Behandeling van Osteochondrale Defecten in de Rabbit&#39;s kniegewricht door Implantatie van Allogeneic mesenchymale stamcellen in fibrinestolsels

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Behandeling van Osteochondrale Defecten in de Rabbit's kniegewricht door Implantatie van Allogeneic mesenchymale stamcellen in fibrinestolsels

17.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4423

⸱

21 mei 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een experimentele techniek voor de behandeling van osteochondrale defecten in het konijn kniegewricht beschreven. De implantatie van allogene mesenchymale stamcellen in osteochondrale defecten heeft een veelbelovende ontwikkeling op het gebied van weefsel engineering. De voorbereiding van fibrine-cel-stolsels In vitro Biedt een gestandaardiseerde methode voor implantatie.

Samenvatting

De behandeling van osteochondrale gewrichtsdefecten vormt al vele jaren een uitdaging voor artsen. Een beter begrip van de interacties tussen het gewrichtskraakbeen en het subchondrale bot in recente jaren heeft geleid tot meer aandacht voor het herstel van de volledige osteochondrale eenheid. In vergelijking met chondrale laesies is de regeneratie van osteochondrale defecten veel complexer en vormt het een veel grotere chirurgische en therapeutische uitdaging. Het beschadigde weefsel omvat niet alleen de oppervlakkige kraakbeenlaag, maar ook het subchondrale bot. Bij diepe osteochondrale schade, zoals bijvoorbeeld bij osteochondrosis dissecans, moet de volledige dikte van het defect worden vervangen om het gewrichtsoppervlak te herstellen ¹. Geschikte therapeutische procedures moeten rekening houden met deze twee verschillende weefsels met hun uiteenlopende intrinsieke herstelvermogen ². In de afgelopen decennia zijn er verschillende chirurgische behandelingsopties ontstaan die inmiddels klinisch zijn gevestigd ^3-6.

Autologe of allogene osteochondrale transplantaten bestaan uit gewrichtskraakbeen en subchondraal bot en maken de vervanging van de volledige osteochondrale eenheid mogelijk. De defecten worden opgevuld met cilindrische osteochondrale grafts, met als doel een congruent, met hyalien kraakbeen bedekt oppervlak te verkrijgen ^3,7,8. De nadelen zijn de beperkte hoeveelheid beschikbare grafts, morbiditeit op de donorplaats (bij autologe transplantaten) en de incongruentie van het oppervlak; hierdoor is de toepassing van deze methode vooral beperkt bij grote defecten.

Nieuwe benaderingen op het gebied van tissue engineering hebben veelbelovende mogelijkheden geopend voor regeneratieve osteochondrale therapie. De implantatie van autologe chondrocyten markeerde de eerste celgebaseerde biologische benadering voor de behandeling van full-thickness kraakbeenzweren en is nu wereldwijd gevestigd met goede klinische resultaten, zelfs 10 tot 20 jaar na implantatie ^9,10. Tot op heden is deze techniek echter niet geschikt voor de behandeling van alle soorten letsels, zoals diepe defecten waarbij het subchondrale bot betrokken is ¹¹.

De sandwich-techniek combineert bottransplantatie met huidige benaderingen in Tissue Engineering ^5,6. Deze combinatie lijkt in staat om de beperkingen te overwinnen die worden gezien bij osteochondrale transplantaten alleen. Na autologe bottransplantatie in het subchondrale defectgebied wordt een membraan, gezaaid met autologe chondrocyten, erboven gehecht, wat helpt om de topografie van het transplantaat af te stemmen op de beschadigde plek. Uiteraard vereist de voorafgaande botreconstructie extra chirurgische tijd en vaak zelfs een aanvullende operatie. Bovendien ontbreken tot op heden gegevens op lange termijn ¹².

Tissue engineering zonder aanvullende bottransplantatie beoogt de complexe structuur en eigenschappen van natuurlijk gewrichtskraakbeen te herstellen via het chondrogene en osteogene potentieel van de getransplanteerde cellen. Echter, gewoonlijk wordt slechts in meer of mindere mate het kraakbeenweefsel geregenereerd. Aanvullende osteochondrale schade vereist een specifieke verdere behandeling. Om regeneratie van de meerlaagse structuur van osteochondrale defecten te bewerkstelligen, kunnen driedimensionale tissue-engineered producten, gezaaid met autologe/allogene cellen, een goede regeneratiecapaciteit bieden ¹¹.

Naast autologe chondrocyten lijken mesenchymale stamcellen (MSC) een aantrekkelijk alternatief te zijn voor de ontwikkeling van een cartilageweefsel over de volledige dikte. In talrijke preklinische in vitro en in vivo studies hebben mesenchymale stamcellen een uitstekend potentieel voor weefselregeneratie getoond ^13,14. Het belangrijke voordeel van mesenchymale stamcellen, met name voor de behandeling van osteochondrale defecten, is dat zij het vermogen hebben om te differentiëren in zowel osteocyten als chondrocyten. Daarom maken zij potentieel een meerlaagse regeneratie van het defect mogelijk.

In recente jaren zijn er verschillende scaffolds met osteochondraal regeneratief potentieel ontwikkeld en geëvalueerd, met veelbelovende preliminaire resultaten ^1,15-18. Bovendien is fibrinelijm als celdrager een van de voorkeurstechnieken geworden bij experimentele kraakbeenherstel en is dit al succesvol toegepast in diverse dierstudies ^19-21 en zelfs in de eerste menselijke trials ²².

Het volgende protocol demonstreert een experimentele techniek voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van een konijn, voor daaropvolgende proliferatie in celcultuur en voor het voorbereiden van een gestandaardiseerd in vitro-model voor fibrine-celstolsels. Tot slot wordt een techniek beschreven voor de implantatie van vooraf geprepareerde fibrine-celstolsels in kunstmatige osteochondrale defecten van het kniegewricht van het konijn.

Protocol

A. Bereiding van een Donor Konijn voor de isolatie van mesenchymale stamcellen (Chirurgie Kamer)

Cellen geïsoleerd uit mannelijke New Zealand White (NZW) konijnen op de leeftijd van 4 maanden en ongeveer 3 kg lichaamsgewicht.
Induceren anesthesie met propofol (10 mg / kg lichaamsgewicht iv) en offeren met natrium pentobarbital (100 mg / kg lichaamsgewicht iv).
Scheren bont van achterste ledematen, rug en buik met een elektrische tondeuse en stofzuigen van de vacht.
Ontsmet het geschoren gebied grondig met 70% ethanol.
Gebruik stompe tang, scherpe schaar (of scalpel) en bot snijders voor weefsels en ligamenten.
Maak een insnijding langs het craniale oppervlak van het been en kuit.
Weerspiegelen de huid en onderhuids weefsel door een scherpe of stompe dissectie.
Afzonderlijke spieren en ligamenten van scheenbeen en dijbeen. Houd delen zo dicht mogelijk bij de bot mogelijk een schone dissectie maken. Heb femur niet scheiden van tibia op dit moment.
Snijd thrdoorgedreven het heupgewricht van de kop van het dijbeen te scheiden van het acetabulum.
Verheffen de scheenbeen-dijbeen complex.
Gebruik de scalpel af te schrapen de resterende zacht weefsel uit de botten of wrijf de botten met een steriele doek weefsels. Op dit punt worden femur en tibia nog aangesloten.
Verwijder de patella door snijden, snijd kniegewricht ligamenten aan afzonderlijke botten eindelijk.
Spray gescheiden botten met 70% ethanol, laten drogen aan de lucht en leg elk bot in een centrifugebuis van 50 ml met celkweek medium (DMEM + 1% penicilline / streptomycine (Pen / Strep)) om ze vochtig te houden.
Schakel nu onder een steriele celkweek laminaire stroming kap.

B. Spoelen van Konijn MSC uit Bones en Expansion (Cell Culture Hood)

Verzamel botten van buizen en plaats ze in 150 mm gerechten met een steriel pincet.
Verwijder beide bot eindigt met een steriele zaag en beweging stukken om nieuwe 150 mm gerechten.
Vul een 10 ml spuit met medium (DMEM), bevestig een 18 gauge naald en steek in de opening van het beenmerg.
Vervolgens afspoelen mergholte met medium tot het beenmerg te spoelen in de schaal. Spoel daarna aan de andere kant, indien mogelijk. Indien nodig, zag meer af van de uiteinden. Als het bot breekt, net spoel de binnenkant van het bot.
Aspireren cel medium suspensie in de injectiespuit en spoel het beenmerg herhaaldelijk tot schorsing is vrij zwevend door het beenmerg holte en geen verdere beenmerg-stolsels verschijnen.
Zodra beenmerg is verzameld uit alle beenderen, verstoren het merg bosjes door het passeren door een 18 gauge naald: vul spuit met naald bevestigd en dwingen uit in medium.
Daarna, filteren de suspensie door een cel filter in een 50 ml buis. Om cel verlies te voorkomen, wast cultuur schotel 2x met 10 ml medium en filteren ook.
Centrifugeer suspensie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
Verwijder supernatant en resuspendeer cellen Pellet in 10 ml medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
Afzonderlijke bloedcellen uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en mesenchymale stamcellen (MSC) met een Biocoll scheiden oplossing.
Vul 5 ml Biocoll scheiden oplossing in een 15 ml buis en voorzichtig 5 ml van de celsuspensie geplaatst en centrifugeer bij 800 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (zonder rem).
Mogelijke resultaten zie Figuur 1: Being dichter dan Biocoll, rode bloedcellen sediment op de bodem, terwijl PBMC en mesenchymale stamcellen blijven op de interface.
Verwijder voorzichtig interface in een 15 ml buis en was met 5 ml PBS.
Centrifuge zoals beschreven in stap 22, resuspendeer in 5 ml PBS en opnieuw 2-3x.
Vervolgens Centrifugeer opnieuw bij 350 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur (met rem).
Resuspendeer in 10 ml medium en cellen tellen in een hemocytometer.
Plaat cellen op een eerste seeding dichtheid van ongeveer 5 x 10 ⁶ in 150 mm gerechten.
Na 2-3 dagen, opnieuwbewegen niet-hechtende cellen. Je zou kunnen hebben om te spoelen met PBS als eerste in om cel vuil te verwijderen. Voeg vers compleet medium (DMEM + 10% foetaal kalf serum (FCS) + 1% Pen / Strep) achteraf.
Voeden cellen om de 3-4 dagen (Figuur 2).
Na 5-10 dagen, passage van de cellen voor het eerst.

C. Bereiding van fibrine stolsels in vitro

Op de dag van implantatie los hechtende cellen uit flessen / borden door een 3 min blootstelling aan 0,25% trypsine-EDTA. Stoppen door toevoeging van trypsine volledig medium.
Verdeel cellen in een 50 ml Falcon buis en tweemaal wassen met PBS.
Bepalen levensvatbaarheid van de cellen en getallen door trypaanblauw kleuring.
Voeg 50.000 cellen / microcentrifugebuis en laat pellets door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid een mastermix gedurende minstens een stolsel als nodig.
Resuspendeer de cel pellet in 17 ul PBS en meng 25 pl van het fibrinogeen component van TISSUCOL-kit met deze 17 pi MSC schorsing.
Neem een steriele plaat met voorgeboorde gaten (3x3.6 mm) in overeenstemming met de boorgaten in vivo (figuur 3).
Eerst inoculeren 4 pi trombine-oplossing (500 IU / ml) in een gat, gevolgd door onmiddellijke toevoeging van 42 pi fibrinogeen-celsuspensie weer 4 ul trombine-oplossing geplaatst. Gebruik de suspensie om stolling in de pipet tip vermijden door elkaar. Eerst zal de 50 gl volume van het pipetted fibrinogeen-celsuspensie de rand van de voorgeboorde gaten steken zonder te smelten door de oppervlaktespanning. Echter, na volledige stolling (na 60 min) het stolsel krimpt en past in het voorgeboorde gat.
Verwijder het stolsel voorzichtig met een stompe pincet en plaats in een microcentrifugebuis met PBS. Bereid 2 stolsels / dier.
Neem de stolsels op de operatie kamer.

D. Implantatie van Allogeneic mesenchymale stamcellen in fibrinestolsels

Induceren anesthesie konijn (NZW, mannetje, 3,5-4,0 kg lichaamsgewicht, 5-6 maanden oud) door iv injectie van propofol (10 mg / kg lichaamsgewicht).
Scheer de knie te worden geopereerd met een elektrische tondeuse en vacuüm de vacht. Alle genoemde voordat procedures worden uitgevoerd in een operatie voorbereiding kamer om contaminatie van de steriele omgeving van de operatiekamer te voorkomen.
Na intubatie onderhouden anesthesie met 1,5 mg / kg / min propofol en 0,05 mg / kg / min intraveneus fentanyl. Monitor anesthesie met behulp van capnografie, pulsoxymetrie en hartslag.
Ontsmet de geschoren knie grondig en hebben betrekking op de rest van konijn met een steriel verband.
Palperen de knieschijf en het uitvoeren van een huid incisie mediaal van de patella.
Open het kniegewricht door een mediale parapatellaire arthrotomie onder steriele omstandigheden. Probeer te vermijden dat eventuele kleine oppervlakkige bloedvaten.
Verplaats de knieschijf lateraal (figuur 4).
Na InSpectie van het kniegewricht voor enige gelijktijdige kraakbeenletsels of gezamenlijke afwijkingen, maken twee osteochondrale defecten (3 mm diep, cijfer acht-vormige) in de trochlear groef met een steriele lucht werkende boormachine (3,6 mm diameter) met een stop-apparaat (Figuur 5).
Reinig de gebreken en spoel ze met een steriele zoutoplossing.
Vóór implantatie vullen 20 gl fibrinelijm in de gebreken en gelijkmatig op de bodem van het defect te distribueren.
Implanteren dan de stolsels perspassing in het cijfer acht-vormige defect.
Na stolling, verplaats de patella in de trochlear groove en buigen en strekken van de knie een paar keer.
Verplaats de knieschijf lateraal nogmaals en kijk of fibrinogeen-cell-stolsels zijn nog steeds op hun plaats.
Vervang de knieschijf weer en eindigen de bediening met wondsluiting in lagen met enkele knop hechtingen (4-0 Vicryl) en een continue cutane hechting (4-0 Monocryl) (beide met absorbeerbare hechtdraadmateriaal).
Ten slotte sluit de wond met een spray dressing waterdampdoorlatend.
Voor post-operatieve zorg, wordt de wond dagelijks gecontroleerd gedurende 7 dagen. De konijnen krijgen voor post-operatieve analgesie Carprofen 4 mg / kg sc elke 24 uur (4 dagen) en buprenorfine 0.03 mg / kg sc elke 12 uur (2,5 dagen). Een stabilisering van de knie (bijv. dressing) niet nodig.