We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Imaging in vivo dynamiek van cellulair gedrag gedurende een ontwikkelingsvolgorde een krachtige techniek voor het begrijpen van de mechanismen van weefsel patronen zijn. Tijdens de dierlijke ontwikkeling, de belangrijkste celproliferatie en patroonvorming gebeurtenissen zeer snel. Bijvoorbeeld in Caenorhabditis elegans alle celdelingen die voor de larven bouwplan worden binnen zes uur na bevruchting, met zeven mitotische cycli 1, zestien of meer mitosen van Drosophila embryogenese bij minder dan 24 uur 2. Daarentegen celdelingen tijdens plantenontwikkeling traag, typisch in de orde van een dag 3,4,5. Dit legt een unieke uitdaging en een noodzaak voor de lange termijn live beeldvorming voor het documenteren van dynamische gedrag van celdeling en differentiatie gebeurtenissen tijdens fabriek organogenese. Arabidopsis epidermis is een uitstekend modelsysteem voor het onderzoeken van signalering, lot van de cel, en de ontwikkeling van planten. In de zaadlob, dit weefsel bestaat uit lucht-en waterbestendig stoep cellen afgewisseld met gelijkmatig verdeeld huidmondjes, kleppen die open en dicht bij de gasuitwisseling en verlies van water te controleren. Juiste afstand van deze stomata is cruciaal voor de functie en de ontwikkeling volgt een reeks asymmetrische deling en celdifferentiatie stappen om de georganiseerde epidermis (Fig. 1) te produceren.
Dit protocol maakt waarneming van cellen en eiwitten in de epidermis over verschillende dagen van ontwikkeling. Deze termijn maakt een nauwkeurige documentatie van stam-celdelingen en differentiatie van epidermale cellen, met inbegrip van huidmondjes en epidermale stoep cellen. Fluorescerende eiwitten worden gefuseerd om eiwitten van belang hun dynamiek beoordelen tijdens celdeling en differentiatie. Deze techniek staat te begrijpen het lokaliseren van een nieuw eiwit, POLAR 6, tijdens de fase van proliferatie stomatale-lineage cellen in the Arabidopsis cotyledon epidermis, waar het wordt uitgedrukt in cellen voorafgaand asymmetrische deling gebeurtenissen en verplaatst naar een karakteristiek deel van de cel cortex kort voor splitsing optreedt. Afbeeldingen kunnen worden geregistreerd en gestroomlijnd video gemakkelijk geproduceerd met behulp van public domain software om dynamische eiwit lokalisatie en celtypen te visualiseren als ze veranderen in de tijd.
Protocol
1. Zaadsterilisatie
- Bereid zaadsterilisatie oplossing: 33% bleekmiddel, 0,1% Triton X-100.
- Place zaden die gewenste fluorescerende reporter construct (s) en genotype (s) in 1,7 ml buis en toepassing van 1 ml sterilisatieoplossing. Incubeer op nutator gedurende 15 minuten.
- In een steriele kap, gebruik maken van een pipet om sterilisatie oplossing te verwijderen van de buis, waardoor er zaden achter. Spoelen met 1 ml steriel water. Herhaal vier keer.
- Incubeer bij 4 ° C gedurende twee dagen of meer.
2. Voorbereiding van Kamer Schuif Media
- Meng 20 ml van 0,5% oplossing van Bacto Agar (niet zuiver agarose) in water in een 200 ml kolf en magnetron tot opgelost. Wees voorzichtig bij het koken van de oplossing.
- Koel de oplossing tot ongeveer 60 ° C.
- Verzamel 1 ml agar-oplossing met een pipet en langzaam van toepassing op de dekking van glas in de kamer dia (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Duitse coverglass System). Oplossing waarin is te heet of te snel toegepast kunnen lijm of crack glas smelten.
- Onmiddellijk een tweede ml agar-oplossing. Agar nu volledig bedekken de bodem van de dia kamer. Deze minimale media is voldoende om ontwikkeling in een plant cotyledon die opgeslagen voedingsstoffen, vier tot vijf dagen door het handhaven zodat vocht en gas diffusie bevat.
- Cool dia op benchtop met kamer bedekt. Als kolf wordt goed afgesloten kan worden opgeslagen en oplossing opgewarmd voor toekomstig gebruik.
3. Zaad Dissection
- Verwijderen tube steriel zaad van 4 ° C opgeslagen.
- Plaats een papieren zakdoek op het podium van een dissectiemicroscoop en bevochtig met water. Stel weefsel een glad oppervlak te maken. Weefsel wordt gebruikt om zaden voor dissectie stabiliseren.
- Pipet 20 tot 30 zaden van de buis aan het weefsel, en voorzichtig om ze te plaatsen in het gezichtsveld van de ontleden reikwijdte's standpunt.
- Met behulp van scherpe pincet (Roboz, # 5 biologie tip), Verwijder voorzichtig de zaadhuid van de zaailing binnen. Zowel buitenste en binnenste integumenten worden verwijderd.
- Bij beeldvorming de zaadlob, is het gunstig te verwijderen en de hypocotyl kiemwortel. Zaadlobben bevatten voldoende voedingsstoffen te ontwikkelen voor meerdere dagen onder dit protocol. Als intact zal de hypocotyl recht en dramatisch verlengen, bewegen de zaadlob van het tijdsverloop gezichtsveld. Gebruik een scalpel om de zaadlobben vrij van de hypocotyl snijden.
- Houd ontleed cotyledonen ondergedompeld in water, in een microbuis of dergelijke.
- Herhaal 3.4-3.6 totdat het gewenste aantal zaadlobben bereikt. 15 tot 20 succesvolle dissecties worden aanbevolen voor de montage.
4. Montage zaadlobben in de Kamer Dia
- Met behulp van een kleine (18 mm 2) dekglas, dwars door de agar media en de gehele laag optillen van glas de kamer dia basis.
- Pipet ontleed zaadlobben met een minimum aan water vasthoudenbuis in de kamer glijbaan, onder de opgeheven agar laag.
- Sluit voorzichtig de agar op de zaadlobben. Als er teveel water aanwezig is, laat deze weg met een tissue, en let niet op de zaadlobben verstoren. Specimens moeten niet langer gemakkelijk te verplaatsen wanneer mount is voltooid.
- Plaats de deksel op de kamer dia en zet schuif naar microscoop podium.
5. Time Lapse Imaging
- Stel omgekeerde confocale microscoop om de afbeelding op de gewenste fluorofoor (s). Gebruikt LSM700 parameters: voor GFP, excitatie bij 488 nm en de inning met een band pass filter op 440 tot 530 nm, want RFP, excitatie bij 555 nm en de inning met een band pass filter op 570 tot 610 nm.
- Inspecteer gemonteerd exemplaren op beschadigingen. Programmeer de locaties van intacte, goed gemonteerd zaadlobben in microscoop software. In Zen 2009: Focus op een zaadlob met 20x objectief en objectief naar het centrum van de kamer dia verplaatsen. Onder Acquisitie modus, veranderen Zoom tot 0,5 en frame </ Em> om 48x48 pixels. Selecteer posities checkbox en Scan overzichtsbeeld ... knop onder posities, dan stijgen horizontale en verticale tegel nummers 30-35. Wanneer scan is voltooid, klikt u op de posities knop onder de afmetingen tabblad en de plaats vizier op elke zaadlob te observeren.
- Stel z serie omvat de zaadlob epidermis van alle samples.In Zen 2009: Klik op de Z-Stack uit. Selecteer elke positie onder Positie en klik op de knop Verplaatsen naar. Focus op de bovenste vlak van de zaadlob epidermis en klik op de eerste knop onder Z-Stack. Focus op de laagste stand waarin epidermis is nuttig zichtbaar en klik op de knop Laatst. Klik op de knop naast Optimal, waaruit blijkt de beste z-slice dikte, in te stellen. Controleer elke zaadlob om te bevestigen dat deze instellingen alle monsters omvatten, de z parameters kunnen niet worden ingesteld voor individual posities in Zen 2009.
- Stel tijdreeksen op de gewenste resolutie en lengte. Intervallen van 15-30 min voor drie dagen zijn effectief voor eiwit dynamiek in epidermale celdeling. Dit kan worden gewijzigd indien nodig. In Zen 2009: Klik op het Time Series uit. Onder Time Series, stelt Cycli voor het aantal beelden gewenst met behulp van de schuifregelaar of typen in het tekstveld. Stel Interval tot 30 en gebruik de pull-down menu om min te selecteren.
- Begin xyzt multi-positie scan. Merk op dat het aantal posities te beperken door de scan specificaties als totale scantijd groter is dan de gewenste interval, de tijdstippen niet juist. Maximaal zes gelijktijdige posities mogelijk bij beeldvorming GFP en RFP op 59 z-segmenten in 30 min interval met ons systeem. In Zen 2009: Change Frame Grootte op de gewenste resolutie en klik op Start Experiment.
6. Videobewerking
- Uit de confocale gegevensbestand, maken een maximale intensiteit z-projectie van elke tijd / positie combinatie en export als beeldbestanden in een lossless formaat zoals TIFF. Bestandsnamen moeten worden in een reeks per positie (bijvoorbeeld POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, enz., niet POLAR-GFP_0001_pos1) voor software om ze te combineren in een film. In Zen 2009: Gebruik Copy: Subset onder het tabblad Verwerking om posities te splitsen in aparte bestanden, dan Maximum Intensity Projection. Tot slot, exporteren als TIFF (Bestand: Export, Volledige resolutie beeldvenster - serie).
- Gebruik FIJI 7,8 beelden achter elkaar af te stemmen door het uitvoeren van de macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Registratie: bUnwarpJ). Wijzig Registratie Mode op Mono. Alle Geavanceerde opties kunt gebruiken standaardwaarden. Voor lange time lapse sequenties, downloadt en installeert u de macro "Affine + Consistent Elastische 2D beeldregistratie", die bUnwarpJ automatisch van toepassing zijn op een serie beelden, en open yonze gegevens met behulp van File: Import: Afbeelding Sequence om het te gebruiken. Haal het vinkje weg MOPS monumenten extractie en run.
- Gebruik FIJI / ImageJ of Quicktime Pro om de volgorde van de uitgelijnde afbeeldingen te openen en in de gewenste video formaat (AVI is een goede keuze) op te slaan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een reeks informatieve tijdstippen verzameld deze methode wordt getoond in figuur 3. Celmembranen zijn gelabeld met RFP (pm-rb) en GFP gefuseerd met POLAR eiwit onder zijn oorspronkelijke promotor (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Bij de 30-min tijdschaal, zien we celdelingen, samen met de veranderingen in de eiwit lokalisatie daaraan voorafgaande. Asymmetrische celdelingen in de stomatale lijn vorm stamcelachtige zoals stomata precursors genoemd meristemoids, die het vermogen verdere asy...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze time-lapse confocale techniek maakt longitudinale studies van fluorescent gemerkte eiwit expressie en lokalisatie in afzonderlijke cellen van de epidermis Arabidopsis cotyledon die bij POLAR en dynamisch veranderende eiwitten is essentieel voor een goed begrip van hun functie. Eerder heeft geleidelijk time lapse imaging gebruikt om Arabidopsis wortel schimmelinfectie 11 en meristeem groei 5,12 onderzoeken, maar het toevoegen van de zaadlob epidermis vergroot de veelzijdigheid...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken Amanda Rychel voor hulp bij de ontwikkeling van de time lapse-protocol en Lynn Pillitteri voor de bouw van POLAR :: POLAR-eGFP. We zijn ook dankbaar ABRC voor het verstrekken van de pm-rb te construeren. Dit protocol is ontwikkeld door middel van een ondersteuning van de PRESTO award uit Japan Wetenschap Technologie en het Agentschap. Onderzoek naar POLAR werd ook ondersteund door de Universiteit van Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) en de National Science Foundation (MCB-0855659). KMP is een NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), en KUT is een HHMI-GBMF onderzoeker.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-kamer slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Of twee-kamer (155379) |
| Laser scanning confocale microscoop | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objectief | Zeiss | 420650-9901 | NA 0,8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissectiemicroscoop | Benz (National) | 431TBL | Verlicht van beneden |
| # 5 pincet, biologie tip | Roboz Chirurgisch instrument | RS-4978 | Zeer fijne tipskritisch |
Referenties
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64(1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449(1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854(2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74(2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260(2011).
- Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji (2008).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36(2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296(2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011(2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619(2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
