4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

Samenvatting

Cellulaire levensvatbaarheid hangt af van een tijdige en efficiënte beheer van eiwit misfolding. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van de verschillende potentiële lot van een verkeerd gevouwen eiwitten: hervouwing, afbraak of opslag in insluitsels. We demonstreren het gebruik van een opvouwbare sensor, Ubc9 ^Ts, Voor monitoring proteostasis en aggregatie kwaliteitscontrole in levende cellen met behulp van 4D microscopie.

Samenvatting

Een van de belangrijkste taken van elke levende cel is het handhaven van de juiste vouwing van nieuw gesynthetiseerde eiwitten in het gezicht van de steeds veranderende milieu-omstandigheden en een intracellulaire omgeving die dicht opeengepakte, kleverig, en gevaarlijk voor eiwitstabiliteit ^1. De mogelijkheid om dynamisch evenwicht eiwitproductie, vouwen en degradatie vraagt ​​zeer gespecialiseerde kwaliteitscontrole machines, waarvan de absolute noodzaak is het best waargenomen wanneer het storingen. Ziektes zoals ALS, de ziekte van Alzheimer, Parkinson, en bepaalde vormen van Cystic Fibrosis hebben een directe link naar het vouwen van eiwitten kwaliteitscontrole componenten ^2, en dus de toekomstige therapeutische ontwikkeling vraagt ​​om een fundamenteel inzicht in de onderliggende processen. Onze experimentele uitdaging is om te begrijpen hoe cellen schade signalen te integreren en monteer de reacties die zijn afgestemd op uiteenlopende omstandigheden.

De voornaamste reden waarom eiwit misfolding is een existentiële threin de cel is de neiging van verkeerd gevouwen eiwitten te aggregeren, waardoor een globale verstoring van de druk en delicate intracellulaire vouwen milieu ^1. De vouwen gezondheid, of "proteostasis," van de cellulaire proteoom wordt gehandhaafd, zelfs onder de dwang van veroudering, stress en oxidatieve schade, door de gecoördineerde actie van de verschillende mechanistische eenheden in een uitgebreid kwaliteitscontrolesysteem ^3,4. Een gespecialiseerde machines van moleculaire chaperonnes kunnen niet-inheemse polypeptiden binden en het bevorderen van hun vouwen in de oorspronkelijke toestand ^1, richten ze voor afbraak door het ubiquitine-proteasoom-systeem ⁵ of ze doorverwijzen naar beschermende aggregatie insluitsels ^6-9.

In eukaryoten wordt de cytosolische aggregatie kwaliteitscontrole belasting verdeeld tussen twee compartimenten ^8-10: de juxtanuclear kwaliteitscontrole compartiment (JUNQ) en het onoplosbare eiwit borg (IPOD) (Figuur 1 - model).Eiwitten die geübiquitineerde de eiwitvouwing kwaliteitscontrole machines worden geleverd aan de JUNQ, waar ze worden verwerkt voor afbraak door het proteasoom. Verkeerd gevouwen eiwitten die niet worden geübiquitineerde worden doorgeschakeld naar de IPOD, waar ze actief zijn samengevoegd in een beschermende compartiment.

Tot op dit punt, is de methodologische paradigma van live-cell fluorescentie microscopie grotendeels te labelen eiwitten en volgen hun locaties in de cel op specifieke tijdstippen en meestal in twee dimensies. Als nieuwe technologieën zijn begonnen met het verlenen onderzoekers ongekende toegang tot de submicron schaal in levende cellen, is de dynamische architectuur van het cytosol in zicht komen als een uitdagende nieuwe grens voor experimentele karakterisering. We een methode voor het snel monitoren van de 3D ruimtelijke verdelingen van meerdere fluorescent gemerkte eiwitten in de gist cytosol tijd. 3D Timelapse (4D imaging) is niet alleen een technische uitdaging; rathaar vergemakkelijkt ook een dramatische verandering van het begrippensysteem gebruikt om cellulaire structuur te analyseren.

We maken gebruik van een cytosolisch vouwen sensor eiwit in levende gist om verschillende lot voor verkeerd gevouwen eiwitten te visualiseren in cellulaire aggregatie kwaliteitscontrole, met behulp van snelle 4D fluorescerende beeldvorming. De temperatuur gevoelige mutant van het eiwit Ubc9 ^10-12 (Ubc9 ^ts) is zeer effectief zowel als sensor van cellulaire proteostasis en een fysiologisch model voor het volgen aggregatie kwaliteitscontrole. Zoals met de meeste ts eiwitten, Ubc9 ^ts is volledig gevouwen en functioneel tolerante temperaturen als gevolg van actieve cellulaire chaperones. Boven 30 ° C, of wanneer de cel misfolding stress, Ubc9 ^ts misfolds gericht en volgt het lot van een natief globulair eiwit dat verkeerd gevouwen door mutatie, hitte-denaturatie of oxidatieve schade. Door smelten aan GFP of andere fluoroforen, kan worden gevolgd in 3D vormt Stress Foci, of dirigeerd naar JUNQ of IPOD.

Protocol

1. Gist Voorbereidingen

1. Transformeer giststammen met een plasmide dat een GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ^ts) cassette.
2. Gist groeit in synthetisch medium dat 2% raffinose gedurende 24 uur en opnieuw verdund tot 2% galactose bevattend medium gedurende 16 uur of O / N. Incubeer cellen bij 30 ° C onder schudden bij 200 rpm.
3. De volgende ochtend Verdun de query spanning om OD ₆₀₀ = 0,2. Schud gedurende 4-6 uur bij 30 ° C (200 rpm) tot de cultuur in _OD600 = 0.8 tot 1,0.
4. Om expressie (zodat alleen de reeds vertaald en gevouwen pool van GFP-Ubc9 ^ts controleren), veranderingsmedia synthetische medium aangevuld met 2% glucose (SD) 30 min voorafgaand aan beeldvorming onderdrukken.
5. Behandeling - Heat shock de cellen gedurende 20 min bij 37 ° C tot misfolding induceren, of continu in microscoop incubator eiwitaggregatie volgen heat-shock. NB - Als u gebruik maakt van de microscoop bij elke temperatuur boven de RT, pre-warmte for ongeveer 2 uur tot de temperatuur equilibreren langs het lichaam van de microscoop en de doelstellingen (zie hieronder).

2. Plaat \ preparaten,

1. Kies de juiste plaat. De belangrijkste overweging is de mogelijkheid om focus te houden tijdens de beeldvorming acquisitie. De volgende punten zijn van cruciaal belang voor 4D beeldverwerking en niet voor 2D tijd verstrijkt of 3D-beeldvorming.
   1. Multiple-wells plaat onderaan de verschillende putten niet homogeen (dat wil zeggen de putjes zal op verschillende hoogten ten opzichte van het doel). Dit maakt het moeilijk in focus te houden xy punten en tijdstippen, ongeacht de scherpsteltijd techniek wordt gebruikt.
   2. Schuif materiaal: glas versus plastic. Glazen bodem dia's zijn meer z-homogene tussen putten, maar zijn duurder.
   3. Dikte van de bodem van de plaat: we meestal gebruik dekglaasje-bodemplaten index 1,5, maar index 1 is ook aanvaardbaar, afhankelijk van de doelstelling.
2. Cover onderzijde van de plaat \ dia met ConA (0,25 mg / ml) gedurende 10 minuten. ConA wordt gebruikt om cellen hechten op de slede waardoor na een enkele cel in de tijd.
3. Verwijder ConA en incubeer de dia in een chemische kap zodat het overtollige ConA zal verdampen.
4. Plaat 200 pl gist monster (OD ₆₀₀ = 0,5) in de ConAed goed.
5. Incubeer gedurende 15 min, in staat te stellen cellen aan de oppervlakte van de plaat.
6. Pak het medium, en was driemaal met telkens nieuwe medium om een ​​laag van cellen te krijgen. Let op: als een lange time lapse is gepland, het zaad van de cellen dun zodat nieuwe knoppen zullen niet invullen en onderbreken het gebied van belang.

3. Microscoop Voorbereidingen

1. We maken gebruik van een Nikon A1Rsi confocale microscoop met een paar niet-standaard wijzigingen. Voor gist imaging we tot 4 lasers (405 nm, 50 mW CUBE laser; 457-514 nm, 65 mW Argon Ion laser, 561 nm, 50 mW Sapphire laser en 640 nm, 40 mW CUBE laser), en tot 4 PMTs metfilters. De meeste van onze beeldvorming wordt gedaan met een groen filter set voor EGFP en een rood filter set voor mCherry en tdTomato. Met GFP en mCherry er is bijna geen bleedthrough, daarom gebruiken we vaak gelijktijdig scannen. Echter, line-scanning ook worden gebruikt om bleedthrough voorkomen wanneer het voorkomt. De confocale is ook uitgerust met een piëzo PInano fase (MCL), die kan 3 msec stappen z, waardoor 2-3 z-stacks (30-50 secties) per seconde. De systemen heeft een spectrale detector, Perfect Focus (laser offset) en twee scanners - een galvano-scanner en een resonant scanner.
2. Kies de juiste doelstelling. Belangrijkste overwegingen:
   1. Water / Olie / Lucht doel: de belangrijkste overweging is de brekingsindex van het beeldvormende medium vs het medium van het monster.
      1. Olie objectieve voordelen:
         1. Olie doelstellingen kunnen hebben hogere numerieke openingen (olie breekt het licht meer dan water, en dus meer fotonen terug te gaan naar het doel). Olie doelstellingen kan maximaalNA 1,49 in vergelijking met 1,27 voor water. (Dit is echter niet echt een enorm verschil in resolutie).
         2. De brekingsindex van olie overeenkomt met de brekingsindex van glas, dus geen fotonen verloren gaan van het monster, door het glas, het doel. (NB - koos voor een onderdompeling olie die een brekingsindex die geschikt is voor uw doelstelling en uw dekglaasje heeft).
         3. Olie maakt probleemloze lange tijd vervalt omdat het geen verdampen niet.
         Olie Doelstelling nadelen:
         1. De hogere resolutie mogelijk gemaakt door de hogere NA olie doelstellingen snel wordt afgebroken wanneer het licht door heen een waterig medium (zoals een cel).
         2. Beelden hebben meestal meer sferische aberraties en een "uitgestrekt" effect in 3D.
         3. Olie is kleverig, rommelig, en een gevaar voor de doelstellingen.
      2. Water objectieve voordelen
         1. De cel zelf is waterig, waardoor er minder vervormingen in z eennd de resolutie blijft hoog tot diep in een waterig monster.
         2. Reinig en gebruiksvriendelijk. Water objectieve nadelen: verdampt snel, dus niet geschikt voor lange films zonder speciale regelingen gemaakt om continu pompen water aan de doelstelling.
      3. Air objectieve voordelen: 1. Geen materiaal verloren / verdampt tijdens meerdere punt verwerving of een lange film. 2. Reinig en gebruiksvriendelijk. Nadeel: lage resolutie en een lage signaal gevoeligheid.
   2. Kamer en incubator temperatuur: veranderende temperatuur van invloed op materie eigenschappen, en in delicate systemen verandert de focus. De temperatuur moet worden aangepast voordat het kiezen van punten voor acquisitie. Het wijzigen van de temperatuur tijdens het overname zal verstoren beeldvorming en zal resulteren in verlies van focus. We onze microscoop voor 2 uur equilibreren bij de gewenste temperatuur voor imaging.
   3. Correctie halsbanden: Veel doelstellingen worden geleverd met een correctie ring waardoorhet doel aan te passen voor een bepaalde cover-slip dikte. We raden u de correctie kraag tijdens het gebruik van fluorescerende kralen aan de puntspreidingsfunctie visualiseren. Dit zal ervoor zorgen juiste instellingen voor elk monster.
   4. Stabiel monsterhouders: wij vinden dat de meeste in de handel verkrijgbare sample houders zijn het zwakste deel van de microscoop. Ze zijn vaak wiebelig en niet recht. Dit is een ramp voor hoge resolutie, multi-point 4D beeldvorming. Wij ontwerpen onze eigen steekproef houders die zijn recht en past stevig op het podium. Ze kunnen ook worden vastgeschroefd wanneer nodig.
   5. Multi-point overname: onze imaging systeem is uitgerust met de Nikon "Perfect focus" systeem, die in feite een laser-gebaseerde auto-focus mechanisme. Echter autofocus niet noodzakelijkerwijs nodig met 4D beeldverwerking, vooral als het systeem niet veel drijven.

4. Imaging

1. Schakel het systeem: lasers, podium, controller, camera en computer software.
2. Leg de plaat op het podium houder, goed beveiligd en gestabiliseerd.
3. Gebruik eye-poort van de locatie en oriëntatie van gist te bepalen.
4. Met behulp van helderveld, beoordelen cel gezondheid en levensvatbaarheid basis van vorm en textuur.
5. Schakel epifluorescerende licht overeenkomstig de desbetreffende fluorofoor (bijvoorbeeld FITC-filter voor GFP), en zich richten op cellen die het fenotype die onderworpen is aan uw onderzoek. Cellen die sterk fluorescerende zijn in meer dan een golflengte kan leeg en dus autofluorescerende. We visualiseren de kern met een tdTomato fluorofoor gefuseerd met een SV40 NLS-signaal (NLS-TFP). TFP is tweemaal de grootte van GFP, en derhalve boven de grens diffusie van de kern, dus erg goed werkt als een nucleaire marker. We kunnen ook prikkelen TFP met een groen (488 nm) laser tegelijkertijd als GFP, maar het verzamelen van de groene en rode emissie in twee afzonderlijke PMT's voor spectrale resolutie.
6. Pas de volgende instellingen om ruis te minimaliserenen oververzadiging:
   1. Laservermogen - fotobleken en fototoxiciteit versus helderheid van het beeld dient te worden overwogen.
   2. Gain: komt voor bij camera gevoeligheid, waardoor signaal-ruisverhouding.
   3. Pinhole diameter - moeten worden aangepast aan de laser met kortere golflengte. De pinhole diameter bepaalt de dikte (hoogte) van het optische gedeelte afgebeeld. Zo zal het openen van de pinhole verzamelen meer licht (laat meer fotonen in), maar zal resolutie moeten verlagen in z (minder confocality).
7. Nuttige tips:
   1. Als verschillende fluoroforen uitstoten congruent golflengte, gebruik dan de Spectral Detector functie die de keuze van de virtuele filters maakt. Houd in gedachten dat spectrale detectoren zijn minder gevoelig dan gewone PMT's.
   2. Als er verschillende fluoroforen zijn enthousiast over de dezelfde laser, gebruikt u de lijn scanfunctie.
   3. Een Galvano scanner biedt meer gevoeligheid, maar heeft een hoger risico voor fotobleken. Een Resonant scanner maakt sneller eencquisition en verminderen het risico voor fotobleken, maar is minder gevoelig.
   4. Gemiddeld tussen 2 en 16 beelden een sterker signaal-ruisverhouding, maar maakt verkrijgen langzamer en natuurlijk omvat meer blootstelling van het monster aan de laser.
   5. Duur van de overname-afhankelijk van de biologische kwestie (bijv. JUNQ en IPOD vorming duurt ~ 2 uur). We hebben afgebeeld gist met de resonante scanner voor maximaal 30 uur in 3D time-lapse.
   6. Time lapse interval-Kleinere intervallen zal leiden tot een meer samenhangende film, maar kan foto bleken en dus verlies van het signaal veroorzaken.

Resultaten

Figuur 1. Model:. Subcellulaire compartimentering van verkeerd gevouwen eiwitten Kwaliteitscontrole machines stuurt verkeerd gevouwen eiwitten in aparte compartimenten met verschillende functies: oplosbare eiwitten, bedoeld voor degradatie, ondergaan poly-ubiquitinering en worden verzonden naar de Ju XTA-N ucleaire KWALITEIT controle compartiment (JUNQ ). Onoplosbare eiwitten die niet kunnen worden geübiquitineerde worden verzonden voor beschermende sequestratie de I nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), grenzend aan de vacuole, waar ze ondergaan actieve aggregatie.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg "/>
Figuur 2. Modeling eiwit misfolding met GFP-Ubc9 ^ts. Onder normale omstandigheden wordt GFP-Ubc9 ^ts (groen) native gevouwen en diffuus gelokaliseerd in de kern en het cytosol. De kern wordt gelabeld met NLS-TFP (rood). Expressie van Ubc9 ^ts werd afgesloten door toevoeging van 2% glucose voor beeldvorming in alle experimenten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

1. Bij temperatuurverschuiving tot 37 ° C, GFP-Ubc9 ^ts (groen) verkeerd gevouwen en vormt cytosolische Stress Foci. De kern wordt gelabeld met NLS-TFP (rood).
2. Bij herstel van heat shock bij 23 ° C, de thermisch gedenatureerd GFP-Ubc9 ^ts afgebroken, zoals aangegeven door verminderde fluorescentieniveau.
3. Bij temperatuurverschuiving tot 37 ° C en proteasoomremming met 80 Mm MG132, GFP-U BC9 ^ts is verkeerd gevouwen en verwerkt tot JUNQ en IPOD insluitsels. De kern wordt gelabeld met NLS-TFP (rood).
4. Bij temperatuurverschuiving tot 37 ° C en ubiquitinering remming GFP-Ubc9 ^ts is verkeerd gevouwen en verwerkt in de IPOD integratie. De kern wordt gelabeld met NLS-TFP (rood). De ubiquitine Protease 4 (Ubp4) overexpressie wordt gebracht om Ubc9 ^ts ubiquitinering blokkeren.

Figuur 3. Tijdsverloop van JUNQ en IPOD vorming. Bij temperatuurverschuiving tot 37 ° C en proteasoomremming met 80 Mm MG132, GFP-Ubc9 ^ts Stress Foci verwerkt tot JUNQ en IPOD insluitsels. De kern wordt gelabeld met NLS-TFP (rood). 3D-beelden werden verworven tegen 4 min. intervallen. (Zie ook Film 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Discussie

Onze intuïties biochemische processen ontlenen werkblad experimenten waarin een goed gemengde oplossing van reactanten en producten mag evenwicht te bereiken in een bekerglas. In een dergelijke omgeving kan de concentratie van een bepaalde chemische stof worden uitgedrukt als een getal, dat de verhouding van de molaire hoeveelheid moleculen op een macroscopisch volume. Veel van wat we weten over eiwitstructuur en functie ontleent aan met behulp van methoden die de klassieke, bulk reactie afbeelding weer te geven: western blots, centrifugeren, en spectrofotometrische metingen uit op uittreksels uit homogenaten van hele populaties van cellen uitgevoerd.

Aangezien de technologie die we gebruiken om op cellen zien onder vergroting verbetert door sprongen en grenzen, wordt het steeds duidelijker dat de omstandigheden waarin de meeste biochemische reacties plaatsvinden in vivo alleen de geringste gelijkenis met die van de klassieke werkblad scenario dragen. Niet alleen is het inwendige van de cella dicht opeengepakte omgeving, waarin crowding effecten wezenlijke aantasting van de activiteiten van de verschillende reactanten, het is ook precies het tegenovergestelde van goed gemengd. Dit verklaart de vaak afwijken van in vitro en in vivo efficiëntie van diverse complexe macromoleculaire reacties.

Nergens zijn intuïties die voortvloeien uit de klassieke in vitro biochemische experimenten meer geneigd te misleiden zoals in de vragen betrekking hebben op de in vivo vouwen, misvouwing, en aggregatie van eiwitten. Dat studies van de eiwitchemie in bulk reacties kunnen de afgifte van vouwen voor een bepaald eiwit als een eenvoudige ja of nee vraag te behandelen, moet elke poging om de dynamiek van hele bevolking van macromoleculen bijhouden in een levende cel gevoelig voor de gehele verdeling van mogelijke conformationele resultaten beschikbaar om een ​​polypeptide keten, met name om het risico van misvouwing en aggregatie. Zo kunnen we onderzoeken een bulk cel lysate van een aggregatie eiwit door western blotting en bepalen dat het eiwit overwegend onoplosbaar en niet geübiquitineerde. Echter, in de levende cel een discrete subpopulatie van het eiwit, moeilijk te detecteren wanneer het gemiddelde over vele cellen, kan oplosbaar en geübiquitineerde in een bepaald compartiment waar de lokale concentratie van de soort is zeer hoog. Dit laatste geval kan meer belangrijke gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cel dan de grotere bulk subpopulatie. Bovendien dat chaperones tonen een verscheidenheid van pleiotropische gedrag en functies in vitro wordt steeds duidelijker dat in de cel hun discrete functies ruimtelijk en temporeel beperkt.

In de opkomende paradigma voor het begrijpen biochemie, concentratie wordt een variabele in elk specifiek nano-omgeving in de cel en de moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen biologische processen worden onderzocht niet alleen tijd, maar ook in space. De 4D imaging hier gepresenteerde benadering is geschikt voor gevoelige modellering van eiwit misfolding in levende cellen, maar kan worden gebruikt om een ​​aantal andere biologische processen te bestuderen en hoe ze worden gereguleerd ruimte, tijd, en na veranderingen in omgevingscondities. In dit document gebruiken we de Ubc9 ^ts vouwen sensor, die effectief toont de stappen en mogelijkheden om met het begin van eiwitaggregatie in de cytosol. Naast illustreren de celbiologie van aggregatie kwaliteitscontrole kan deze benadering als een krachtig hulpmiddel voor het ontcijferen het effect van specifieke storingen of genetische mutaties op proteostasis (bijvoorbeeld Ubc9 ^ts kan worden gebruikt om eiwitvouwing stress te meten in reactie op oxidatie de expressie van een toxische aggregaat of mutaties in de kwaliteitscontrole pathway).

4D beeldvorming is ook essentieel voor het nauwkeurig bepalen van eiwit lokalisatie of colokalisatie tussen twee verschillende eiwittens, en voor het opsporen van fenomenen die misschien van voorbijgaande aard zijn, maar belangrijk. Bijvoorbeeld, vooral in een kleine bolvormige organisme zoals gist, kan het lijken zo dat een structuur of aggregaat juxtanuclear lokalisatie heeft, terwijl 4D beeldverwerking kan blijken dat dit eenvoudig een artefact van de hoek van inspectie.

In het voorbeeld experiment we hier tonen we het gebruik van een model verkeerd gevouwen eiwit Ubc9 ^ts, aggregatie kwaliteitscontrole in tijd en ruimte in de cytosol volgen. Bij de permissieve temperatuur wordt Ubc9 ^ts gevouwen en verspreid in de kern en cytosol. Bij warmte-geïnduceerde misfolding, vormt het in eerste instantie snel verspreiden kleine aggregaat Stress Foci die worden verwerkt voor proteasomale degradatie. Wanneer het proteasoom gedeeltelijk geremd, worden deze omgezet in Stress Foci JUNQ en IPOD insluitsels in de loop van ongeveer 2 uur. Als ubiquitine-gemedieerde afbraak is niet beschikbaar als een kwaliteitscontrole optie, Ubc9 ^ts wordt onmiddellijk omgeleid naar de IPOD opnemen voor beschermende aggregatie. Deze tools bieden ongelooflijke mogelijkheden om nieuwe genetische factoren betrokken bij de aggregatie kwaliteitscontrole te ontdekken, en om hun ruimtelijke en temporele regelgeving in de cel te verkennen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MG132	Mercury	mbs474790
con A	Sigma	C2010
Glass bottom plates	ibidi	ibd81158
4D Fluorescentief beeldvorming van eiwitaggregatie Confocale 3D-filmpjes werden verkregen met behulp van een Nikon A1R-si microscoop uitgerust met een PInano Piezo-standaard (MCL), met behulp van een 60x waterobjectief NA 1,27, 0,3 microsneden, 0,5% laservermogen (van 65 mW 488 laser en 50 mW 561 laser). z-stacks werden elke 5 min gedurende 90 min verkregen. Elke z-serie werd verkregen met een stapgrootte van 0,5 micrometer en 30 totaal aantal stappen. Beeldverwerking werd uitgevoerd met behulp van NIS-Elements software.