Een experimentele techniek voor de behandeling van chondrale defecten in het konijn kniegewricht beschreven. De implantatie van autologe chondrocyten geënt op een matrix is een algemeen aanvaarde methode voor het verbouwen en herstel van gewrichtskraakbeen letsels leveren bevredigende resultaten op lange termijn. Matrix-bijgestaan autologe chondrocyten transplantatie (MACT) biedt een gestandaardiseerd en klinisch vastgestelde implantatie methode.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Matrix-bijgestaan autologe chondrocyten transplantatie voor Renovatie en de reparatie van chondrale Gebreken in een konijn model
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gewrichtskraakbeendefecten worden beschouwd als een belangrijk gezondheidsprobleem omdat gewrichtskraakbeen heeft een beperkte capaciteit voor zelf-regeneratie 1. Onbehandelde kraakbeenletsels leiden tot aanhoudende pijn, negatieve invloed op de kwaliteit van leven en vatbaar voor artrose. Gedurende de laatste decennia hebben diverse chirurgische technieken ontwikkeld om dergelijke letsels te behandelen. Echter, tot nu toe was het niet mogelijk om een volledige reparatie in het dekken van het defect met hyaline gewrichtskraakbeen of van het verstrekken van voldoende herstel op lange termijn 2-4 te bereiken. Daarom gewrichtskraakbeen blessures blijven een belangrijk doelwit voor regeneratieve technieken zoals Tissue Engineering. In tegenstelling tot andere chirurgische technieken, die vaak leiden tot de vorming van vezelig kraakbeenachtig weefsel, weefsel engineering is het volledig herstel van de complexe structuur en eigenschappen van de oorspronkelijke gewrichtskraakbeen door de chondrogene potentieel van getransplanteerde cellen. RECENTE ontwikkelingen opende veelbelovende mogelijkheden van regeneratieve therapieën kraakbeen.
De eerste cel gebaseerde benadering voor de behandeling van volledige dikte kraakbeen of osteochondrale laesies werd uitgevoerd in 1994 door Lars Peterson en Mats Brittberg die klinische autologe chondrocyten implantatie (ACI) 5 pionier. Vandaag de techniek klinisch goed ingesteld voor de behandeling van grote hyaline kraakbeendefecten van de knie, onderhouden van goede klinische resultaten zelfs 10 tot 20 jaar na implantatie 6. In de afgelopen jaren, de implantatie van autologe chondrocyten onderging een snelle progressie. Het gebruik van een kunstmatige driedimensionale collageen-matrix waarop cellen worden vervolgens geplant werd steeds populairder 7-9.
MACT bestaat uit twee chirurgische procedures: Ten eerste, om chondrocyten te verzamelen, moet een kraakbeen biopsie worden uitgevoerd vanuit een niet dragende kraakbeen bereik THij gezamenlijke knie. Vervolgens worden chondrocyten worden gewonnen, gezuiverd en uitgebreid tot een voldoende aantal cellen in vitro. Chondrocyten worden vervolgens gezaaid op een drie-dimensionale matrix en kan vervolgens opnieuw worden geïmplanteerd. Bij de voorbereiding van een tissue-engineered implantaat, proliferatiesnelheid en differentiatie capaciteit zijn cruciaal voor een succesvolle weefselregeneratie 10. Het gebruik van een drie-dimensionale matrix als een mobiele drager wordt gedacht dat deze cellulaire kenmerken 11 ondersteunen.
Het volgende protocol samenvatten en tonen een techniek voor het isoleren van chondrocyten van kraakbeen biopsies, de proliferatie in vitro en het zaaien op een 3D-matrix (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Zwitserland). Tenslotte wordt de implantatie van de cel-matrix-constructen in kunstmatig gecreëerd chondrale defecten van een konijn kniegewricht beschreven. Deze techniek kan worden gebruikt als een experimentele settingverdere experimenten kraakbeenherstel.
Protocol
A. kraakbeenbiopsie (Operatie Kamer; Stappen 1-5 in niet-steriele bereiding Kamer)
- Voer een eindgewicht controle van het konijn (New Zealand White konijnen, vrouwelijk, 3,5-4,0 kg lichaamsgewicht, 6 maanden oud) om goed te kunnen doseren drugs en gewicht na chirurgie controleren.
- Induceren anesthesie het konijn door een intraveneuze injectie van 10 mg / kg propofol.
- Na intubatie onderhouden anesthesie met 1,5 mg / kg / min propofol en 0,05 mg / kg intraveneus fentanyl. Monitor anesthesie met behulp van capnografie, pulsoxymetrie en hartslag.
- Scheer de knie te worden geopereerd met een elektrische tondeuse en vacuüm de vacht.
- Ontsmet de geschoren knie grondig en hebben betrekking op de rest van het konijn met een steriel verband.
- Palperen de knieschijf en het uitvoeren van een huid incisie mediaal van de patella.
- Open het kniegewricht door een mediale parapatellaire arthrotomie onder steriele omstandigheden. Probeer te vermijden dat eventuele kleine suoppervlakkige bloedvaten.
- Verplaats de knieschijf lateraal.
- Inspecteer het kniegewricht voor eventuele afwijkingen en macroscopische kraakbeenletsels.
- Verwijder voorzichtig kleine stukjes kraakbeen (2-3 mm) uit de trochlea ossis femoris met een steriel scalpel (figuur 1).
- Plaats onmiddellijk deze kraakbeen biopsieën in een 50 ml buisje met compleet medium (DMEM + 10% foetaal kalfsserum (FCS) + 1% penicilline / streptomycine (pen / strep)) blijven bij de in vitro kweek direct na de operatie.
- Reinig de gebreken en spoel ze met een steriele zoutoplossing.
- Herpositioneren van de patella in de trochlea groef.
- Wondsluiting in lagen met enkele knop hechtingen (4-0 Vicryl) en een aanhoudende cutane hechtdraad (4-0 Monocryl). Gebruik absorbeerbare hechtmateriaal.
- Ten slotte sluit de wond met een spray dressing waterdampdoorlatend.
B. In vitro cultuur
- Verwerk de biopsie cartilage stukken zo spoedig mogelijk na de operatie in een steriele laminaire stroming weefselkweek kap.
- Was de steriele geoogst kraakbeen 2x in PBS met daaropvolgende centrifugatie bij 500 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Gesneden stukjes kraakbeen in 1 mm3, transfer naar een 50 ml falcon en verteren op een schudder gedurende 30 minuten met 10 ml trypsine-EDTA (0,25%) en 10 ml PBS gedurende 30 min
- Na 30 min, stop trypsine door toevoeging volledig medium. Schud dan het kraakbeen stukken voor een voor 12 uur met collagenase A (0,21 E / mg) in serumvrij medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Centrifugeer de verkregen oplossing bij 170 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer celpellets in 5 ml compleet medium.
- Seed de geïsoleerde chondrocyten op 25 cm2 weefselkweek flessen in 5 ml compleet medium en in een bevochtigde weefselcultuur incubator bewaren bij 37 ° C, 5% CO2.
- Kweek chondrocyten tot een dichtheid van 80%.
- Laat de cellen from kolven door wassen in PBS 2x voor belichting onder 0,05% trypsine-EDTA gedurende 3 minuten. Eenmaal chondrocyten los, stop trypsinering door toevoeging van 10 pi compleet medium.
- Centrifugeer de suspensie bij 300 g (3 min) en resuspendeer pellet in compleet medium.
- Zaadcellen in weefselkweek kolven (75 cm2) en een split verhouding van 1:03 (~ 5000 cellen / cm 2) elke 5 e dag of bij 80% confluentie.
- Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid van trypanblauw kleuring.
C. Cel-zaaien van de Matrix
- Vóór implantatie wassen en laat cellen zoals hierboven beschreven. Voer celgetal en overdragen 5 x 10 4 cellen in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer vervolgens bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer pellet in 15 ul volledig medium voor een volledige verzadiging van de matrix.
- Snijd de dubbellaag collageen steiger om de exacte afmetingen van de trochlear gebrek door een steriele biopsiepunch.
- Plaats matrix in een geschikte grootte weefselcultuurschaal (bijv. 24 putjes).
- Zaad cellen op het poreuze, cel-klevende zijde van de matrix. Dit schrikt celmigratie van het matrix.
- Verlaat cel-gezaaide matrices zonder verdere celcultuurmedium binnen een incubator gedurende 1 uur tot een volledige naleving van de chondrocyten toestaan.
- Plaats vervolgens cel-matrix-constructen in kweken containers (bijv. 24 putjes) met vers compleet medium. Let er dan uit te spoelen alle cellen uit de matrix ook al sterke hechting wordt verwacht.
- Nu kunnen cel-matrix-constructen worden genomen om de operatiekamer voor re-implantatie.
D. Matrix-bijgestaan autologe chondrocyten transplantatie
- Voer parapatellaire arthrotomie de contralaterale knie hierboven (A. 1-8) beschreven.
- Maak twee geïsoleerde chondrale gebreken in de trochlear groef met een steriele lucht operating boormachine (3,6 mm in diameter).
- Reinig het gebrek en spoel af met steriele zoutoplossing.
- Aandacht moet worden besteed niet aan de mergholte te allen tijde te openen. Indien nodig, sluit de bodem van de gebreken elektrische cauterisatie tegen bloeden.
- Implantaat de matrices bezaaid met de gekweekte chondrocyten met de poreuze zijde naar beneden (Figuur 2). Druk vervolgens op-passen in de boorgaten en spoel het omliggende oppervlak.
- Verzegelen de geïmplanteerde matrices met een beetje van fibrine lijm (Tissucol Duo S) om veilige fixatie te verzekeren.
- Na stolling, verplaats de patella in de trochlear groove en toepassen volledige waaier van beweging aan het kniegewricht een paar keer.
- Verplaats de knieschijf lateraal nogmaals en controleer voor elk evenement of teken van instabiele fixatie. De matrices moet nog op zijn plaats gehouden.
- Vervang de knieschijf weer en eindigen de bediening met wondsluiting in lagen en spuit kleden zoals hierboven beschreven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De beschreven chirurgische techniek maakt een succesvolle isolatie en implantatie van autologe chondrocyten in een kunstmatige chondral defect. De experimentele opstelling geleid tot een succesvolle integratie van het implantaat in de omringende kraakbeen.
Na 12 weken in vivo, werd de chondrale defect gevuld met herstelweefsel een homogeen en intact oppervlak, die shear stress en schade gereduceerd tot het implantaat (Figuur 4). Bovendien is er geen hypertrofie of v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De gepresenteerde protocol voorziet in een gevestigde 9,12,13 en gemakkelijk reproduceerbare techniek om autologe chondrocyten isoleren voor daaropvolgende proliferatie en re-implantatie in kunstmatig gecreëerde kraakbeenletsels in konijnen knieën. Het gebruik van autologe chondrocyten voor de verbouwing en de reparatie van articulaire kraakbeenletsels is reeds in klinisch gebruik leveren bevredigende resultaten op lange termijn 6.
Grote problemen zoals bijvoorbeeld per...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit project werd gefinancierd door de Duitse Research Association (DFG, HE 4578/3-1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van reagens/apparaat | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Foetaal kalfsserum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicilline/Streptomycine | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsine-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS zonder Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl-oplossing (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Weefselkweekschalen 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Groeioppervlak 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Weefselkweekflessen 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifugeebuizen (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-gesteriliseerd |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue-oplossing 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Sprayverband (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Waterdampdoorlaatbaar |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsietpons | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
Referenties
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
