Visualiseren individuele cellen in dicht opeengepakte weefsels, zoals terminal Schwann-cellen (SC) op neuromusculaire verbindingen (NMS), is een uitdaging. "Sequential foto-bleken" laat de afbakening van een enkele terminal SC's, bijvoorbeeld in de triangularis sterni spier explantatie, een handige zenuw-spier voorbereid, indien sequentiële bleken kan worden gecombineerd met time-lapse imaging en Post-hoc Immunostainings.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Sequential Photo-bleken om Single Schwann cellen afbakenen op de neuromusculaire junctie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Sequential foto-bleken is een niet-invasieve manier om afzonderlijke SC label aan de NMJ. De NMS is de grootste synaps van de zoogdieren zenuwstelsel en heeft gediend als leidraad model om synaptische structuur en functie te bestuderen. In de muis NMS motor axon terminals vormen krakeling-achtig contact sites met spiervezels. De motor axon en de terminal zijn ommanteld door SCS. In de afgelopen decennia zijn verschillende transgene muizen werden gegenereerd om motorneuronen en SC's te visualiseren, bijvoorbeeld Thy1-XFP 1 en PLP-GFP muizen 2, respectievelijk.
Langs de motor axonen, worden myeliniserende axonale SC's gerangschikt in niet-overlappende internodiën, gescheiden door knopen van Ranvier, om sprongsgewijze actiepotentiaal voortplanting mogelijk te maken. In tegenstelling, terminal SC's op de synaps zijn gespecialiseerde gliale cellen, die te bewaken en te bevorderen neurotransmissie, verteren puin en gids regenererende axonen. NMS zijn strak gedekt door tot een half dozijn niet-myelinating terminal SC's - deze kunnen echter niet afzonderlijk worden opgelost door middel van lichtmicroscopie, omdat ze in direct contact membraan 3.
Verschillende benaderingen bestaan om individueel visualiseren terminal SC. Geen van deze zijn onberispelijk, dat wel. Bijvoorbeeld, kleurstof vullen, waarbij enkele cellen worden gespietst met een kleurstof gevulde micro-elektrode, vereist het vernietigen van een gelabelde cel alvorens in een tweede. Dit is niet compatibel met de volgende time-lapse opnames 3. Multispectrale "Brainbow" etikettering van SCS is bereikt door combinatorische expressie van fluorescerende eiwitten 4. Deze techniek heeft waarin verschillende transgenen en wordt begrensd door het expressiepatroon van de promoters gebruikt. In de toekomst zou expressie van "photo-schakelbare" eiwitten in SCS nog een andere alternatieve 5. Hier presenteren we sequentiële foto-bleken, waarbij enkele cellen worden gebleekt, en hun imago verkregen door aftrekking. Wij gelovendat deze benadering - vanwege het gemak en de veelzijdigheid - is een blijvende Naast technologie de neurowetenschapper palet, vooral omdat het kan worden gebruikt in vivo en overgebracht naar andere celtypen lokalisaties of soorten 6.
In het volgende protocol, ingegaan op de toepassing van de sequentiële bleken en de daaropvolgende confocale time-lapse microscopie op klem SC's in triangularis sterni spier explantaten. Deze dunne, oppervlakkige en gemakkelijk ontleed zenuw-spier voorbereiding 7,8 nuttig is gebleken voor studies van NMJ ontwikkeling, fysiologie en pathologie 9. Tot slot leggen we uit hoe de triangularis sterni spier bereid is na fixatie uit te voeren gecorreleerd met een hoge resolutie confocale beeldvorming, immunohistochemie of ultrastructurele examens.
Protocol
1. Triangularis Sterni Explantatie (figuur 1)
Timing: 15 minuten.
- Bereid chirurgische instrumenten: 2 paar tangen, 1 schaar, 1 paar van de lente schaar, 1 weefselkweek schotel (10-cm). Vooraf geborreld (minimum voor 15 min) gekoelde (4 ° C) Ringer's oplossing met 5% CO 2/95% O2. Vul 15-cm weefselkweek schotel met ijs en dek deze af met metalen plaat. Bereid dissectie microscoop en plaats de 15-cm schaal met ijs onder de scope dissectie om het explantaat koelen tijdens dissectie.
- Dodelijk verdoven de muis door isofluraan overdosering (of een andere goedgekeurde methode van het offer). Spuit de muis met 70% ethanol om bont verontreiniging van het explantaat te voorkomen. Voor SC bleken, gebruikten we Plp-GFP muizen, die kan Thy1-OFP3 of Thy1-Membow13 worden gekruist voor gelijktijdige visualisatie van de axon.
- Met het paar grote schaar, een incisie vande huid over het borstbeen en twee insnijdingen evenwijdig aan de onderrand van de ribbenkast.
- Met behulp van de paar grote schaar, verwijder de huid, opent de buikwand, en maak incisies parallel aan de ribbenkast helemaal terug aan de wervelkolom. Dan ontleden van de borstspieren door het maken van insnijdingen in de buurt van de spier insertie op het borstbeen.
- Snijd het diafragma geopend net onder de zwaardvormig kraakbeen en ontleden uit het membraan langs de ribben inserties.
- Die de ribbenkast van de zwaardvormig proces met een set van forceps, start het snijden van de ribben van de wervelkolom, zo dicht mogelijk bij hun inserties. De linker en rechter bezuinigingen moeten convergeren boven het hart naar de manubrium sterni. Probeer te voorkomen dat het snijden van grote bloedvaten (vooral de subclavia aderen). Beter zicht wordt bereikt door voorzichtig op te tillen van de bereiding terwijl op de zwaardvormig proces met een pincet.
- Maak een dwarse snede net onder de manubrium sternien breng het explantaat in de 10 cm schaal met gekoelde 5% CO 2/95% O2 fijnbellige Ringer's oplossing. Plaats de 10-cm schotel op de metalen plaat die de 15-cm weefselkweek schotel gevuld met ijs. Alle verdere stappen moeten worden gedaan onder de dissectie microscoop.
- Met behulp van kleine lente schaar verwijderen van de resten van de thymus, pleura, membraan (binnen) en borstspieren (buiten; Figuur 1B-D).
- Om de explantatie te passen aan de 3,5-cm schotel, ontleden korting op alle de ribben die niet te plaatsen om het borstbeen. Dit kan het beste gebeuren met behulp van kleine lente schaar en het snijden van het weefsel tussen ribben (figuur 1E).
- Speld de triangularis sterni zenuw-spier explantaat in de Sylgard gecoate 3,5-cm weefselkweek schotel met minutien pennen (ingekort tot <4 mm; figuur 1G). Twee pennen moeten gaan door middel van kraakbeen (wit) delen van het borstbeen. Steek ten minste twee pennen door de ribben zowel links en rechts van ee explantaat streven naar de zachtere kraakbeen delen en het vermijden van de ribben onder of dicht bij de triangularis spier. Hoe meer pennen worden gebruikt, hoe beter (we gebruiken meestal 8-10). Zoals je vast te pinnen de voorbereiding, zorg ervoor dat de ribben enigszins worden gespreid, de vaststelling van de spier in een licht uitgerekte positie.
- Optioneel: Visualiseer synaptic sites die acetylcholinereceptoren door toevoeging bungarotoxin gekoppeld met Alexa kleurstoffen (concentratie van 0,8 ug / ml in 5% CO2 / 95% O 2 fijnbellige Ringer's oplossing). Incubeer gespelde explant in Sylgard gecoate schaal gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens verschillende malen wassen met 5% CO 2/95% O2 fijnbellige Ringer's oplossing.
2. Bleken SC's en optionele Time-lapse microscopie (figuur 2)
Timing: 30 - 45 min + optioneel 1 tot 5 uur voor time lapse.
- Transfer 3,5-cm Sylgard-gecoate schaal van een confocale microscoop uitgerust humorh een argon-laser (488 nm golflengte) en water onderdompeling doelstellingen (4x, 0,13 NA, 20x, 0,5 NA en 100x, 1,0 NA of 60x, 0,9 NA).
- Optioneel voor time-lapse microscopie: Insert 3,5-cm Sylgard-gecoate schaal in verwarmings-ring, installeer superfusie systeem en temperatuursensor (Figuur 2A). Zorg ervoor dat geen van hen de explantatie, de rand van de schaal of de Sylgard coating aan te raken. Verwarm het monster tot 33-35 ° C. Voor SC bleken zonder time-lapse, kamertemperatuur is beter, als cellen vertonen minder dynamiek tussen bleken stappen.
- Met een 4x lucht objectieve observeren innervatie patroon van triangularis sterni spieren en vind triangularis sterni eindplaat band. Schakel over naar 20x dompelen-cone objectieve en ga op zoek naar oppervlakkige regio's binnen de eindplaat band (gebieden bovenliggende ribben zijn goede kandidaten). Wijzig doelstelling om 100x of 60x dompelen-conus doel om na te gaan op individuele NMS. Ideaal is een NMJ dat wordt gedekt door een aantal SC's en ligt zeer superficially (Figuur 2B). Als het uitvoeren van time-lapse imaging na het bleken, tot selecteren 3 NMS die relatief dicht bij elkaar om de opbrengst te verhogen.
- Verwerven een confocaal beeld van de NMJ voor foto-bleken individuele SCS (figuur 2B). (Voor de volledige resolutie beeldvorming, bijvoorbeeld op een Olympus FV1000 microscoop, gebruik dan een 100x, 1,0 NA objectieve en 2,5 zoom, wat resulteert in Nyquist-beperkte bemonstering van ~ 0,1 micrometer per pixel.)
- "Park" de 488 nm laserbundel centraal op de kern van een SC met maximale kracht gedurende 5 seconden (respectievelijk een efficiënte scan patroon in een klein gebied van belang worden gebruikt, zoals "tornado scan" functie op een Olympus microscoop; als we een confocale microscoop, de laser is gericht op het beeld-conjugaat vliegtuigen en dus bij 488 nm met een doelstelling van 1,0 NA, <0,5 urn in diameter). Opnieuw concentreren op de cel en rechter bleken resultaat. Herhaal indien nodig bleektrap weer tot GFP niveaus te verminderend tot bijna achtergrondniveaus. Acquire een beeld na het bleken (figuur 2C). Het is cruciaal om te zorgen dat de gebleekte gebied buiten van overlapping tussen twee cellen - als er overlap, zal bleken in een tweede cel duidelijk.
- Herhaal stap hierboven totdat alle, maar een SC worden gebleekt (figuur 2D-E). De laatste "ongebleekt" SC is geschikt voor confocale time-lapse microscopie. Reconstrueren enkele cellen door aftrekking van beelden, bijvoorbeeld met behulp van Photoshop-software, om enkele SC morfologie en grondgebied (figuur 2F) af te bakenen. Wees ervan bewust dat het aftrekken van twee magiërs ruis (bijvoorbeeld door ze te importeren in opeenvolgende "lagen" in Photoshop en vervolgens om de boven-kanaal "verschil" in het drop-down menu aan de bovenkant van de kanalen tab) toevoegt. Dit kan worden omzeild door gebruik te maken van de "Ontvlekken"-functie op de kanalen vóór aftrek en bijsnijden weg elke achtergrond die duidelijk niet afkomstig is uit degebleekt cel. Om contrast te optimaliseren, kan het nodig zijn om de helderheid van de twee kanalen in de "niveaus" venster passen. De resulterende beeld van de gebleekte cel is de boven op het origineel beeld van een synaps, pseudo-gekleurd in een unieke tint en transparant gemaakt op het grondgebied van de gebleekte cel kleur in de oorspronkelijke afbeelding (van het doen van dit voor alle gebleekt en de laatste , ongebleekt cellen het beeld weergegeven in figuur 2F resultaten).
- Optioneel: Start confocale time-lapse microscopie na het bleken op een na alle SC's. Een foto op vaste tijdstippen (bijvoorbeeld elke 5 tot 10 min). Gebruik zo weinig mogelijk stroom laser. Tot 3 NMJs kan worden afgebeeld op dezelfde sessie.
- Maak een kaart van de time-verjaarde NMS door het nemen van een beeld op 100x zonder zoom, dan beelden van de regio met behulp van 20x en 4x doelstellingen (figuur 2G-I). Deze "kaart" is nodig om na NMJs immunohistochemie een vaste spier vinden.
- Voor het imago vanverwerking, converteren individuele beelden in maximale intensiteit projecties en op te slaan in tiff-formaat. Combineer alle z-verwachte tijdstippen in een stack en uitlijnen in xy, bijvoorbeeld met behulp van de "stackreg" plugin 10 in Fiji (een pakket op basis van de open source software ImageJ, National Institutes of Health).
3. Fixatie en immunohistochemie (figuur 3)
Timing: Overnachting.
- Breng het explantaat in een 50 ml reageerbuis met ten minste 15 ml 4% PFA door zorgvuldig verwijderen van de pennen. Post-fix de voorste thoraxwand met de triangularis sterni spier gedurende 1 uur op ijs. Spoel gefixeerd weefsel met 0,1 M glycine in PBS (om residueel fixeermiddel dus doof en verminderen achtergrond) gedurende ten minste 10 minuten. Monsters kunnen worden opgeslagen op dit punt en later verwerkt.
- Overdracht vaste explant een 10-cm Sylgard beklede weefselkweekplaat gevuld met 0,01 M PBS. Knip een trapeziumvorm met een side evenwijdig aan het borstbeen en de andere door het bot naar kraakbeen overgangen - dit bevat de triangularis spier op het oppervlak. Onderste ribben met een horizontale (dwz trans-sternum) afgesneden zodat het caudale einde van de triangularis spier vrij toegankelijk (Figuur 3A-D).
- Plaats een injectienaald als een pen in het bovenste deel van het trapezium (figuur 3E). Gebruik een hypodermische naald bevestigd aan een 1 ml spuit en de forceps triangularis spier verwijderen op het oppervlak voorzichtig vasthoudt caudale hoek van de spier en met de naald als een micro-scalpel. Zorg ervoor dat bezuinigingen parallel worden gemaakt op het vlak van de thoraxwand. Zodra de caudale deel van de spier wordt losgelaten, plaats een andere injectienaald als een speld onder de spier door de thoraxwand - deze immobiliseert de voorbereiding en maakt het uitoefenen van een zachte ruk aan de spier met behulp van een pincet (Figuur 3F). Als u het snijden bindweefsel tissue inserties, "schil" weg van de spier van de thorax. Snijd laatste caudale aanhechting met de lente schaar. Verwijder vet en bloedvaten restanten behulp van een tang. Wees voorzichtig niet te scheuren weg de zenuwen. Opmerking: Gebruik aparte sets van gereedschappen en gerechten voor het werken met levende en vaste weefsel.
- Start immunohistochemie (met een standaard protocol) door overdracht weefselmonsters in blokkeringsoplossing gedurende 1 uur op een schudinrichting bij kamertemperatuur. Klein mogelijk volume kleuring 200 pi met een 96-well plaat.
- Toepassing primair antilichaam verdund in blokkeeroplossing, 200 ul per putje, overnacht bij 4 ° C op een schudder.
- Wassen in 0,01 M PBS driemaal gedurende 10 minuten.
- Toepassing geschikt secundair antilichaam gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur verdund in blokkeeroplossing.
- Wassen in 0,01 M PBS driemaal gedurende 10 minuten.
- Monteer in anti-fading medium (bijv. Vectashield) en dekglaasje aan.
- Plaats dia op magnetische metalen plaat, plaats magneet op de topvan het monster gedurende enkele uren of overnacht bij 4 ° plat C. Seal met nagellak.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een voorbeeld van een triangularis sterni explant gereed voor imaging schaal is weergegeven in figuur 1G. Dit explant is bijzonder geschikt voor imaging NMJs ex vivo als triangularis spier slechts bestaat uit een paar lagen van spiervezels. Dit maakt het verkrijgen van hoge resolutie beelden van explantaten uit transgene muizenlijnen die respectievelijk SCS (PLP-GFP 2) en / of axons (Thy1-XFP 1). Kritieke factoren voor hoge beeldkwaliteit omvatten: (i) vo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De SC bleken methode hier gepresenteerde is eenvoudig, snel en veelzijdig: (i) Het maakt onthullend enkele SC morfologie en dynamiek door confocale microscopie op basis van een enkel transgen - en dat is een belangrijk voordeel bij het combineren van de benadering, die bijv. met de ziekte van modellen die extra allelen nodig . (Ii) De werkwijze is snel, zoals dissectie van de fixatie kan worden uitgevoerd in een halve dag. (Iii) Het aantal toepassingen is breed, als het kan worden gecombineerd met andere werk...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We willen graag Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi en Kristina Wullimann bedanken voor een uitstekende technische bijstand. Wij danken W. Macklin voor het verstrekken van PLP-GFP muizen. TM wordt ondersteund door het Institute of Advanced Studies (Technische Universität München), door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), door de Alexander-von-Humboldt-stichting en door de nationale financiering agentschap ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) in het kader van ERA-Net NEURON "iPSoALS" en "2-foton beeldvorming". TM en MB worden ondersteund door het Centrum voor Geïntegreerde Protein Science (München). PM werd gesteund door de Graduate School van de Technische Universität München (TUM-GS).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Bedrijf (voorbeeld) | Catalogusnummer | Opmerkingen (optioneel) |
| 70% (vol / vol) ethanol oplossing | Roth | T913.1 | in spray flacon |
| isofluraan | Forene, Abbott | andere goedgekeurde verdoving kan worden gebruikt voor dodelijke anesthesie | |
| transgene muizen (PLP-GFP) | te worden verkregen uit bronnen aangehaald | ||
| dissectie microscoop met koud licht verlichting | Olympus SZ51 | met Schott KL 1500 LCD | |
| tang #2 | Fine Science Tools | 11.233-20 | |
| forceps # 5 | Fine Science Tools | 11.295-00 | |
| schaar, grote medische | Fine Science Tools | 14.108-09 | |
| schaar, kleine schuine lente | Fine Science Tools | 15.033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| verwarming ring voor 3,5-cm schalen | Warner Instruments | 64-0.110 DH-35 | |
| tweekanaals systeem van de temperatuurcontrole | Warner Instruments | TC-344b | |
| superfusie pompsysteem | custom-built | ||
| 15-cm weefselkweek schotel | Sarstedt | 83.1803.003 | gevuld met ijs en bedekt met metalen plaat |
| 10-cm weefselkweek schotel | Sarstedt | 83.1802.003 | met zuurstofrijk Ringer-oplossing |
| 3,5-cm weefselkweek schotel | Sarstedt | 83.1800.003 | gevuld met Sylgard polymeer |
| Sylgard polymeer | Dow Corning | Sylgard 184 siliconelastomeerfase Kit | |
| confocale microscoop | Olympus | FV1000 | met argon laser |
| 50 ml reactiebuis | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| canule 0,5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| 1 ml injectiespuit | Neolab | E-1496 | |
| synaptofysine antilichaam | Invitrogen | 18-0.130 | konijn |
| secundair antilichaam | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plaat | Sarstedt | 83,1836 | |
| 0,01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0,1 M glycine in PBS | Roth | 3790,1 | |
| dekglaasjes | Neolab | E-4132 | |
| dia's | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector laboratoria | H-1000 | |
| minutien kunnen × 10 | Fine Science Tools | 26.002-20 | verkort tot <4 mm |
| α-Bungarotoxin gekoppeld met Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blokkeeroplossing | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0,2% Triton-X100 | Roth | 3051,3 | |
| 10% normaal geitenserum | Abcam | ab7481 | |
| 1% runderserumalbumine | Sigma | A7030 | |
| Ringer geborreld met 95% O2 / 5% CO2 | |||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2,5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1,25 mM NaH 2PO 4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Tabel 1. Specifieke reagentia en apparatuur. |
Referenties
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
