Methodenartikel

Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

DOI:

10.3791/50136

⸱

29 mei 2013

 ,  ,  , 
1Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Medical Neurobiology, The Hebrew University of Jerusalem

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporatie van het kuiken embryonale neurale buis heeft vele voordelen zoals het snel en efficiënt voor de expressie van vreemde genen in neuronale cellen. In dit manuscript bieden we een methode die uniek laat zien hoe DNA electroporate in de aviaire hindbrain op E2.75 om specifiek label een subset van neuronale voorlopercellen, en hoe ze hun axonale projecties en synaptische doelen volgen op veel geavanceerde stadia van ontwikkeling, tot E14.5. We hebben gebruik gemaakt van nieuwe genetische tools, waaronder specifieke enhancer elementen, Cre / Lox - gebaseerde plasmiden en de piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem om GFP expressie rijden in een subtype van hindbrain cellen (de dorsale grootste subgroep van interneuronen, DA1). Axonale trajecten en doelstellingen van DA1 axonen worden gevolgd bij vroege en late embryonale stadia bij verschillende hersenstam regio. Deze strategie draagt ​​geavanceerde technieken voor targeting cellen van belang in de embryonale achterhersenen en voor tracing vorming circuit op verschillende stadia van ontwikkeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hindbrain vertegenwoordigt een belangrijke relais knooppunt van het zenuwstelsel door te communiceren tussen de centrale en perifere zenuwstelsel via stijgende en dalende neuronale netwerken. Het regelt basisfuncties zoals ademhaling, bewustzijn, gehoor, en motorische coördinatie 1-3. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, wordt de gewervelde hindbrain tijdelijk opgedeeld langs de anterior-posterior (AP) as in repetitieve rhombomeres, waarin verschillende neuronale celtypes worden gevormd en het genereren van meerdere hersenstamkernen centra 4. De hindbrain is ook verdeeld langs de dorsale-ventrale (DV)-as in een basale en alar plaat, waarbij discrete neuronale voorlopercellen worden gespecificeerd en differentiëren in verschillende DV locaties 3,5,6. Hoe de vroege AP en DV-specifieke neuronale patronen zijn voor de instelling van functionele hersenstam circuitries is grotendeels onbekend.

Om kennis te verwerven over deze fundamentelebetrokken zijn gereedschap nodig om specifieke subsets van neuronen in de vroege achterhersenen label en hun axonale trajecten en connectiviteit sporen op meer gevorderde stadia. We hebben eerder gebruikte specifieke enhancer elementen, en een Cre / loxP based voorwaardelijke expressie systeem om axonale wijze dorsale spinale interneuronen in de vroege kippenembryo 7-9. In het huidige manuscript hebben we de hindbrain gerichte en een upgrade van de experimentele paradigma voor de etikettering late embryonale hindbrain interneuronen, axonen en hun synaptische doelstellingen, met behulp van een gemodificeerde elektroporatie strategie en de piggyBac - gemedieerde DNA-omzetting. Onze nieuwe strategie maakt het labelen van verschillende neuronale subtypes in een kant van de achterhersenen en de positie van hun axonale uitsteeksels en synaptische plaatsen in verschillende embryonale stadia, van 2 tot 12 dagen na elektroporatie. Op basis van deze methode, we bestempeld als de dorsale-grootste subgroep van hindbrain interneuronen (dA1/Atoh1 + cellen) en onthulde twee contralaterale opgaande axonale projectie patronen, elk afkomstig uit een andere AP locatie en verlengt in een aparte funiculus. DA1 axonen bleken project en nieuwe synapsen vormen in de auditieve kernen, middenhersenen en in meerdere lagen van de kleine hersenen 10.

De combinatie van kuiken elektroporatie, genetische traceren van neuronen en analyse van projectie gebieden op veel geavanceerde stadia van ontwikkeling vormt een uniek platform om de vorming van neuronale netwerken in de hersenen te bestuderen en moleculaire mechanismen die de vorming circuit regelen helderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hindbrain Elektroporatie

1.1 Ei behandeling

  1. Plaats de eieren horizontaal in een bevochtigde incubator (37-38,5 ° C). Embryo's worden geëlektroporeerd na 65-70 uur incubatie, toen zij 16-17 (HH) fase (25-30 somieten) te bereiken.
  2. Verwijder de eieren uit de broedmachine, ze in de horizontale stand.

1.2 Voorbereidingen

  1. Trek de glazen capillairen (0,5 mm diameter).
  2. Sluit gebogen L-vormige gold Genetrodes elektroden (3 mm diameter) met een adapter houder de pulsgenerator. Elektroporatie parameters omvatten 25 volt, 5 puls nummers, 45 msec puls lengte, 300 msec puls intervallen.
  3. Bereid een mond pipet, 10 ml injectienaald, parafilm strips, een zachte borstel, scherpe dissectie schaar en 25 ml steriele PBS-oplossing. Deze hoeveelheid is gewoonlijk voldoende om een ​​eiertray (18 eieren) te behandelen.
  4. Bereid voldoende mengsel van DNA-plasmiden (5 ug / ul elk) envoeg ongeveer 0,025% Fast Green kleurstof om DNA injectie te visualiseren. Meestal een volume van 4 pl voldoende voor het injecteren van een bak.

1.3 Windowing, injectie en elektroporatie

  1. Reinig eierschalen met 70% ethanol.
  2. Overweg met een ei op een moment om embryonale blootstelling te minimaliseren aan de lucht.
  3. Maak een gat in het ei paal met de schaar uiteinden en verwijder 3-4 ml van albumine met de spuit. Verwijder niet een grotere hoeveelheid albumine, omdat het lagere levensvatbaarheid.
  4. Open een kleine ovale venster (2,5 x 2 cm grootte) op het bovenste midden van de eischaal met het ontleden schaar.
  5. Druppel enkele druppels PBS bovenop het embryo tot droog gedurende het gehele proces te voorkomen.
  6. Plaats een kleine hoeveelheid van het DNA mengsel in de glazen capillair met een mondpipet.
  7. Plaats de embryo met zijn achterste uiteinde naar u toe. Geen inkt injectie vereist in dit stadium de embryo duidelijk zichtbaar. Het vermijden inktinspuitingproces toeneemtembryonale overleving. Doordringen in de caudale hindbrain door die de capillaire bij ~ 45 °. Verwijder geen membraan van rond het embryo. Injecteren van DNA-oplossing voorzichtig in de hindbrain lumen en uitademen zonder vorming van luchtbellen. DNA oplossing verspreidt voren.
  8. Onmiddellijk na DNA-injectie, plaatst u de parallelle elektroden precies op het AP en DV hindbrain positie je doel te richten. Duw de elektroden iets ventraal zonder het aanraken van het hart, als het kan levensvatbaarheid verminderen. Pulseren de electroporator. Elektroden worden bedekt met bubbels elektrische geleidbaarheid geven (Figuur 1A).
  9. Verwijder voorzichtig de elektroden en druppelen paar druppels PBS om het embryo te koelen en om luchtbellen te verwijderen. Verzegelen het ei goed openen met een parafilm strip drogen om te voorkomen dat tijdens de incubatie. Wassen elektroden in PBS met de zachte borstel.
  10. Plaats ei in de incubator voor de gewenste tijdsduur. Overleving van embryo's ongeveer 90% 2-3 dagen naelektroporatie, en vermindert tot 50% 12 dagen na elektroporatie.

2. Analyse van embryo's

2.1 Flat-mount voorbereiding en immunofluorescentie

  1. Flat-mount voorbereiding van de achterste hersenen kan worden uitgevoerd tot E6.5 gemakkelijk axonen visualiseren onder een microscoop of een stereo-microscoop.
  2. Ontleden de embryo zorgvuldig door te scheiden van de omliggende vliezen en bloedvaten. Plaats de embryo in een kleine siliconen - gecoate petrischaal met PBS. Bevestig het embryo om de schotel met wolfraam pinnen naar dorsaal. Voer een dorsale spleet in de hindbrain dak-plaat met scherpe glas haarvaten.
  3. Gebruik geen scherpe pincet en micro-schaar houdt het bovenste deel van het hoofd en trek het hindbrain weefsel zeer zorgvuldig uit rostraal van caudale. Na scheiding van de hindbrain nog overblijvende ventrale weefsels in een schone bereiding bereiken.
  4. Incubeer de hindbrain met 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur (RT). Was de hindbrain met PBT (PBS/0.1% Triton X-100) aan PFA verwijderen.
  5. Voor Immunofluorescentie in flat-gemonteerde hindbrains voeg 500 ul van blokkeeroplossing (5% van de geit serum in PBT en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen met 1 st ON antilichaam bij 4 ° C. Was met PBT (15 min x 3). Incubate met 2 nd antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. wassen met PBT (15 min x 3).
  6. Plaats de hindbrain geconfronteerd dorsally op een glasplaatje. Voeg fluorescerende montage media op de achterste hersenen. Gebruik glazen capillairen of wolfraam naalden om de hindbrain op de dia plat.
  7. Voeg wat vet op elke hoek te voorkomen knijpen van het weefsel door het dekglas. Plaats voorzichtig een dekglas op de top van de hindbrain en luchtbellen te voorkomen. Voor de naleving toe te voegen nagellak aan glaskanten dekken.

2.2 Cryo-secties en Immunofluorescentie

  1. Cryo-delen van de hersenstam can worden uitgevoerd in elk stadium om axonale trajecten visualiseren. Toch, na E6.5 moet dit de aangewezen methode vanwege de moeilijkheid om axonen visualiseren in de flat-gemonteerde embryo, die te dik zijn. Bovendien demonstratie van synapsen vereist snijden van het weefsel en een hoge vergrotingsfactor zicht onder een microscoop.
  2. Ontleden het embryo en verwijder alle omliggende weefsels. Spoelen met PBS. Snijd het embryo in het caudale deel van de medulla met behulp van micro-schaar en scherpe pincet. Maak een brede incisie tussen de kleine hersenen en de middenhersenen en verwijder de hele hersenstam. Het weefsel moet de medulla, pons en cerebellum bevatten.
  3. Bevestig de hersenstam in 4% PFA nacht (ON) bij 4 ° C, spoelen met PBS (10 min x 3) en incubeer bij 30% saccharose ON bij 4 ° C tot zinken.
  4. Integreer de hindbrain in een cryo-mal met oktober (Optimal Cutting Temperature) verbinding, en plaats deze bij -20 ° C tot bevriezing, zoals elders 11 beschreven.
  5. Plaats het oktober blok in de cryostaat op de gewenste sectionele as. Breedte sectie is 12 micrometer.
  6. Droog de glaasjes. Voeg 100 gl blokkerende oplossing per glaasje 2 uur bij kamertemperatuur. Voeg 100 ul van antilichamen (verdund in de blockingbuffer de gewenste concentratie). Incubatietijd van 1 e en 2 e antistoffen AAN is bij 4 ° C of 2 uur bij KT, respectievelijk. Voor elke incubatietijd, voeg voorzichtig parafilm strip boven de dia voorkomen droogheid. Wassen met PBS (10 min x 3) tussen antistoffen. Indien nodig, voeg 1:1000 Dapi (4'-6-diamidino-2-fenylindool), verdund in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoelen met PBS.
  7. Monteer de dia met fluorescerende montage media. Even laten drogen gedurende 1 uur vóór de analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd onlangs gebruikt om de axonale patronen en projectie plaatsen van DA1 subgroep van interneuronen te ontdekken in het kuiken hindbrain 10. Specifiek worden deze met axons werd een enhancer element (Atoh1), dat eerder werd gekarakteriseerd als specifiek voor spinale neuronen DI1 8,12,13, bevestigd worden uitgedrukt in hindbrain DA1 cellen 10. Het element werd stroomopwaarts gekloond om Cre recombinase en co-geëlektroporeerd bij E2.75 samen met een Cre-afhankelijke cytopla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In ovo elektroporatie is een haalbaar, betrouwbaar en doeltreffend instrument om celspecificatie en axonale begeleiding te onderzoeken tijdens chick ontwikkeling van het zenuwstelsel 20. In dit protocol beschrijven we een wijze van elektroporatie in het kuiken hindbrain op E2.75 met enhancer elementen die de voorwaardelijke etikettering van specifieke interneuronen mogelijk. Deze strategie wordt gecombineerd met de piggyBac gemedieerde omzetting systeem om vreemde genen in te voegen in het kuiken gen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken dr. Yuval Gottlieb-Dror voor de elektroporatie afbeelding. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan DSD van Het Rijksinstituut voor Psychobiologie in Israël en van de Niedersachsen-Israël Onderzoek samenwerkingsprogramma en door subsidies te AK van The Israel Science Foundation, The Israel ministerie van volksgezondheid, en The Center of Excellence-Legacy Heritage Biomedische Wetenschappen partnerschap.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
L-vormige gouden Genetrodes 3 mm elektrodenBTX, Harvard Apparatus45-0162
pulsgenerator, ECM 830BTX, Harvard Apparatus45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) CompoundTissue-Tek Sakura4583 O.C.T. Compound
NagellakVan elke commerciële leverancier

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
  2. Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
  3. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
  4. Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
  5. Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
  6. Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
  7. Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
  8. Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21(2009).
  9. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792(2010).
  10. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
  11. Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
  14. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141(2009).
  15. Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
  16. Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
  17. Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
  18. Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
  19. Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
  20. Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
  21. Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
  22. Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
  23. Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA injectiefluorescentiemicroscopiecryosectieflatmount preparatiePiggyBac transposon

Gerelateerde artikelen