Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit Plasmodium berghei ANKA-geïnfecteerde muizen

Samenvatting

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen bloedvaten Plasmodium berghei ANKA-geïnfecteerde muizen beschreven. De werkwijze maakt kwantificering en fenotypische karakterisatie van leukocyten geïsoleerd na kleuring met fluorescente antilichamen en daaropvolgende analyse door flowcytometrie.

Samenvatting

We beschrijven een werkwijze voor isolatie en karakterisering van hechtende ontstekingscellen uit hersenen bloedvaten P. berghei ANKA-geïnfecteerde muizen. Infectie van gevoelige muizen-stammen met deze parasiet stam resulteert in de inductie van experimentele cerebrale malaria, een neurologisch syndroom dat recapituleert bepaalde belangrijke aspecten van Plasmodium falciparum-gemedieerde ernstige malaria in mensen ^1,2. Rijpe vormen van bloed-stage malaria expressie parasitaire eiwitten op het oppervlak van de geïnfecteerde erythrocyten, waardoor ze binden aan vasculaire endotheelcellen. Dit proces leidt tot verstoppingen in de bloedstroom, wat resulteert in hypoxie en bloedingen ³ en stimuleert ook de werving van inflammatoire leukocyten naar de plaats van parasiet vastlegging.

In tegenstelling tot andere infecties, zoals virussen neutrotopic ^4-6, zowel malaria-geparasiteerde rode bloedcellen (PRBC) en geassocieerde InflammAtory leukocyten blijven afgezonderd binnen de bloedvaten in plaats van te infiltreren in de hersenen parenchym. Dus om contaminatie van afgezonderd leukocyten met niet-inflammatoire circulerende cellen, uitgebreide intracardiale perfusie van geïnfecteerde-muizen voorafgaand aan orgaanextractie en weefsel verwerking wordt verontreinigd is nodig in deze procedure om het bloed compartiment te verwijderen. Na perfusie, zijn hersenen geoogst en ontleed in kleine stukjes. De weefselstructuur wordt verder verstoord door enzymatische behandeling met collagenase en D DNAse I. De resulterende hersenhomogenaat wordt vervolgens gecentrifugeerd op een Percoll-gradiënt die scheiding van hersenen gesekwestreerde leukocyten (BSL) van myeline en andere weefselafval maakt. Geïsoleerde cellen worden vervolgens gewassen, geteld met een hemocytometer en gekleurd met fluorescente antilichamen voor verdere analyse door flowcytometrie.

Deze procedure maakt uitgebreide fenotypische karakterisatie van inflammatoire leukocyten migreren naar de hersenen in rereactie op verschillende stimuli, waaronder beroerte alsook virale of parasitaire infecties. De werkwijze verschaft ook nuttig voor het beoordelen van nieuwe anti-inflammatoire behandelingen in preklinische diermodellen.

Protocol

1. Infectie van muizen met P. berghei-ANKA

1. Ontdooi een portie van gecryopreserveerde P. berghei ANKA PRBC.
2. Juist remmen cerebrale malaria-resistente BALB / c donor muis (8-12 weken oud) met de twee handen beperking techniek. Injecteer muis met 100-200 pi PRBC met een 1 ml insulinespuit (28G naald). Routinematig, 1-2 donormuizen geïnjecteerd.
3. Op de dagen 4 tot 5 na infectie (pi) te verwijderen donor muis van kooi en plaats het op een werkstation of een wegwerp werkende pad.
4. Voorzichtig beperken de muis aan het eind van de staart en het gebruik van een klein schaartje knippen de staartpunt (ongeveer 1 mm). Als alternatief kan een kleine staart punctie met een 25 G naald worden uitgevoerd.
5. Breng een druppel bloed uit de staart van de muis ader aan het einde van een matte-end microscoopglaasje.
6. Plaats een tweede dia (spreader) op een hoek van 45 ° en een back in de bloeddruppel. Zodra het bloed verspreidt zich langs de rand, duw de spreider-slide evelleen de overkant van de microscoop dia om het bloeduitstrijkje maken. Laat het uitstrijkje aan de lucht drogen.
7. Fix bloeduitstrijkjes in 100% methanol gedurende 30 seconden en vervolgens vlek slides in vers bereid Giemsa gedurende 10 min..
8. Spoel bloeduitstrijkje met stromend water gedurende 1 minuut, laat aan de lucht drogen en te onderzoeken schuif onder de microscoop (100x, olie-immersie). Inventariseer PRBC binnen 1.000 erytrocyten en bereken procent parasitemie. Donormuizen moeten bereiken parasitemie niveaus tussen 2,5-5% voordat ze kunnen worden ontlucht voor infectie van proefdieren.
9. Verzamel bloed van de donor muis door retro-orbitale bloeding met een gehepariniseerde micro-hematocriet capillair. Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met de Walter & Eliza Hall Instituut Animal Ethics Committee eisen. Afhankelijk van de lokale Animal Ethische Commissie heeft op andere eisen bloedingen procedures kunnen worden gebruikt. Los benodigde hoeveelheid bloed in RPMI medium bij een uiteindelijke concentratie van 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml. Bedenk dateen gewone muis hematocriet is ~ 6x10 ⁹ rode bloedcellen / 1 ml.
10. Infect experimentele C57BL / 6 muizen (8-12 weken oud) door injectie intraperitoneaal (ip) 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml.
11. Om parasitemie niveaus van geïnfecteerde muizen te controleren volgt u de stappen 1,3-1,8. Parasitemie moet worden bepaald om de 2-3 dagen gestart op dag 2 of 3 pi
12. Ontstaan ​​van ernstige malaria in C57BL / 6 muizen zou kunnen manifesteren als gebogen uiterlijk, troefde bont en lage activiteit. Sommige muizen kan herstellen in dit stadium, maar progressie tot verlies van zelfrichtend reflex geeft onomkeerbare ziekte en dieren worden gedood.

2. Intracardiale Perfusie van Muizen en Brain Extraction

1. Monteer een handmatige zwaartekracht perfusie systeem zorgen voor een 500 ml reservoir een kolom houder aan de top van een 60 cm kolom stand. Verbinding plastic slang aan de onderkant van het reservoir en zet een slangklem op buffer te regelen. Sluit de slang aan een 23 G naald. Fill tot het reservoir met PBS (bewaard bij 22 ° C), open klem en buffer te laten lopen door de slang om alle luchtbellen te verwijderen.
2. Euthanaseren P. berghei ANKA-geïnfecteerde muis door CO ₂ inhalatie. Bevestig de dood door het ontbreken van pedaal, orbitale en respiratoire respons.
3. Pin euthanized muis door de achterpoten en de voorpoten dorsaal op een piepschuim dissectie board in een plastic bakje. Afhankelijk van de lokale Animal Ethische Commissie eisen anesthesie kan worden toegediend voorafgaand aanvang van intracardiale pefusion.
4. Veeg ventrale zijde met 70% ethanol.
5. Gebruik grote schaar en pincet voor de huid te openen langs de middellijn van de borstholte bloot te leggen. Vouw en speld de huid aan de zijkanten.
6. Houd het borstbeen met fijne tang en knip het middenrif en langs beide zijden van het borstbeen doorsnijden van de ribben. Zorg ervoor dat er geen grote bloedvaten beschadigen.
7. Speld de ribbenkast door het borstbeen losjes naast het hoofd.
8. Houd ventrikels with fijne tang en voorzichtig incise rechter atrium met fijne schaar.
9. Plaats 23G naald bevestigd aan de zwaartekracht perfusie systeem in linker ventrikel naar de aorta ascendens, terwijl PBS wordt uitgevoerd. Plaats slechts 0,5 cm van de naaldpunt.
10. Perfuseren muis gedurende 5 minuten of totdat effluent is duidelijk.
11. Losmaken muis en leg hem op zijn buik. Veeg hoofd met 70% ethanol.
12. Met grote schaar, een snede boven het cervicale ruggenmerg gebied.
13. Gebruik fijne schaar om een ​​mediane caudale-rostrale cut te beginnen bij de basis van de schedel en schil de huid weg naar de schedel bloot te leggen.
14. Die het hoofd plaatst de bladen van een kleine schaar in elk orbitale holte en een snede tussen de banen.
15. Maak een longitudinale snede langs de pijlnaad en zorgvuldig verwijderen van de schedel op elke hersenhelft naar buiten.
16. Met behulp van een spatel, til de hersenen en plaats deze in een 10 ml centrifugebuis die RPMI medium.

3. Isolatie van Brain-afgezonderd Leukocyten (BSL)

1. Werken in een veiligheidskast, vers geoogste hersenen plaats op een roestvrijstalen celzeef (40-60 maaswijdte) in een petrischaal met 3-5 ml van RPMI weefselkweekmedium.
2. Snijd hersenweefsel in kleine stukjes.
3. Druk kleine stukjes hersenweefsel door de cel zeef met behulp van een kristal plunjer.
4. Overdracht hersenhomogenaat een 10 ml en centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
5. Los pellet in 3 ml RPMI-medium, dat 0,05% Collagenase D en 2U/ml DNAse I.
6. Draai mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Verwijder de celresten door op het mengsel door een 70 pm nylon celzeef en / of door incubatie op ijs gedurende 5 minuten.
7. Leg hersenhomogenaat op een 7 ml 30% Percoll kussen en centrifugeer bij 400 xg (zonder rem) gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
8. Hersuspendeer pellet in 1 ml rode bloedcellen lysis buffer en incubeer op ijs gedurende 5 minuten totlyseren hechtende PRBC, die niet konden uit de hersenen worden verwijderd door intracardiale perfusie.
9. Voeg 9 ml van RPMI medium, wassen cellen en centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
10. Resuspendeer BSL-bevattende pellet in 50-100 pi RPMI medium en overdracht cellen aan een Eppendorf buis.
11. Verdun een 5-10 pi aliquot van het celmonster 1:2 in Trypan blauw voor identificatie van levensvatbare cellen.
12. Tellen levensvatbare cellen onder de microscoop met een hemocytometer. Vanaf dag 6 pi verder, toen P. berghei ANKA-geïnfecteerde muizen weer te geven neurologische symptomen, 20.000-100.000 BSLs kan worden hersteld.

4. Immunofenotypering van BSL door meerkleuren flowcytometrie

1. Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, zuig de supernatant en resuspendeer pellet in 50 ul kleuring buffer (PBS, 1% foetaal kalf serum (FCS), 2 mm EDTA).
2. Voeg 1 pl gezuiverd anti-CD16/32 antilichaam (Fcblock).
3. Incubeer cellen gedurende 10 min op ijs.
4. Was de cellen met 1 ml Buffer kleuring. Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en zuig de supernatant.
5. Resuspendeer cellen in 50 ul Buffer Kleuring met vooraf bepaalde optimale verdunningen van gekozen fluorescente antilichamen, anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR en anti-NK1.1.
6. Incubeer gedurende 1 uur op ijs.
7. Was de cellen met 1 ml Buffer kleuring. Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en zuig de supernatant.
8. Resuspendeer cellen in 100 ul PBS.
9. Breng cellen een flowcytometrie plastic buis.
10. Met een flow cytometer, ten minste het 5.000-10.000 events. Geschikte unstained cel controles en fluorochroom vergoeding monsters moeten worden opgenomen, zoals vereist.
11. Analyseer de resultaten met behulp van geschikte flowcytometrie software.

Resultaten

De resultaten in Fig. 2 tonen percentages en absolute aantallen van de verschillende BSL populaties hersteld van hersenen van geperfundeerde of unperfused malaria geïnfecteerde en naïef controle muizen. BSL geïsoleerd werden gekleurd met PE-anti-NK1.1 en APC-anti-TCR-β antilichamen zoals aangegeven in de tekst Protocol. Consistent met eerdere bevindingen ^7-9, αβTCR ⁺ T-cellen bestaat een groot deel van de BSL pool in hersenen van geperfundeerde malaria geïnfecteerde muizen (dag 6 pi). Deze populati...

Discussie

De isolatie en analyse van BSL is een methode die karakterisering en kwantificering van inflammatoire cellen migreren naar de hersenen in reactie op weefselbeschadiging of infectie in experimentele muismodellen maakt. De invoering van een intracardiale perfusie stap voor het verwijderen van het bloedcompartiment voor orgaanextractie en latere celisolatie is nuttig om contaminatie van inflammatoire cellen met niet-inflammatoire circulerende leukocyten voorkomen. Dit is misschien niet een essentiële vereiste in neurotrope...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
			Oplossingen en buffers
Giemsa's azur eosine methyleenblauw-oplossing	Merck Millipore	1.09204.0500	1:10 verdunning in gedestilleerd water
RPMI medium			Muis tonus
Muis tonus PBS			20 mM natriumfosfaat, 0,149 NaCl, pH 7,3
0,4% Trypan Blue	Sigma Aldrich	T-8154	1:2 verdunning
Collagenase D	Worthington Biochemical
Deoxyribonuclease (DNAse) I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	Van runderpancreas
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	30% oplossing in PBS
Ultrapuur Tris	Invitrogen	15505-020
Ammonium Chloride (NH4Cl)	AnalaR	10017
Red Cell Lysis Buffer			17 mM Tris, 14 nm NH 4 Cl, pH 7,2
FCS	Gibco	1009
EDTA dinatriumzout	Merck	10093.5V	0,1 M, pH 7,2
			Antilichamen en conjugaten
Anti-muis CD16/CD32 (Fc Block), kloon 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 ul in 50 ul buffer kleuring (0.5mg/50 ml)
FITC-anti-muis CD4, kloon H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-anti-muis NK1.1, kloon PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-anti-muis CD8, kloon 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-anti-muis TCR-β, kloon H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-anti-muis CXCR3, clone 220803	R & D Systems	FAB1685P
Gebiotinyleerd-anti-muis CCR5, kloon C34-3448	BD Pharmingen	559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Apparatuur en materiaal
SuperFrost microscoopglaasje	Lomb Menzel-Glaser
Dissection tang, schaar	REDA Instrumente
500 ml PBS reservoir	Nalgene
Rubber slangen
23G naald	BD PrecisionGlide	302008
Cell dissociatie kit met metalen zeef	Sigma Aldrich	CD-1
70 pm nylon celzeef	BD Falcon	352350
Hemocytometer	GmbH Neubauer	717810
Flowcytometrie buizen	BD Falcon	352008