Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

Samenvatting

Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.

Samenvatting

Een beter begrip van de mechanismen die receptor handel tussen de plasmamembraan (PM) en intracellulaire compartimenten vereist een experimentele benadering met een uitstekende ruimtelijke en temporele resoluties. Bovendien moeten deze benadering ook de mogelijkheid aan receptoren gelokaliseerd op de PM dan in intracellulaire compartimenten onderscheiden. Vooral detecteren receptoren in een vesicle heeft uitstekende detectiegevoeligheid, aangezien elke vesicle draagt ​​slechts een klein aantal receptoren. Standaardbenaderingen voor de behandeling receptor handel zijn oppervlak biotinylering gevolgd door biochemische detectie, die zowel de vereiste ruimtelijke en temporele resolutie mist en fluorescentiemicroscopie onderzoek immunolabeled oppervlakte receptoren, die chemische fixatie van cellen vereist en daardoor ontbreekt voldoende tijdsresolutie ^1-6. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben wij en anderen ontwikkeld en gebruikt een nieuwe stragie waarmee visualisatie van de dynamische invoeging van receptoren in de PM met uitstekende ruimtelijke en temporele resolutie ^7-17. De aanpak omvat tagging van een pH-gevoelige GFP, de superecliptic pHluorin ^18, de N-terminale extracellulaire domein van de receptoren. Superecliptic pHluorin heeft de unieke eigenschap dat bij neutrale pH fluorescerende en niet-fluorescerende bij zure pH (pH <6,0). Dus de gelabelde receptoren niet fluorescerende wanneer binnen de zure lumen van intracellulair verkeer blaasjes of endosomale compartimenten en zij gemakkelijk zichtbaar wanneer blootgesteld aan de extracellulaire neutrale pH omgeving op het buitenoppervlak van de PM. Onze strategie laat hiermee ons PM oppervlakte receptoren onderscheiden van die in intracellulair verkeer blaasjes. Om voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, en de gevoeligheid vereist om dynamische handel receotiren bereiken gebruikten we totale interne weerspiegelenion fluorescentiemicroscopie (TIRFM), waardoor we de optimale ruimtelijke resolutie van optische beeldvorming (~ 170 nm) bereiken, tijdsresolutie van de video-rate microscopie (30 frames / sec), en de gevoeligheid te detecteren fluorescentie van een GFP molecule. Door beeldvorming pHluorin-gelabeld receptoren onder TIRFM, waren we in staat om direct te visualiseren individuele receptor inbrengen gebeurtenissen in de PM in gekweekte neuronen. Deze imaging benadering kan mogelijk worden toegepast op elk membraan proteïne met een extracellulair domein dat kan worden gelabeld met superecliptic pHluorin, en dissectie van de belangrijkste gedetailleerde mechanismen voor het inbrengen van verschillende membraaneiwitten (receptoren, ionenkanalen, transporters, enz.), zodat de PM.

Protocol

1. Het voorbereiden van de Muis van Glia Cultuur voor Neuronale Cultuur Conditioning

1. T75 flessen zijn bedekt met collageen oplossing (1:3 verdunning van Purecol in DDH ₂ O). De kolven zijn verticale stand geplaatst en te drogen 's nachts in een weefselkweek kap.
2. Dissectie buffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 30 mM dextrose, 25 mM HEPES, pH 7,4, zonder calcium) en glia media (DMEM aangevuld met 10% FBS, 10 eenheden / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine en Glutamax) bereid en bewaard bij 4 ° C tot aan gebruik.
3. Op de dag van glia cultuur, de glia media verwarmd gedurende ten minste 30 minuten in e....

Discussie

Om onbekende redenen, de muis neuronen zijn altijd moeilijker te cultuur dan rat neuronen. In onze ervaring, een mengcultuur van neuronen en glia werkt goed voor primaire gekweekte muis neuronen. Een dergelijke mengcultuur is niet geschikt voor TIRF imaging experimenten, zoals in type cultuur neuronen en hun processen trendmatig bovenop gliacellen, situeren de neuronale somata en dendritische processen buiten het bereik van TIRF microscopie. Derhalve een lagere dichtheid neuronale cultuur met weinig glia op het dekglaas.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens Bedrijf Catalogus Nummer Opmerkingen
Gezuiverd bovine collageenoplossing (Purecol)	Geavanceerd Biomatrix	5005-B
Balanced Salt Hank's Solution (HBSS)	GIBCO	14185-045
Penicilline-streptomycine (Pen Strep)	GIBCO	15140-122
Natriumpyruvaat	GIBCO	11360-070
DMEM High Glucose	GIBCO	10313-021
Foetaal runderserum (FBS)
Glutamax	GIBCO	35050-061
Papaïne	Worthington Biochemical Corp	LS003126
Deoxyribonuclease I van runderpancreas (DNase I)	SIGMA	DN25-10MG
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS)	GIBCO	14190-144
0,05% trypsine	GIBCO	25300-054
Poly-l-lysine hydrobromide	SIGMA	P2636-1G
Boorzuur	Fisher-Wetenschappelijke	BP 168 tot 500
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
B-27 serumvrij Supplement	GIBCO	17504-044
Warmte inactief paardenserum	GIBCO	26050-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668 019
HEPES	Fisher-Wetenschappelijke	BP310-500
Cultuur invoegen	Millipore	PICM03050