine moleculen bestaan. Ook kan het mogelijk zijn dat siRNA schermen kunnen worden gebruikt om endogene genen in EGFR-signalering Grb2 of Grb2-bindende groeifactor receptoren zoals c-KIT of erytropoëtinereceptor identificeren. Zo zijn er verschillende mogelijke toepassingen voor deze techniek. Een analoge benadering kan worden toegepast op GFP-gemerkte reporter systemen voor andere adapter moleculen zoals Shc, Gab of IRS.

Een groot voordeel van deze cel-gebaseerde test in zoogdiercellen is dat de identificatie van fysiologisch rel kunnenvante interacties. De assay is een indicatie voor eiwit complexvorming, maar nog belangrijker, de relevante interacties gecontroleerd op de juiste subcellulaire site. In dit verband deze techniek overwint artefacten andere eiwit-eiwit interactie methoden zoals yeast-two-hybrid of in vitro assays. Het moet echter worden opgemerkt, dat de indirecte interacties ook kan resulteren in Grb2 recruitment. Evenzo kan de transcriptionele opregulatie van bindingspartners worden geïnduceerd door cDNA expressie. Het onderscheid tussen deze mogelijkheden, moet het geschikte secundaire assays uitgevoerd om onderscheid te maken tussen directe en indirecte effecten binding.

Kortom, de GFP-adapter molecuul translocatie test belooft een groot potentieel voor genoom-brede screening en drug discovery programma's.

Materialen

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
cDNA bibliotheek	Origene
LB + amp
Gasdoorlatende afdichtingen	ThermoScientific	AB-0718
NucleoSpin 96 Plasmide Kit	Macherey-Nagel	740625,4
Transfectin	BioRad	170-3351
Hoechst33342	Molecular Probes	H3570
Viewplate 96 F TC	PerkinElmer	6005182
RapidPick	Hudson		Norgren CP7200
Vrijheid Evo	Tecan		Met vacuüm manifold
Multidrop 384	Thermo
Opera LX	PerkinElmer