Ex Vivo Red Blood Cell Hemolyse Assay voor de beoordeling van de pH-responsieve Endosomolytic Agenten voor Cytosolic Levering van Biomacromoleculaire Drugs

Samenvatting

Een hemolyse assay kan worden gebruikt als een snelle, high-throughput screen van drug delivery systems 'cytocompatibility en endosomolytic activiteit intracellulaire lading levering. De test meet de verstoring van de erythrocyten membranen als functie van pH milieu.

Samenvatting

Fosfolipide dat endo-lysosomale blaasjes vormen kunnen vormen een belemmering voor de levering van biologische geneesmiddelen voor intracellulaire targets. Om deze barrière te overwinnen zijn een aantal synthetische drug carriers geconstrueerd om actieve verstoring het endosomale membraan en lading af te leveren in het cytoplasma. Hier beschrijven we de hemolyse assay die kan worden gebruikt als snelle, high-throughput screen voor cytocompatibility en endosomolytic activiteit van intracellulaire drug delivery systemen.

In de hemolyse assay worden menselijke rode bloedcellen en testmateriaal geco-incubeerd in buffers bij pH gedefinieerd dat extracellulaire, vroege endosomale en late endo-lysosomale omgeving nabootsen. Na centrifugatie stap pellet intacte rode bloedcellen, wordt de hoeveelheid hemoglobine in het medium afgegeven spectrofotometrisch gemeten (405 nm voor de beste dynamisch bereik). Het percentage rode bloedcellen verstoord wordt dan ten opzichte van de positieve controle samp gekwantificeerdles gelyseerd met een reinigingsmiddel. In dit modelsysteem de erytrocytenmembraan dient als een surrogaat voor het lipidebilaagmembraan die endo-lysosomale vesicles omsluiten. Het gewenste resultaat is verwaarloosbaar hemolyse bij fysiologische pH (7,4) en robuust hemolyse in het endo-lysosomale pH-traject van ongeveer pH 5-6,8.

Inleiding

Hoewel er vele mogelijke high-impact therapeutische targets in de cel, de intracellulaire afgifte van middelen vormt een grote uitdaging. Vaak worden drugs, vooral biologische, geïnternaliseerd door cellen en verhandeld in blaasjes die ofwel leiden tot afbraak van de inhoud door de endo-lysosomale route, of back brachten de cel via exocytose. ¹ In de laatste werkwijze, de interne pH van de vesicles wordt aangezuurd tot ongeveer 5-6, met de optimale pH voor activiteit van enzymen die functioneren in dit compartiment, zoals lysozym. ^twee

Recent zijn een aantal materialen zijn speciaal ontworpen om gebruik te maken van de verzuring van endosomen te vergemakkelijken cytosolische levering van hun lading. Een voorbeeld van deze benadering maakt gebruik van synthetische polymeer micel nanodeeltjes die kern zwitterionische en lastenneutraal bij fysiologische pH (bijv. 7,4). Echter bij pH 6,0- 6.5, de polymeren worden geprotoneerd en zich een netto positieve lading die de micel kern destabiliseert en de blootgestelde polymeersegmenten interactie met en verstoren de endosomale membraan. Deze activiteit is aangetoond dat het endosomale ontsnappen van peptide en nucleïnezuur gebaseerde geneesmiddelen bevorderen, waardoor zij hun targets cytosolische openen. ^3,4 Andere voorbeelden van ontwikkelde methoden endosomale escape dat het membraan barrière verstoren bemiddelen omvatten "fusogenische" peptiden of eiwitten die membraanfusie of transient poriënvorming kunnen bemiddelen in de fosfolipide dubbellaag. ⁵ Homopolymeren van anionogene alkyl acrylzuren zoals poly (propylacrylic zuur) een goed bestudeerde benadering en in deze polymeren, de protonering staat hanger carbonzuur dicteert overgang in een hydrofoob, membraan-ontwrichtende staat in endo-lysosomale pH-bereiken. ^6,7

Een bruikbaar model systeem voor het screenen van endosomolytic gedrag is het ex vivo pH-afhankelijke hemolyse assay. ⁸ In dit modelsysteem de erytrocytenmembraan dient als een surrogaat voor het lipidebilaagmembraan die endo-lysosomale vesicles omsluiten. Dit model generaliseerbaar is door anderen om endosomolytic gedrag van cellen binnendringen peptiden en andere polymere genafgiftesystemen evalueren. ^8-11 In dit experiment menselijke rode bloedcellen en testmaterialen worden geco-incubeerd in buffers bij pH gedefinieerd dat nabootsen extracellulaire (7,4), vroege endosomale (6,8), en laat endo-lysosomale (<6,8) omgevingen. De hoeveelheid hemoglobine vrijkomt tijdens de incubatieperiode wordt gekwantificeerd als een maat van rode bloedcellen lysis, die is genormaliseerd naar de hoeveelheid hemoglobine model in positieve controlemonsters gelyseerd met een reinigingsmiddel.

Van het screenen van een kleine bibliotheek van potentieel endosomolytic testmateriaal, kan men afleiden dat de monsters die geen hemolyse produceren bij pH 7,4, maar significant verhoogd zoomolysis bij pH <6,5, zal de meest effectieve en cytocompatible kandidaten voor cytosolische drug delivery. Materialen die deze criteria past worden naar verwachting inert en niet zonder lipide dubbellaag membranen (bijv. waardoor cytotoxiciteit) vernietigen tot blootstelling aan een daling in de lokale pH na internalisatie in endo-lysosomale compartimenten.

In dit protocol worden erythrocyten geïsoleerd uit een menselijke donor en co-geïncubeerd bij pH 5,6, 6,2, 6,8 of 7,4 experimentele endosomolytic drug delivery agents. Intact erytrocyten worden gepelleteerd en de supernatanten (met hemoglobine bezit van gelyseerde erytrocyten) geanalyseerd voor de karakteristieke absorptie van hemoglobine via een plaatlezer (figuur 1).

Protocol

1. Voorbereiding en Sterilisatie van Buffers en Test Agenten

1. 150 mM NaCl buffer: Los 4,383 g NaCl kristallen in 500 ml water nanopure.
2. pH Buffers: voorbereiden fosfaat buffers bij pH 5,6, 6,2, 6,8 en 7,4 door het mengen van geschikte hoeveelheden monobasisch en dibasisch natriumfosfaat. Indien monsters worden getest bij lagere pH waarden (bijvoorbeeld pH <5,6) dan een geschikte buffer, zoals citraat buffer, worden gebruikt. Buffer recepten zijn direct beschikbaar, en een voorbeeld verzoek is hier voorzien. ¹²
3. Steriliseer alle buffers zoals hierboven vermeld door middel van een fles-top vacuümfiltratie apparaten en re-check buffer pH's.
4. 20% Triton X-100 (positieve controle): Mix 20 ml pure Triton X-100 in 80 ml water nanopure. Vortex krachtig en ultrasone trillingen op te lossen. 'S nachts niet op kamertemperatuur voor gebruik.

2. Bereiding van Erythrocyten

1. Verkrijgen van 25 ml bloed frOM een anonieme menselijke donor direct gezogen K _{2-EDTA-gecoate} Vacutainer buizen coagulatie te voorkomen.

OPMERKING: Alle procedures moeten vooraf worden goedgekeurd door de bevoegde Institutional Review Board (IRB), en venapunctie en bloedafname moet worden uitgevoerd door een getrainde phlebotomist om het risico te minimaliseren voor de donor. Standaard aderlaten procedures zijn elders gepubliceerd ^13.

2. Centrifugeer bloed bij 500 xg gedurende 5 min, en Mark niveaus van hematocriet (rood, onderlaag) en plasma (geelachtig, bovenlaag) op de buis.
3. Zuig plasma via een micropipettor, toe te voegen in bleekwater, en dient het naar biologisch gevaarlijk afval.
4. Vul hematocriet buis gemarkeerde lijn (oorspronkelijke niveau van plasma) met 150 mM NaCl-oplossing. Cap en zwenken om voorzichtig te mengen. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten.
5. Herhaal stap 2,3-2.4 om opnieuw te wassen bloedcellen. Dan zuigen supernatant en vervangen door PBS bij pH 7,4. Omkeren om te mengen.
6. Split bloed gelijkmatig in vier buizen, die overeenkomen met elke pH-waarde die zal worden getest. Label de buizen volgens elk te testen pH (5,6, 6,2, 6,8, 7,4).
7. Centrifugeer bloedbuisjes bij 500 xg gedurende 5 minuten. Markeer niveaus op buizen, dan aspireren supernatant.
8. Vul elke buis voorzien overeenkomstig buffer van geschikte pH (zoals aangegeven in 2.6).
9. Label vier 50 ml conische buizen (een per pH test) en pipet 49 ml van PBS van geschikte pH in elke conische buis.
10. Voeg 1 ml van erytrocyten (zelfde pH) in corresponderende buis voor een 1:50 verdunning. Inspecteer de verdunde bloed, dat moet worden troebel en zal vestigen als ongemoeid gelaten. Als er geen pellet vormen, zijn de cellen gelyseerd.

3. Lysis Assay plaat met 96 putjes Setup en kwantificering

1. Bereid voorraadoplossingen van alle experimentele drug delivery middelen, bij 20x de gewenste eindconcentratie te testen (Assayzal 10 pl drug delivery agent + 190 pl verdund rode bloedcellen, wat leidt tot een 1/20 verdunning van de originele drug delivery agent in de uiteindelijke testmengsel). Voorraden van 20, 100 en 800 pg / ml worden voorgesteld, resulteert in eindtest concentraties van 1, 5 en 40 ug / ml.
2. Pipetteer 10 ul van elke voorraadoplossing in V-bodem 96-well platen. Voor een optimaal resultaat te laden elk monster in drievoudige of viervoudige.

OPMERKING: Voor het gemak, wordt aanbevolen dat een aparte plaat met 96 putjes worden bereid voor elke pH te testen, met elk monster (bij elke concentratie) die op n = 3-4 per plaat.

3. Voor positieve controles, voeg 10 ul van 20% Triton X-100.
4. Voor negatieve controle putjes, voeg 10 ul fosfaatbuffer. Gebruik buffer bij dezelfde pH te testen.
5. Pipetteer 190 ul van verdunde erytrocyten (zie 2.10) aan elk putje, zorg ervoor dat cel-stockoplossing blijfthomogene tijdens de overdracht. Hint: Gebruik multi-channel pipet om deze taak te vereenvoudigen.
6. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende een uur (Optioneel: Gebruik een schudapparaat of rocker).
7. Centrifugeer platen gedurende 5 minuten bij 500 xg om pellet intact erytrocyten. Opmerking: wanneer u de plaat uit de centrifuge en de afvoer ervan naar de volgende stap, voorzichtig en zeker niet aan de celpellet verstoren.
8. Met een multichannel pipet, breng 100 ui supernatant uit elk putje naar een heldere, platte bodem 96-well plaat. Opmerking: als de cel pellet per ongeluk wordt verstoord in een monster (s), kan men opnieuw centrifugeer de plaat en ga vervolgens verder met supernatant overdracht.
9. Meet de absorptie van supernatanten met een plaat lezer. Merk op dat een reeks van golflengten kunnen worden gebruikt (400-541 nm).

OPMERKING: Verschillende plaat lezers kunnen verschillende congestie en gevoeligheden hebben, dus de keuze van een golflengte voor mijasurements afhankelijk of hemolyse resultaten van experimentele monsters betrouwbaar kan worden genormaliseerd tegen maximum hemolyse zoals geïnduceerd door detergens behandeling. Dit vereist een nauwkeurige meting van de absorptiewaarden van de positieve controle monsters.

10. Microsoft Excel of soortgelijke gegevens analyse software, vindt het gemiddelde van de achtergrond absorptiemetingen van de negatieve controle monsters voor elke pH (stap 3,4) ingesteld. Trek deze achtergrond extinctie van alle andere monsters die werden gemeten bij die pH.
11. Na achtergrond aftrek, u de gemiddelde absorptie van de positieve controle detergens-behandelde monsters (stap 3.3). Dan normaliseren alle experimentele datapunten met deze gemiddelde absorptiewaarde, die moet 100% hemolyse te vertegenwoordigen. Tenslotte vermenigvuldigt elk putje waarde met 100%% hemolyse die zich in elk goed ten opzichte van het wasmiddel control berekenen.

Resultaten

Typisch het ideale middelen die pH-afhankelijk gedrag vertonen hemolytische hebben het grootste potentieel voor cytosolische toediening van geneesmiddelen, nucleïnezuren en andere biologisch actieve moleculen. Dit wordt geïllustreerd door Agent 1 als afgebeeld in figuur 2, die minimale hemolyse vertoont bij pH 7,4, maar een sterke toename van hemolytische gedrag endosomale pH bereik (<6,5). Sommige middelen kunnen vertonen aanzienlijke mate hemolytische gedrag bij fysiologische pH bereik (Agent...

Discussie

pH-gevoelige polymeren of andere middelen geschikt voor endosomolytic functie kan snel en effectief gescreend op basis van lysis van rode bloedcellen bij een pH aangetroffen in de endosoom (Figuur 1; pH 6,8 - vroege endosoom, pH 6,2 - late endosoom, pH 5,6 - lysosoom). ^14-17 pH-afhankelijke hemolyse werd gebruikt om het vermogen van vervoerders endosomale afgifte Biomacromoleculaire geneesmiddelen (bijv. peptiden, siRNA, ODNs, eiwitten) bemiddelen scherm en resultaten van deze assay ...

Materialen

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer buizen	Fisher Scientific	22-253-145	Voor bloedafname
BD Vacutainer bloedafname Naalden, 20.5-gauge	Fisher Scientific	02-665-31	Voor bloedafname
BD Vacutainer Tube Holder / Naald Adapter	Fisher Scientific	22-289-953	Voor bloedafname
BD Merk Isopropyl Alcohol Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	Voor bloedafname
BD Vacutainer Latexvrij Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Voor bloedafname
Zoutzuur (geconcentreerd)	Fisher Scientific	A144-500	Voor regeling van de pH van D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Positieve controle
Dulbecco's PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 Steriel Disposable Bottle-Top Filter Unit met SFCA Membraan	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-well platen, vlakke bodem, weefselkweek behandeld polystyreen	Fisher Scientific	08-772-2C	Voor plaat-lezing eind van de test.
BD 96-well platen met ronde bodem, weefselkweek behandelde polystyreen	Fisher Scientific	08-772-17	Voor incubatie van rode bloedcellen met experimentele middelen.