Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

Samenvatting

Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.

Samenvatting

Een beter begrip van de mechanismen die receptor handel tussen de plasmamembraan (PM) en intracellulaire compartimenten vereist een experimentele benadering met een uitstekende ruimtelijke en temporele resoluties. Bovendien moeten deze benadering ook de mogelijkheid aan receptoren gelokaliseerd op de PM dan in intracellulaire compartimenten onderscheiden. Vooral detecteren receptoren in een vesicle heeft uitstekende detectiegevoeligheid, aangezien elke vesicle draagt ​​slechts een klein aantal receptoren. Standaardbenaderingen voor de behandeling receptor handel zijn oppervlak biotinylering gevolgd door biochemische detectie, die zowel de vereiste ruimtelijke en temporele resolutie mist en fluorescentiemicroscopie onderzoek immunolabeled oppervlakte receptoren, die chemische fixatie van cellen vereist en daardoor ontbreekt voldoende tijdsresolutie ^1-6. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben wij en anderen ontwikkeld en gebruikt een nieuwe stragie waarmee visualisatie van de dynamische invoeging van receptoren in de PM met uitstekende ruimtelijke en temporele resolutie ^7-17. De aanpak omvat tagging van een pH-gevoelige GFP, de superecliptic pHluorin ^18, de N-terminale extracellulaire domein van de receptoren. Superecliptic pHluorin heeft de unieke eigenschap dat bij neutrale pH fluorescerende en niet-fluorescerende bij zure pH (pH <6,0). Dus de gelabelde receptoren niet fluorescerende wanneer binnen de zure lumen van intracellulair verkeer blaasjes of endosomale compartimenten en zij gemakkelijk zichtbaar wanneer blootgesteld aan de extracellulaire neutrale pH omgeving op het buitenoppervlak van de PM. Onze strategie laat hiermee ons PM oppervlakte receptoren onderscheiden van die in intracellulair verkeer blaasjes. Om voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, en de gevoeligheid vereist om dynamische handel receotiren bereiken gebruikten we totale interne weerspiegelenion fluorescentiemicroscopie (TIRFM), waardoor we de optimale ruimtelijke resolutie van optische beeldvorming (~ 170 nm) bereiken, tijdsresolutie van de video-rate microscopie (30 frames / sec), en de gevoeligheid te detecteren fluorescentie van een GFP molecule. Door beeldvorming pHluorin-gelabeld receptoren onder TIRFM, waren we in staat om direct te visualiseren individuele receptor inbrengen gebeurtenissen in de PM in gekweekte neuronen. Deze imaging benadering kan mogelijk worden toegepast op elk membraan proteïne met een extracellulair domein dat kan worden gelabeld met superecliptic pHluorin, en dissectie van de belangrijkste gedetailleerde mechanismen voor het inbrengen van verschillende membraaneiwitten (receptoren, ionenkanalen, transporters, enz.), zodat de PM.

Protocol

1. Het voorbereiden van de Muis van Glia Cultuur voor Neuronale Cultuur Conditioning

1. T75 flessen zijn bedekt met collageen oplossing (1:3 verdunning van Purecol in DDH ₂ O). De kolven zijn verticale stand geplaatst en te drogen 's nachts in een weefselkweek kap.
2. Dissectie buffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 30 mM dextrose, 25 mM HEPES, pH 7,4, zonder calcium) en glia media (DMEM aangevuld met 10% FBS, 10 eenheden / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine en Glutamax) bereid en bewaard bij 4 ° C tot aan gebruik.
3. Op de dag van glia cultuur, de glia media verwarmd gedurende ten minste 30 minuten in een 37 ° C waterbad voor dissectie van muizenhersenen. Embryonale of neonatale muizen worden gedood door snelle onthoofding. Cerebrale cortex worden ontleed onder een dissectie microscoop.
4. Ontleed Hersenweefsel verteerd papaïne oplossing (100 ml papaïne en 20 pi 1% DNase I in 2 ml dissectie buffer) bij 37 ° C for 20 min.
5. Na papaïnedigestie zijn hersenweefsel gespoeld met 10 ml voorverwarmde glia media. Verse media glia (2 ml) wordt vervolgens toegevoegd aan de geknipte hersenweefsel en de weefsels worden gewreven met een vuur gepolijste glazen Pasteur pipet.
6. Verse media glia (8 ml) wordt toegevoegd aan het gedissocieerde weefsel. Een 70 urn cel-zeef wordt gebruikt om de gedissocieerde weefselsuspensie filteren. Cellen worden vervolgens gezaaid in T75 kolven (meestal 2-3 embryo kan zaad een T75 kolf) en geplaatst in een 37 ° C celkweek incubator.
7. De volgende dag, wordt het papier uit de T75 kolven opgezogen. De kolven worden gespoeld met 10 ml PBS. Verse media glia (10-15 ml) wordt vervolgens toegevoegd aan elke kolf.
8. Binnen 10-12 dagen, moet glia in de T75 flessen worden confluent. Gliale cellen gespoeld met PBS en 5 ml 0,05% trypsine toegevoegd aan elke T75 fles.
9. Na trypsine incubatie bij 37 ° C gedurende 5 min, gliale cellen gedissocieerd en gliacellen van elkaar T75 kolf in tweeverschillende collageen gecoate T75 kolven.
10. Cultuur inserts (Millipore PICM03050) worden bereid door ze in 6-well platen, coaten met collageen en luchtdrogende overnight. Glia media (2 ml per stuk) te plaatsen onder elke cultuur insert.
11. Glia van confluente T75 kolven worden getrypsiniseerd en geënt op de cultuur inserts (een T75 kolf per 6-well plaat, elke 2 ml insert). Deze inserts glia cultuur wordt gebruikt wordt om het neuronale kweken.

2. Neuronale Cultuur

1. Het glas dekglaasjes voor neuronale cultuur zijn gereinigd door ze in 70% HNO ₃ ten minste girale. Dekglaasjes worden vervolgens gewassen met ₂ O ddH ten minste 3 keer, en gedroogd in een oven Isotemp (> 200 ° C) geroerd.
2. Schoongemaakt dekglaasjes worden in een 6-well plaat, een dekglaasje per putje. Dekglaasjes worden bekleed met poly-L-lysine (2 ml, 0,1% in 100 mM boorzuur, pH = 8,5) gedurende de nacht in een 37 ° C incubator.
3. Depoly-L-lysine oplossing uit de dekglaasjes en dekglaasjes worden 3 keer gewassen met geautoclaveerd ddH ₂ O. Dekglaasjes worden dan geïncubeerd in een 37 ° C incubator overnacht in uitplaatmedia (Neurobasal aangevuld met 5% hitte-geïnactiveerd paardenserum, 10 eenheden / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine, Glutamax, 2% B27 supplement wordt toegevoegd aan het medium plating op de dag wordt gebruikt).
4. De volgende dag, de uitplaatmedia verwijderd en 2 ml vers uitplaatmedia met B-27 toegevoegd aan elk putje dat een dekglaasje bedekt is.
5. Zwangere muizen (E15-18) geëuthanaseerd met _CO2 en embryonale muizen worden gedood door onthoofding. De hippocampus of striatum wordt geprepareerd uit het hersenweefsel en geplaatst in een 15 ml conische buis met ijskoude buffer dissectie voor cultuur van hippocampale neuronen of striatale medium spiny neuronen respectievelijk.
6. Ontleed hersenweefsel kunnen worden gescheiden in papaïne zoals beschreven in stap 1.4) en 1.5).
7. Fadat dissociatie wordt het aantal cellen in elke neuronale suspensie geteld met een hemocytometer. Neuronen worden vervolgens gezaaid op elke dekglaasje bij een dichtheid van 0,4 x 10 ⁶ cellen per putje van een 6-well plaat en gekweekt in een 37 ° C incubator overnacht (neuronen DIV 0).
8. Om glia cultuur inzetstukken voor te bereiden voor het conditioneren van de neuronale culturen, wordt de glia media verwijderd van de glia cultuur inzetstukken en vers plating medium wordt toegevoegd (2 ml in de invoeg-en 2 ml onder de insert).
9. De volgende dag (DIV 1), zijn dekglaasjes met neuronen geplaatst onder de glia cultuur inserts, een dekglaasje in elk putje.
10. Neuronen worden gevoed met het halve volume verse voorverwarmde voeding media (met B-27) elke 3-4 dagen tot ze klaar voor transfectie en imaging experimenten.

3. Transfectie

1. Neuronale transfectie wordt uitgevoerd met Lipofectamine 2000. Voor elke neuronale cultuur (de ene cultuur per dekglaasje), 2 piLipofectamine 2000 en 1 ug DNA gebruikt. Verse Neurobasal medium zonder supplement wordt gebruikt om Lipofectamine en DNA te verdunnen.
2. DNA en Lipofectamine geïncubeerd gedurende 20 min bij kamertemperatuur na het mengen.
3. Sla 1 ml van de media van onder elke glia cultuur insert, en 1 ml van binnen elke insert, en breng de media om een ​​conische buis. Voeg hetzelfde volume van het voeden van de media + B27 om de opgeslagen medium en incubeer bij 37 ° C. Dit medium wordt gebruikt voor neuronale cultuur na transfectie.
4. Na de 20-min Lipofectamine / DNA incubatie worden glia cultuur inserts tijdelijk verwijderd uit de 6-well platen. De 200 pi Lipofectamine / DNA mengsel toegevoegd aan elke dekglaasje met neuronen. De glia cultuur inserts worden vervolgens teruggestuurd naar elk putje boven de neuronen. Opwekken van luchtbellen onder het membraan van de cultuur inserts worden vermeden. Neuronen worden geïncubeerd met de Lipofectamine / DNA mengsel bij 37 ° C gedurende 2-4 uur.
5. Na ee 2-4 uur incubatieperiode worden glia inserts weer verwijderd. Het kweekmedium met de Lipofectamine / DNA mengsel wordt uit elk putje verwijderd. De media opgeslagen in stap 3.3) wordt toegevoegd aan neuronen (2 ml per well). Glia cultuur inserts worden geretourneerd aan elk putje en glia medium van elk inzetstuk is verwijderd, en 2 ml van de media uit stap 3.3) wordt toegevoegd aan elk insert.
6. Neuronen gekweekt voor een extra 24-72 uur om expressie van cDNA getransfecteerd voordat TIRF beeldvorming wordt uitgevoerd op deze neuronen.

4. TIRF Imaging

1. Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM glucose, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 25 mM HEPES, pH = 7,4) wordt gebruikt voor live-imaging experimenten. Ons TIRF imaging-systeem is op maat set-up met een 100-mW cyaan laser voor excitatie, en een Electron vermenigvuldigen Charge Coupled Device (EMCCD) camera voor een detector.
2. Voorafgaand aan beeldvorming experimenten wordt de aCSF gewaarschuwd in een 37 & deg; C waterbad gedurende ten minste 30 minuten. De verwarming insert voor levende beeldvorming op de microscooptafel en de verwarming insert, laser en camera worden verwarmd gedurende ten minste 30 minuten voor aanvang van de imaging experimenten.
3. Een dekglaasje met getransfecteerde neuronen wordt geassembleerd in de live-imaging kamer. De voorverwarmde aCSF geplaatst in de kamer nadat de kamer is gemonteerd, deze stap worden zo snel als mogelijk.
4. Zodra de kamer rust op de verwarming insert op de microscoop fase worden getransfecteerde neuronen geïdentificeerd visueel onder epi-fluorescentie imaging mode.
5. Na gezonde getransfecteerde neuronen geïdentificeerd (zie figuren 1 en 2), we voeren gewoonlijk 1 minuut foto-bleach tot bestaande pHluorin fluorescentie regulering van de plasmamembraan, zoals pHluorin-receptoren op het plasmamembraan zeer hoge fluorescentie niveaus wanneer TIRF imaging wordt gestart, die interfereert met visualisatie van afzonderlijke insertion evenementen.
6. Na photobleach wordt de versterkingsinstelling van de elektronenvermenigvuldiger de EMCCD camera op maximum en opname uitgevoerd gedurende 1 min bij 10 Hz.
7. Elke opname bevat 600 beelden. Individuele inbrengen gebeurtenissen worden geïdentificeerd door het spelen van de opname terug met behulp van ImageJ. Individuele inbrengen gebeurtenissen worden geanalyseerd handmatig met ImageJ.

5. Representatieve resultaten

Consistente neuronale cultuur is de sleutel tot succesvolle live-imaging experimenten. Figuur 1 toont de muis hippocampale neuronen gekweekt met behulp van ons protocol van DIV 11 tot 18 DIV. Het is duidelijk uit de beelden die de neuronen hebben uitgebreide processen ontwikkeld en dat de dendritische processen dicht zijn bedekt met dendritische spines, aanwijzingen dat deze neuronen zijn gezond in cultuur. Onze cultuur protocol kan ook gebruikt worden voor andere types van neuronen in de hersenen. Zo hebben we onlangs gebruikt dit protocol om cultuurstriatale medium spiny neuronen in een studie om dopamine D2 receptor (DRD2) inbrengen onderzoeken in gekweekte muis striatale medium spiny neuronen ^9. Figuur 2 toont de muis striatale medium spiny neuronen gekweekt met behulp van ons protocol bij DIV 8. We hebben ook met succes uitgevoerd TIRF beeldvorming van superecliptic pHluorin-gelabeld DRD2s in dit type neuron. Figuur 3 toont expressie van pHluorin-gelabeld DRD2 (pH-DRD2) in een medium doornige neuronen en visualisatie van pH-DRD2 insertie in deze neuron.

Figuur 1. Mouse hippocampus culture met behulp van de interface kweekmethode. DIV: dagen in vitro, de dag van de cultuur wordt beschouwd als DIV 0. Van de beelden, is het duidelijk dat hippocampale neuronen mature in dit type cultuur tussen 11 en DIV DIV 15. Bij DIV 11 en 13, zijn neuronale dendrieten bedekt met filipodia en onvolwassen stekels. Bij DIV 15 en18, zijn neuronale dendrieten bedekt met grote stekels, een indicatie van meer volwassen neuronen. Links panelen: laag vergroting beelden van de muis hippocampale neuronen op verschillende leeftijden. Rechts panelen: sterk vergrotende afbeeldingen (inzoomen op de neuronale dendrieten van het linkervenster) van neuronale dendritische processen met dendritische spines op verschillende leeftijden.

Figuur 2. Mouse striatale medium spiny neuron cultuur met behulp van de interface kweekmethode. Neuronen in de beelden zijn op DIV 8.

Figuur 3. Een muis striatale medium spiny neuron getransfecteerd met super ecliptica pHluorin-gelabeld dopamine D2 receptor (pH-DRD2). Afbeelding links is maximale intensiteit projectie van een time-lapse-opname (600 afbeeldingen, 100 msec per beeld). Witte pijlen geven individuele vesiculaire insertie van pH-DRD2. Dit beeld blijft inbrengen informatie in het xy dimensie, maar verliest de tijd informatie. Beeld aan de rechterkant toont yt maximale intensiteit projectie, waarbij de XYT stapel 90 graden gedraaid rond de y-as en de maximum pixel op elke x-as lijn geprojecteerd op een y-as pixel. Deze afbeelding behoudt inbrengen informatie langs de as yt maar verliest de x-as informatie.

Discussie

Om onbekende redenen, de muis neuronen zijn altijd moeilijker te cultuur dan rat neuronen. In onze ervaring, een mengcultuur van neuronen en glia werkt goed voor primaire gekweekte muis neuronen. Een dergelijke mengcultuur is niet geschikt voor TIRF imaging experimenten, zoals in type cultuur neuronen en hun processen trendmatig bovenop gliacellen, situeren de neuronale somata en dendritische processen buiten het bereik van TIRF microscopie. Derhalve een lagere dichtheid neuronale cultuur met weinig glia op het dekglaas...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens Bedrijf Catalogus Nummer Opmerkingen
Gezuiverd bovine collageenoplossing (Purecol)	Geavanceerd Biomatrix	5005-B
Balanced Salt Hank's Solution (HBSS)	GIBCO	14185-045
Penicilline-streptomycine (Pen Strep)	GIBCO	15140-122
Natriumpyruvaat	GIBCO	11360-070
DMEM High Glucose	GIBCO	10313-021
Foetaal runderserum (FBS)
Glutamax	GIBCO	35050-061
Papaïne	Worthington Biochemical Corp	LS003126
Deoxyribonuclease I van runderpancreas (DNase I)	SIGMA	DN25-10MG
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS)	GIBCO	14190-144
0,05% trypsine	GIBCO	25300-054
Poly-l-lysine hydrobromide	SIGMA	P2636-1G
Boorzuur	Fisher-Wetenschappelijke	BP 168 tot 500
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
B-27 serumvrij Supplement	GIBCO	17504-044
Warmte inactief paardenserum	GIBCO	26050-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668 019
HEPES	Fisher-Wetenschappelijke	BP310-500
Cultuur invoegen	Millipore	PICM03050