Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

Stephan Heermann; Kerstin Krieglstein

doi:10.3791/50016

Methodenartikel

Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

11.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50016

⸱

21 november 2012

Stephan Heermann¹^,² , Kerstin Krieglstein¹^,³

¹Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg , ²Department of Neuroanatomy, University of Heidelberg, ³FRIAS, University of Freiburg

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.

Samenvatting

De ontwikkeling van de perifere zenuwen is een intrigerend proces. Neuronen sturen axonen om specifieke doelen, die bij de mens zijn vaak meer dan 100 cm afstand van de soma van het neuron innerveren. Neuronale overleving tijdens de ontwikkeling afhankelijk doel afgeleide groeifactoren maar ook op de steun van Schwann-cellen (SC). Daartoe SC ensheath axonen uit het gebied van de neuronale soma (of de overgang van centrale naar perifere zenuwstelsel) de synapsen of neuromusculaire junctie. Schwann cellen zijn derivaten van de neurale lijst en migreren als voorlopers langs nieuwe axons totdat de axon is bedekt met SC. Dit toont het belang van SC migratie voor de ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel en onderstreept de noodzaak om dit proces te onderzoeken. Met het oog op SC ontwikkeling te analyseren, is een setup nodig die naast de SC's ook hun fysiologische substraat voor migratie, het axon omvat. Door intra-uteriene ontwikkeling (Mus musculus). Om dit te omzeilen, hebben we aangepast de superieure cervicale ganglion (SCG) explantatie techniek. Bij behandeling met zenuwgroeifactor (NGF) SCG explantaten verlengen axonen, gevolgd door SC precursoren migreren langs de axonen van de ganglion naar de periferie. Het mooie van dit systeem is dat de SC zijn afgeleid van een pool van endogene SC en dat ze migreren langs hun fysiologische axonen die steeds tegelijkertijd. Dit systeem is vooral intrigerend, want de SC ontwikkeling langs axonen kunnen worden geanalyseerd door time-lapse imaging, het openen van nieuwe mogelijkheden om inzicht te krijgen in SC migratie.

Protocol

1. Bereiding van collageengels

Bereid een voorraad medium, dat 455 ul 10x MEM, 112 ul 7,5% _NaHCO3, 50 pl glutamine en NaOH. De concentratie en de hoeveelheid NaOH afhankelijk van de rat-tail collageen preparaat (zie 1.2), het uiteindelijke volume van de voorraad medium dat 1000 pi.
Bereid rat-tail collageen volgens Ebendal (1). Sla de collageenoplossing bij 4 ° C. Een verslechtering van de collageenoplossing kon niet worden vastgesteld. Na voorbereiding van een nieuwe partij, een schatting van de NaOH-concentratie die nodig is voor de voorraad medium (zie 1.1). Gebruik de pH-indicator van het medium voor titratie van de hoeveelheid en concentratie van NaOH. 800 ul zure rat-tail collageen moet een kleur rood te zetten wanneer het wordt gemengd met 210 ul van de voorraad medium. Indien de concentratie van NaOH te laag is collageen oplossing geel vanwege de pH indicator van het medium. Voeg de collageen aan het medium en meng zonder proucing bellen. Voer de volgende stappen op het ijs. De polymerisatie binnen 2 uur na de collageenoplossing en stock medium zijn gemengd en de nieuwe oplossing geïncubeerd bij 37 ° C. Test dit voordat een experiment. 1,3) Meng 800 ul van collageen oplossing met 210 ul van voorraad medium (zie 1.2). Plaats 100 ul van deze oplossing in putjes van een 8 goed kamer dia. Incubeer de glaasjes bij 37 ° C, _5% CO2 en vochtige omstandigheden in een celkweek incubator. Bereid de collageen gels onder een celcultuur bank en steriele omstandigheden. Het collageen verstijfselt binnen 2 uur.

2. Dissectie van embryonale SCGS

Oogst embryo's van de tijd zwangere muizen (E16-18) uit de baarmoeder en bewaar ze in PBS tot nader nodig.
Prepareer een embryo van het amnion. Onthoofden het embryo caudale van de claviculaire niveau. Bevestig de kop op een silicium onderste schaal met "insect-naalden". De ventrale zijde van het hoofd mee te maken heeft u eend moet je de submandibulaire regio te zien. De fixatie kan gemakkelijker voorbereiding.
Verwijderen van de huid van de submandibulaire regio links en rechts en daarmee de subcutane bindweefsel.
Verwijder de submandibulaire speekselklieren van hun locatie om van het uitzicht te wissen op het tongbeen, de infrahyoidal spieren en de m. sternocleidomastoideus.
Verwijder voorzichtig deze spieren om de weergave te wissen op het strottenhoofd en de luchtpijp. Verwijder de luchtpijp en het strottenhoofd. De halsslagaders zijn dan zichtbaar aan beide kanten op de prevertebrale spieren. De SCG ligt in de bifurcatie van de halsslagader en heeft een ovale vorm. Verwijder voorzichtig de ganglia en plaats ze in PBS. Verwijder voorzichtig de ganglia van de dissectie-instrumenten als ze vasthouden aan hen. Het is gunstig voor forceps en een naaldhouder bevestigd met een "insect naald" voor de SCG verwijderen gebruiken.
Eenmaal in PBS, slaan de ganglia bij kamertemperatuur in PBS tot ontleed enough ganglia. Reinig vervolgens de achterwortelganglia van bloedvaten en bindweefsel. Voer de SCG dissectie en schoonmaken onder een dissectie microscoop onder een laminaire stroming bank.
Plaats tenslotte de geëxplanteerde ganglia op het verstijfselde collageen gels met behulp van injectienaalden gemonteerd op een injectiespuit een eenvoudige bediening.
Incubeer de SCG explantaten op gegelatiniseerde collageen in een celkweek incubator bij 37 ° C met _5% CO2 en vochtige omstandigheden.

3. Behandeling van SCG Explantaten

Na 1-2 uur incubatie dekking van de SCG explantatie van collageen met 100 ul Neurobasal celcultuur medium dat B27 supplement, glutamine en antibiotica. Nu de putjes van de kamer's bevatten een volume van 200 ul (100 ul gel en 100 ul medium). Voeg een 200 ul van het medium, maar nu met NGF (60 ng / ml) om axonale groei te bevorderen. Dienovereenkomstig de uiteindelijke NGF concentratie 30 ng / ml.
1. Om het begin van de SC migratie te onderzoeken, direct toe te voegen bijkomende factoren op dag in vitro 0 (DIV0). Los de factoren in het medium met NGF in de benodigde dubbele concentratie (2).
2. Om het effect op SCS die reeds begonnen migreren langs axonen analyseren voeg extra factoren DIV3 tot DIV4 (mogelijke stop van het experiment). Daartoe verwijder 180 ul van de oplossing op DIV3 en voeg 200 ul nieuwe medium dat NGF en andere factoren van belang bij de dubbele concentratie (2).

4. Time-lapse imaging

Gebruik een omgekeerde microscoop voor analyses. Verschillende doelen worden gebruikt, waarin het gezichtsveld en vergroting. Een belangrijk aspect is echter de werkafstand van de gebruikte doel, zoals beeldvorming van de SCG explantaten wordt uitgevoerd door het objectglaasje en collageengel. De opname snelheid van 1/10-30 minuut toonde goede resultaten (2). Echter, dit aspect moet worden aangepast aan de wetenschappelijke vraag. Een normale CCD camera kan worden gebruikt voor beeldopname. Voor time lapse imaging een celkweek incubatiekamer moet worden gehecht aan de objecttafel van de microscoop. Incubeer het weefsel tijdens imaging bij 37 ° C met _5% CO2 en vochtige omstandigheden. Start het incubatiesysteem een uur voor de start van beeldvorming. Hierdoor kan de microscoop delen (bijv. doel) met de kamer dia aanpassen aan de temperatuur en voorkomt temperatuur veroorzaakte drift. Definieer specifieke analyses (binnen explant op en tussen verschillende explantaten) met behulp van de microscoop software en een software-gecontroleerde gemotoriseerde fase (meervoudig setup) voor gelijktijdige analyse van verschillende toegepaste omstandigheden de SCG explantaten. Voor time-lapse imaging wildtype weefsel en weefsel van transgene dieren kunnen worden gebruiktmarkeren van de SCS (S100B: GFP) (3). Voor grafische fluoroforen een fluorescerende lichtbron moet worden geïmplementeerd in de micropscope setup. Gebruik standaard filters.

5. Kwantificering van SC migratie afstanden

Op het eindpunt (DIV4 bijvoorbeeld), bevestig de collageengels met 4% PFA in de kamer glijbaan voor 3-4 uur. Achtereenvolgens wassen collageengels 5 keer gedurende 10 minuten met PBS. Toepassing standaardprotocollen voor immunocytochemie (2). Als je nieuw bent in de voorbereiding van SCGS, controleert de identiteit van het ganglion als een sympathieke ganglion door immunohistochemie tegen tyrosine hydroxylase (TH) een gemeenschappelijke marker voor catecholaminerge cellen. Tijdens immunohistochemie (na het primaire antilichaam), overdragen bevattende explant collageengels aan platen met 24 putjes, die een groter volume, wat gunstig is voor het wassen van de gels zijn.
Na immunohistochemie, plaatst u voorzichtig het collageen gels op glasplaatjes. VoorzichtigVerwijder de resterende oplossing en laat het collageen drogen / krimpen tot twee dimensies. Dit maakt een eenvoudige metingen van afstanden (2). Daarna monteert u de monsters.
Tenslotte meet de migratie afstanden met behulp van Fiji (NIH)-software. Geen speciale plugins nodig daartoe. Om een correcte metingen in micrometer mogelijk te maken, de correcte beeldvorming metadata en de instellingen onder de Fiji-, beeld-en schaal. Ook gebruik maken van Fiji voor de kwantificering van cellen.