Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Samenvatting

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met fluorescent In situ Hybridisatie (FISH) de replicatie timing van zoogdier chromosomen beoordelen. Deze techniek maakt de directe vergelijking van herschikte en niet-herschikte chromosomen binnen dezelfde cel.

Samenvatting

Zoogdier DNA replicatie start op meerdere plaatsen langs chromosomen op verschillende momenten in S fase na een tijdelijke replicatieprogramma. De specificatie van replicatie timing wordt beschouwd als een dynamisch proces gereguleerd door weefsel-specifieke en ontwikkelingsstoornissen signalen die inspelen op epigenetische modificaties zijn. Echter, de mechanismen tot regeling van waar en wanneer de replicatie van DNA initieert samen chromosomen blijft slecht begrepen. Homologe chromosomen meestal synchroon te repliceren, maar er zijn uitzonderingen op deze regel. Bijvoorbeeld, in vrouwelijke zoogdiercellen een van de twee X-chromosomen wordt late replicerende door een proces dat X inactivatie ^1. Samen met deze vertraging in de replicatie timing, geschat op 2-3 uur te zijn, raken de meerderheid van de genen transcriptioneel zwijgen over een X-chromosoom. Bovendien een discrete cis-acting locus, bekend als de X inactivatie centrum regelt deze X inactivatie, inclusief the inductie van vertraagde replicatie timing op de gehele inactieve X-chromosoom. Bovendien zijn bepaalde chromosoomherschikkingen in kankercellen en cellen blootgesteld aan ioniserende straling tonen een aanzienlijke vertraging van replicatie timing> 3 uren beïnvloedt het hele chromosoom ^2,3. Recent werk van ons lab geeft aan dat verstoring van discrete cis-werkende autosomale loci resulteren in een zeer laat repliceren fenotype dat het hele chromosoom ⁴ beïnvloedt. Extra 'chromosoom engineering' studies geven aan dat bepaalde chromosoom herschikkingen van invloed zijn veel verschillende chromosomen resultaat in deze abnormale replicatie-timing fenotype, wat suggereert dat alle zoogdieren chromosomen discrete cis-werkende loci dat een goede replicatie timing van de individuele chromosomen ⁵ besturen bevatten.

Hier geven we een werkwijze voor de kwantitatieve analyse van chromosoom replicatie timing gecombineerd met fluorescente in situ hybridisatie. Dezewerkwijze maakt een rechtstreekse vergelijking van replicatie timing tussen homologe chromosomen binnen dezelfde cel, en is aangepast van ^6. Bovendien maakt deze werkwijze de eenduidige identificatie van chromosomale herschikkingen die correleren met veranderingen in replicatie timing dat het gehele chromosoom beïnvloeden. Deze methode heeft voordelen ten opzichte van recent ontwikkelde high throughput micro-array of sequencing protocollen die geen onderscheid kunnen maken tussen homologe allelen aanwezig zijn op herschikt en niet-herschikt chromosomen. Bovendien, omdat de hier beschreven methode resulteert afzonderlijke cellen kan detecteren veranderingen in chromosoom replicatie timing chromosomale herschikkingen die aanwezig zijn in slechts een fractie van de cellen in een populatie.

Protocol

1. BrdU Oprichting (Terminal Labeling)

1. Cellaag tot ongeveer 70% confluentie in een 150 mm weefselkweekplaat 24 uur vóór de toevoeging van BrdU.
2. Vervangen media met vers compleet medium met 20 ug / ml BrdU (Sigma) op geschikte tijdstippen voor de oogst. De tijdsduur cellen worden gekweekt in media met BrdU zal variëren met cel soort, meestal de G2 fase duurt 2 tot 5 uur (Figuur 1).

2. Chromosoom Oogst van Monolayer Cellen Culturen

1. Verwijderen kweekmedia van de plaat en verzamel 10 ml in een 15 ml conische centrifugebuis. Gooi overgebleven afdrukmateriaal.
2. Spoel eenmaal cellen met 10 ml Versine [of HBSS (Sigma)].
3. Voeg 5 ml 0,25% trypsine in Versine (of HBSS) aan de plaat. Incubeer bij kamertemperatuur totdat cellen los van de plaat.
4. Voeg getrypsiniseerde celsuspensie aan de buis met de 10 ml van media uit stap 2.1.
5. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min om pellet van de cellen. Zuig supernatant, waardoor 0,5 ml medium plus de cel pellet.
6. Resuspendeer grondig cellen door pipetteren met een Pasteur pipet.
7. Voeg 3 druppels hypotone oplossing (0,075 M KCl (Sigma) verwarmd tot 37 ° C) meng de celsuspensie met een Pasteur pipet. Voeg 0,5 ml hypotone oplossing en meng opnieuw met een Pasteur pipet. Breng volume van hypotone oplossing 5 ml en meng weer. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20-45 min, afhankelijk van het celtype.
8. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 minuten. Zuig supernatant, waardoor 0,5 ml medium plus de cel pellet.
9. Resuspendeer de celpellet door zachtjes tikken de buis. De osmotisch gezwollen cellen kwetsbaar zijn op dit punt, dus zorg ervoor dat u niet aan de cytoplasmatische membranen te verstoren.
10. Voeg 3 druppels Carnoy's fixeermiddel (1:3 Ijsazijn: Methanol) mix voorzichtig pipetteren met een Pasteur pipette. Voeg 0,5 ml fixatief en meng voorzichtig pipetteren met een Pasteur pipet. Breng het volume van fixatief tot 5 ml en meng opnieuw door voorzichtig pipetteren met een Pasteur pipet. Gefixeerde cellen kan worden opgeslagen in het donker bij -20 ° C enkele maanden.
11. Centrifugeer en aspireren als in stap 2.8.
12. Resuspendeer de celpellet in vers fixeermiddel; schatten volume van de pellet en voeg ~ 10x de hoeveelheid Carnoy's fixeermiddel.
13. Voeg de celsuspensie druppelsgewijs op natte, ijskoude microscoopglaasjes, houden het preparaat op een ~ 45 ° en laat de celsuspensie te stromen over het oppervlak van de dia. Leg de foto plat op keukenpapier en vloed van de glijbaan met een fixatief en laat aan de lucht drogen. Controleer slides de aanwezigheid van mitotische spreads met een omgekeerde microscoop.

3. RNase Behandeling en Ethanol Uitdroging

1. Place 200 ul van 10 ug / ml RNase A (Sigma) in 2x SSC elke dia; incubeer bij 37 en deg; C gedurende 1 uur.
2. Wash dia 3 keer met 2x SSC, pH 7,0 bij kamertemperatuur gedurende 3 min elk.
3. Uitdrogen dia via een EtOH (Sigma) series (70%, 90% en 100%) bij kamertemperatuur gedurende 3 min elk.
4. Droog de glaasjes lucht bij kamertemperatuur.

4. Voorbereiding van Probe Cocktails voor BAC Plus Chromosoom-specifieke Centromeer Enumeration Probe (CEP) of voor heel chromosoom Paints in situ hybridisatie

1. Voor de BAC / CEP gelijktijdige hybridisatie, bereiden twee afzonderlijke sonde cocktails voor pre-hybridisatie. We hebben gevonden dat de BAC en CEP probes afzonderlijk pre-hybridisatie onder verschillende stringenties resulteert in minder achtergrond en meer signaalintensiteiten. We hebben ook gevonden dat individuele Fosmids ook kan worden gebruikt in plaats van BAC klonen. De cocktail formulering hieronder beschreven staat voor de volumes voor een enkele dia. Als het verwerken van meerdere dia's met behulp van dezelfde probes gewoon verhoging van de volumes appropr iately.

   * BAC DNA-probe cocktail:

   11,5 ul hybridisatiebuffer (50% formamide (Sigma) / 2x SSC / Dextran Sulfate (Sigma)) 2 pl dH ₂ O

   2,5 ui BAC/Cot1 DNA in dH ₂ O (zie hieronder voor labelen protocol) 15 ul totaal volume

   * CEP probe cocktail:

   7 pi CEP hybridisatiebuffer (65% Formamide/2x SSC / dextransulfaat) 2 pi dH ₂ O

   1 pi CEP/Cot1 DNA (gekocht prelabeled met Spectrum Orange/Cy3/Texas Red) 10 ul totaal volume

   * Na denatureren en pre-hybridisatie (stap 5.1) mix BAC probe met CEP sonde in een 3:2 verhouding 25 pi / glijbaan en meng sonde cocktails.

   OF

2. Aliquot 20 pl / dia van heel chromosoom Paint sonde (Cy3/Texas rood) in een buis. Overgaan tot denaturatie en pre-hybridisatiestap.

"> 5. Schuif en Probe Denaturatie en in situ hybridisatie

1. Denatureren probe cocktail (s) bij 75 ° C gedurende 10 minuten. Pre-hybridiseren bij 37 ° C gedurende 30 min om de Cot1 DNA hybridiseren met repetitieve sequenties en daaropvolgende hybridisatie metafase chromosomen voorkomen.
2. Denatureren slides in Coplin potten in 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 bij 72 ° C gedurende 3 minuten.
3. Onmiddellijk drogen dia via een reeks EtOH (70%, 90% en 100%) in Coplin potten bij 4 ° C gedurende 3 min elk.
4. Laat de dia aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
5. Voorverwarmen objectglaasjes 45 ° C warmer slide de laatste 10 min van de probe pre-hybridzation (stap 5.1). Meng pre-gehybridiseerde probe cocktails als dat nodig is en voeg 25 ul aan elke dia, voorzichtig plaats een dekglaasje op elke dia en afdichting langs alle randen met rubber cement. Incubeer overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde kamer om verdamping te voorkomen.

6. Bericht Hybridisatie Wast

1. Wassen slides in Coplin potten 3 keer in 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 bij 38-40 ° C gedurende 3 min elk. De temperatuur van het wassen kan variëren tussen probes. Bij een grote achtergrond hybridisatie u kan de temperatuur van het wassen. Omgekeerd, als het signaal zwak en er is geen achtergrond dan kunt u verlagen van de temperatuur van deze wasbeurten.
2. Wash dia's 1 keer in de norm PN-buffer bij kamertemperatuur gedurende 3 min, en ga naar de BrdU detectie stap.

7. BrdU Detectie

1. Block slides met PNM buffer gedurende 10 minuten (200 ul / slide) bij kamertemperatuur in het donker.
2. Laat dia's door te draaien aan de rand op een papieren handdoek. Voeg 100 ul van anti-BrdU-FITC (50 ug / ml Roche of Millipore) in PNM buffer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
3. Wassen sledes 3 maal PN buffer bij kamertemperatuur gedurende 3 min elk.
4. AftappenPN overmaat buffer op objectglaasjes een voor een door te draaien aan de rand op een papieren handdoek. Voeg 20 ul DAPI / antifade montage oplossing (Invitrogen). Bedek de dia met een papieren handdoek en druk op het dekglaasje te dwingen uit luchtbellen en overtollig montage oplossing. Ga door naar beeldanalyse.

8. Afbeeldingen vastleggen en kwantificeren van BrdU Oprichting

1. Beelden worden vastgelegd met een Olympus BX61 fluorescentie microscoop en Olympus CCD Camera, 100x objectief, automatische filter-wiel en Cytovision software (Applied Imaging). BrdU wordt vastgelegd met behulp van een FITC-filter; chromosoom verven (Texas Red, Metasystems of Cytocell), zijn van BAC (Cy3) en CEP (Vysis Spectrum Oranje) probes gemaakt met een Texas Red of Cy3 filter; DAPI wordt gevangen met een DAPI filter (zie figuren 2 en 3).
2. Afzonderlijke chromosomen plaats worden geïdentificeerd met BAC / CEP of chromosoom-specifieke probes verf (figuren 2b en 3b). Door gebruik te makenCytovision de software, elk chromosoom van belang is "cut-out" van de metafase spread als geheel wordt een lijn door de over de lengte van het chromosoom van korte tot lange arm arm (Figuren 2C en 3C). De Cytovision software wordt gebruikt om de pixel intensiteitsprofiel kwantificeren langs de lengte van elk chromosoom. De Cytovision software berekent de oppervlakte van de pixels en meten van de intensiteit van de pixels vertegenwoordigd door de BrdU of DAPI signalen op elke geïsoleerde chromosoom. De gemiddelde pixelintensiteit vertegenwoordigd door elk chromosoom wordt vervolgens vermenigvuldigd met de oppervlakte van de pixels van het totale aantal pixels (Tabel 1 en Figuur 4) te verkrijgen. Daarnaast heeft dit protocol laat de visualisatie van de laatste replicerende regio chromosomen. Bijgevolg de gestreepte patroon van BrdU opname maakt de detectie van actieve replicerende regio chromosomen, en verschillen in timing tussen replicatie chromosome paren worden als verschillen in deze bandpatroon (figuren 2 en 3). Tenslotte kunnen deze verschillen in bindingspatronen worden vergeleken met bekende replicatie timing kaarten voor elk chromosoom ^6,7, die zorgt voor een schatting van de replicatie tijdsverschil tussen homologe chromosomen of chromosoom armen ^4. Bijvoorbeeld, de twee chromosoom 6 is in Figuur 3A geeft een verschil in bandpatroon van> 2 uur in vergelijking met de normale replicatie timing van chromosoom 6 ^4.
   Daarnaast is een vergelijkbare procedure met die beschreven met succes gebruikt voor de studie van de asynchrone replicatie timing tussen de inactieve en actieve X chromosomen ^8,9. De actieve en inactieve X chromosomen werden geïdentificeerd met X-chromosoom verf. Beelden werden verkregen met Quips mFISH software (Vysis) en het aantal pixels ingenomen door de X-chromosomen en het aantal pixels ingenomen door fluorescentie labeled BrdU werden berekend met NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. Nick Vertaling van BAC DNA voor TL-Labeling (Vysis)

1. Voeg de volgende probe mix gekoeld een microfugebuis:
   70 pi (4 ug DNA) in dH ₂ O
   10 pi 0,2 mM dUTP-oranje of groen
   20 pi 0,1 mM dTTP
   20 ul 10x Nick Vertaling Buffer
   40 pi NT dNTP's (minus dTTP)
   40 pi nick Vertaling enzym
   200 ul totaal volume
   Incubeer @ 16 ° CO / N. Stop reactie door verhitten bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Chill op ijs gedurende 5 minuten.
2. Het neerslaan van de DNA met ethanol door toevoeging van de volgende handelingen uit om de sonde mix:
   200 pi oplossing probe
   48 pl 3 M NaOAc
   160 pi Cot1DNA (0,25 ug / ul)
   1200 ul 100% EtOH
3. Bij -80 ° C gedurende 10 min om O / N.
4. Spin in koud bij 12.000 xg gedurende 20 minuten. Giet af EtOH. Was 1 keer met 70% EtOH. Draaien als voordien. Giet af EtOH. Air drogen enkel tot EtOH verdampt. Resuspendeer in 40 pl dH ₂ O voor eindconcentratie van 100 ng / ul BAC DNA.

Resultaten

Een voorbeeld van de replicatie timing analyse van humaan chromosoom 6 is in figuur 2. Cellen die een deletie van het gen ASAR6 ^4, gelegen op 6q16.1, blootgesteld aan BrdU gedurende 5 uur, geoogst voor mitotische cellen en bewerkt voor FISH met chromosoom 6 verf probe (Vysis) en voor opname BrdU. Merk op dat er een significant verschil in de BrdU bandpatroon tussen de twee 6, die consistent is met een vertraging van replicatie timing van> 2 uur voor een van de chromosoom 6 is [zie ⁴

Discussie

De bereiding van chromosoom spreads is een kritische stap voor de succesvolle replicatie-timing assay beschreven. De opname van een Colcemid voorbehandelingsstap vóór de hypotonische behandeling kan helpen bij de frequentie en verspreiding van mitotische cellen. We meestal bloot cellen colcemdi gedurende 1-3 uur vóór de oogst en gebruik Colcemid in een eindconcentratie van 10 ug / ml. Echter, de opneming van een Colcemid voorbehandelingsstap veranderen de lengte van G2 en kunnen derhalve de schijnbare replicatie timing ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Opmerkingen (optioneel)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 ug / ul
Nick Vertaling Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Oranje dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Varieert
LSI / WCP hybridisatiebuffer	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
CEP hybridisatiebuffer	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Chromosoom paigen	MetaSystems Groep	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 fluorescentiemicroscoop	Olympus	BX61TRF-1-5
Microscoop imaging software systeem	Applied Imaging	Cytovision 3.93.1
Digitale Camera	Olympus	UCMAD3
			In situ hybridisatie RECEPTEN Formamide Solutions 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamide * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH op 7,0 met HCl (Sigma) * Het is belangrijk om formamide die is opgeslagen bij -20 ° C. Langdurige bewaren bij kamertemperatuur genereren mierenzuur en de pH wziek te laag zijn. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH op 7,0 met HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na-citraat (Sigma) dH 2 O om het volume te PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Een 0,1 M oplossing van elk natriumfosfaat (Filter steriliseer en bewaar in 500 ml aliquots). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O om het volume te 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L 14,2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O om het volume. PN: Stel pH van 0,1 M Na 2 HP0 4 tot pH 8,0 met 0,1 M NaH 2 P0 4. Filter steriliseren en voeg 1 ml NP-40. PNM 50 ml 1,25 g vetvrije droge melk (Sigma) 25 ml PN-buffer (Recept boven) Meng gedurende 15-20 min onder voortdurend roeren. Spin 2 keer bij 400 xg gedurende 10 minuten. Gebruik supernatant, en zorg ervoor dat je neergeslagen melkeiwitten verstoren.