Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

Samenvatting

Er is een toenemende belangstelling voor het begrijpen van de immunologische functies van specifieke subpopulaties van cellen in platen van Peyer (PP), de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel. Hier schetsen we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring.

Samenvatting

Plaques van Peyer (PP) zijn integrale componenten van het darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT) en spelen een centrale rol in de darm immunosurveillance en homeostase. Particulate antigenen en microben in het darmlumen worden continu bemonsterd door PP M cellen in de follikel-geassocieerde epitheel (FAE) en naar een onderliggende netwerk van dendritische cellen (DCs), macrofagen en lymfocyten. In dit artikel beschrijven we protocollen die zijn murine PP (i) gedissocieerd in enkele celsuspensies en onderworpen aan flowcytometrie en (ii) bereid voor cryosectioning en immunokleuring. Voor flowcytometrie, PPs mechanisch gedissocieerd en daarna gefiltreerd door membranen 70 urn tot enkele celsuspensies zonder epitheelcellen en grof vuil genereren. Beginnen met 20-25 PP (van vier muizen), deze snelle en reproduceerbare methode levert een populatie van> 2,5 x 10 ⁶ cellen met> 90% levensvatbaarheid van de cellen. Voor cryosectioning, versely geïsoleerde PP worden ondergedompeld in Optimale Cutting Temperatuur (LGO) medium, snap-ingevroren in vloeibare stikstof, en dan coupes met behulp van een cryomicrotoom. Weefselcoupes (5-12 um) de lucht gedroogd, gefixeerd met aceton of methanol, en vervolgens onderworpen aan immunokleuring.

Inleiding

Peyer's Patches (PP) zijn macroscopische aggregaten georganiseerde lymfoïde follikels aanwezig in de dunne darm van mensen en muizen (figuur 1) en het primaire plaatsen waar mucosale immuunresponsen ingeleid dieet antigenen, commensale bacteriën, pathogene micro-organismen en orale vaccins ^1-4. In tegenstelling tot andere perifere lymfoïde weefsels zoals de mesenteriale lymfeklieren, PPs missen afferente lymfevaten. Als zodanig adaptieve immuunreacties in PP worden aangedreven in reactie op antigenen uit het darmkanaal. De bemonstering van luminale antigenen wordt uitgevoerd door het de follikel-geassocieerde epitheel (FAE), die bestaat uit zowel enterocyten en antigen-sampling cellen bekend als M cellen. Onder de FAE, in de sub-epitheliale dome (SED) gebied, ligt een netwerk van dendritische cellen (DCs) vermengd met macrofagen, B-cellen en CD4 ⁺ T-cellen ^5-9. Aan de basis van elk PP lymfoïde follicle zijn folliculaire dendritische cellen (FDC) en een B cel-rijk centrale kiemcentrum, geflankeerd door T cellenrijke interfolliculaire zones. Antigen bemonstering door PP resulteert in de ontwikkeling van IgA + B cel plasmablasten en CD4 ⁺ effector en geheugencellen dat zaad de omringende lamina propria en bieden weerstand tegen een breed scala aan mucosale indringers.

Opheldering van de complexe immunologische afspraken verbonden aan antigeen sampling, verwerking en presentatie in PP's is een moeilijke taak, gezien het feit dat PP cellen slechts een fractie van de totale lymfoïde cellen in het darmslijmvlies vormen. Om in de steun in vitro karakterisatie van cellen in deze omgeving, bieden wij een protocol voor het bereiden van het totaal muis PP cellen voor flowcytometrische en functionele analyse, evenals een protocol voor de bereiding PP cryocoupes voor immunofluorescentie microscopie en immunohistologie. Ons protocol voor de isolatie, karakterisering, en immunokleuring van mouse PP cellen is niet nieuw op zich, zoals blijkt uit het feit dat er tal van verwijzingen dateren van meer dan 25 jaar dat noemen deze technieken ^5,6,9-11. Integendeel, ons protocol biedt een gestroomlijnde (en visuele) methode voor onderzoekers verzamelen PPs voor de eerste keer. De technieken beschrijven we gemakkelijk beheerst en gemakkelijk grote aantallen cellen leveren met> 90% levensvatbaarheid van de cellen. De cryosectioning protocol levert zeer reproduceerbare seriecoupes ideaal voor immunofluorescentiekleuring en confocale beeldvorming. Verder is onze protocol vormt een aanvulling op twee andere recente Jove artikelen. De eerste door Fukuda en collega's beschrijven het gebruik van geligeerde ileal loop assays om de verspreiding van pathogene bacteriën te beoordelen door PP M cellen ^12. De andere, door Geem en collega's, beschrijft de isolatie en karakterisering van DCs en macrofagen van de muis darmslijmvlies, maar uitdrukkelijk uitgesloten PP's uit hun analyse ¹³.

Protocol

De dieren werden gehuisvest onder conventionele, specifieke pathogeen-vrije omstandigheden en werden behandeld in volledige overeenstemming met Institutionele Animal Care het Wadsworth Center en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen.

1. Orale sondevoeding

1. (Optioneel) Gavage muizenstam van keuze met een antigeen of microben van belang met behulp van een 22 G x 1,5-in. blunt-end voeding naald (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Levering volumes mag niet meer dan 400 ul per muis.

2. Isolatie van PP cellen voor flowcytometrie

1. Euthanaseren muizen door CO ₂ stikken, volgens de institutionele dierlijke zorg en gebruik comite (IACUC) richtlijnen.
2. Reinig de buik met 70% ethanol of betadine voorafgaand aan de operatie. Voer een standaard laparotomie dat een (1 cm) incisie met chirurgische kwaliteit schaar langs de middellijn begin ongeveer 1,5 cm van de basis van de ribbenkast omvat. Expose de peritoneal holte en identificeren van de blindedarm. Knip de terminal dunne darm aan het ileum-cecal kruising en verwijder voorzichtig de darm in zijn geheel. Zorg ervoor dat u het darmweefsel hyperextend als het wordt verwijderd uit de peritoneale holte.
3. Leg de dunne darm op een bedje van vochtige papieren handdoeken of Kimwipes. Bevochtig de dunne darm voorzichtig met een zoutoplossing om weefsel uitdroging te voorkomen. Visueel herkennen individuele PP op de anti-mesenteriale zijde van de darm (figuur 1). Typisch, een muis 5-10 zichtbare PP die gelijkmatig van de twaalfvingerige darm (proximale) verdeeld ileum (distaal). Gemiddeld zal vier muizen opleveren 23 PP's.
4. Met gebogen chirurgische schaar voorzichtig accijns individuele PP en plaats ze in Balanced Salt Solution koude Hank's (HBSS). Note moet de schaar geplaatst curve naar boven boven het PP en vervolgens voorzichtig op het weefsel. Accijns alleen de PP (niet surrounding weefsel) en transfer naar koud HBSS.
   Opmerking: Alle incubaties en centrifugeren steenworp afstand van dit punt naar voren in paragraaf 2 moet worden gedaan bij 4 ° C tot levensvatbaarheid van de cellen te behouden.
5. Breng PPs in 5 ml Spleen Dissociation Medium en incubeer gedurende 15-20 min bij 37 ° C krachtig schudden bij 250 rpm. Langere incubatietijd zal een negatieve invloed hebben op levensvatbaarheid van de cellen.
6. Een enkele celsuspensie plaats PP op een steriele (autoclaaf) 70 pm nylon celzeef mesh genereren en geweld het weefsel malen in de maas met de basis van een plunjer van een 1 cc spuit. Als alternatief, sandwich PPs tussen twee frosted steriele glazen objectglaasjes (geautoclaveerd in enveloppen) en voorzichtig weefsels grind met een heen en weer beweging. Een steriele pipet om de celsuspensie over in een 5 ml Falcon buis.
7. Voeg EDTA tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM aan de celsuspensie. Incubeer op een tuimelschakelaar voor5 min bij kamertemperatuur.
8. Decanteren celsuspensie door middel van een tweede 70 pm cel zeef om alle resterende cellulaire aggregaten of weefsel vuil te verwijderen. Verzamel cellen in een 15 of 50 ml conische buis.
9. Onderworpen cellen voorzichtig centrifugeren (5 minuten bij 500 xg). Decanteer supernatant en resuspendeer cellen in flow buffer, die fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 1% foetaal kalf serum (FCS).
10. Om het aantal cellen en levensvatbaarheid te bepalen, verdund 1:10 in cellen trypan blauw en visueel cellen behulp van een lichtmicroscoop en een hemocytometer. Als alternatief kan een Countess celteller (Invitrogen) of iets dergelijks worden gebruikt om automatisch sommen aantal cellen en levensvatbaarheid.
    Beginnend met 20-25 PP, moet dit protocol opleveren> 2,5 x 10 ⁶ cellen totaal. Dit komt overeen ~ 0,8-1,2 x 10 ⁶ cellen per muis.

Antilichaam Labeling van cellen voor flowcytometrie

11. Doseer cellen (10 ⁵ per well) in putjes van een 96 putjes met ronde bodemplaat.
12. Onderworpen plaat zachte centrifugatie (5 min bij 1.000 xg) en decanteer supernatant voorzichtig omkeren van de plaat.
13. Resuspendeer cellen in Fc blokbuffer en incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Hoewel er een aantal commercieel verkrijgbare Fc block buffers (bijvoorbeeld rat anti-muis CD16/CD32, BD Biosciences), brachten we gewoon medium van een rat B cel hybridoma (ATCC 2.4.G2) die een monoklonaal IgG ₁ uitscheidt muriene Fcy receptoren voor deze stap.
14. Onderworpen plaat zachte centrifugatie (5 min bij 1000 xg) als hierboven en decanteer supernatant voorzichtig omkeren van de plaat.
15. Rechtstreeks toevoegen fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen celsuspensies op gewenste verdunning, en incubeer op ijs gedurende 30 min onder voortdurend schudden.
16. Onderworpen plaat zachte centrifugatie (5 min bij 1.000 xg) en decanterenSupernatant door voorzichtig omkeren van de plaat.
17. Was de cellen met 100 pl buffer stroom.
18. Centrifugeer plaat bij 1000 xg gedurende 5 minuten en giet supernatant voorzichtig omkeren van de plaat.
19. Hersuspendeer cellen 400 ui fixatie buffer, die bestaat uit 300 ul buffer stroom en 100 pi 1% paraformaldehyde in PHEM-buffer (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM _MgCl2 bij pH 6).
20. Onderworpen cellen cytometrie met een FACSCalibur of gelijkwaardige stromen. Analyseer de resultaten met behulp van Cell Quest Pro-software versie 5.2.

3. Bereiding van PP Weefsel secties

1. Vooruitlopend op weefsel verzamelen, voeg Optimale Cutting Temperatuur (OCT) verbinding om 7x7x5 mm plastic basis vormen. Maken ook een pool van vloeibare stikstof (> 750 ml) in een dewar of emmer.
2. Euthanaseren muis en uitvoeren van een laparotamy, zoals hierboven beschreven. Verwijder darm en plaats op natte papieren handdoeken.
3. Naarisoleren PPs voor cyrosectioning gesneden 0,5 cm dwars segmenten van de dunne darm met een PP en overdracht weefsel een petrischaal met PBS. Spoel het lumen van deze segmenten met PBS om ongewenste fecale vuil te verwijderen.
4. Plaats darmweefsel segmenten verticaal in basis-vormen met oktober Dompel de mallen in vloeibare stikstof en laat volledig bevriezen weefsel (1-2 min). De kleur van de LGO zal veranderen van helder tot wit wanneer het weefsel volledig is bevroren. . Voor een meer geleidelijke afkoeling (bijvoorbeeld het verminderen van het kraken van de LGO), dompel schimmel in een bad van isopentaan gekoeld met vloeibare stikstof dampen Opmerking: Draag geschikte veiligheidsbril bij het ​​werken met vloeibare stikstof.
5. Verwijder bevroren base mallen van de vloeibare stikstof met forceps en laat de mal op kamertemperatuur lang genoeg (~ 10-15 sec) om de randen van de LGO blok te verzachten. Om het diepgevroren blok van de LGO en verwijder uitde mal, verwissel dan de mal en voorzichtig op de achterkant om het blok uit te werpen op een schone 4 x 4 cm stuk aluminiumfolie op. Onmiddellijk wikkel het weefsel in de folie en in een gelabelde monster zak opgeslagen in vloeibare stikstof of droog ijs. Alternatief: breng weefsel in een vriezer (<-20 ° C). Gebruik het weefsel binnen een week, anders blokken bros met de leeftijd.

Cryosectioning

6. Cryosection het weefsel met behulp van een Leica CM3050S cryomicrotoom of gelijkwaardig. De kamertemperatuur van de cryostaat worden ingesteld op -21 ° C.
7. Streef naar secties die zijn 12 tot 14 micrometer dik.
8. Verzamel secties op Fisher SuperFrost Plus (of gelijkwaardig) glas microscoopglaasjes en inspecteer visueel met behulp van een standaard laag vermogen lichtmicroscoop. Als er meerdere secties worden verzameld op een dia, ervoor te zorgen dat deze worden geclusterd voor downstream kleuringstoepassingen.
9. Store thij glijdt bij kamertemperatuur in een dia doos en, idealiter, gebruik ze binnen een paar dagen.

Antilichaam Etikettering van Weefsel secties en confocale microscopie Analyse

10. Dompel de objectglaasjes in aceton (of methanol) in weefselkleuring pot of rekken gedurende 2 minuten. Langdurige incubatie kan weefsel los te maken van de dia.
11. Transfer objectglaasjes nieuwe kleuring pot en was 3 maal met PBS-T (1X PBS met 0,05% Tween-20) gedurende 3 min elk.
12. Omcirkel de secties met een ImmEdge hydrofobe pen. Dit zal ervoor zorgen dat de reagentia en antilichamen zullen blijven beperkt tot dat gebied tijdens de incubaties.
13. Incubeer slides in blokbuffer (2% geitenserum in PBS) gedurende 30 min bij 37 ° C in een bevochtigde kamer, beschermd tegen licht.
14. Incubeer slides met Fc block buffer (zie hierboven) gedurende 10 min bij 37 ° C.
15. Dip dia's in PBS-T en droge gebied rond secties met behulp van Kimwipes of ander absorberend weefsel.Zorg ervoor dat u de werkelijke weefselcoupes aan te raken.
16. Overlay weefselsecties met primair antilichaam oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde kamer. Primair antilichaam wordt gewoonlijk verdund in blok buffer tot een eindconcentratie van 20 ug / ml. Het gebruik van direct-gelabelde primaire antilichamen is wenselijk omdat zelfs drie antilichamen kunnen direct worden gecombineerd in deze stap. Direct gemerkte antilichamen ook overbodig additioneel antilichaam incubatiestappen.
17. Wash schuift 3 keer (5 min elk) door onderdompeling in PBS.
18. Eventueel incubate dia relevante secundaire antilichamen gedurende 30 min bij 37 ° C in een vochtige kamer.
19. Wash schuift 3 keer (5 min elk) door onderdompeling in PBS.
20. Incubeer dia's voor 4 min in 1% paraformaldehyde in PHEM-buffer, zoals hierboven beschreven.
21. Spoel de objectglaasjes met PBS gedurende 1 min.
22. Droge omgeving van secties met behulp van Kimwipes of andere absorberenent weefsel. Zorg ervoor dat u de werkelijke weefselcoupes aan te raken. Met behulp van een pipet of druppelaar, plaats voorzichtig een druppel direct Verleng Gold montage medium op de sectie. Breng een glazen dekglaasje op het fixeermiddel zorg om luchtbellen te vermijden. Gebruik vloeipapier om overtollig fixeermiddel absorberen.
23. Seal dekglaasjes te microscoopglaasjes met commerciële nagellak en laat aan de lucht drogen.
24. Bekijk dia's met een Leica TCS SP5 of gelijkwaardig confocale microscoop.

Resultaten

Flowcytometrische analyse van monodisperse suspensies van het totaal PP cellen blijkt dat er een duidelijk onderscheid tussen goede en slechte celpreparaten. In goede celpreparaten met meer dan 80% levensvatbaarheid, de overgrote meerderheid van de cellen aan te tonen een hoge voorwaartse verstrooiing (FSC), een indicator van hoge celvolume, en lage zijwaartse verstrooiing (SSC), een indicator van lage cel granulariteit (Figuur 2A). In dit experiment ook opzettelijk heeft een "arme celpreparaat&quo...

Discussie

In dit artikel, hebben we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische en functionele analyse en vriescoupes voor immunokleuring. Beide methoden zijn zeer reproduceerbaar en gemakkelijk toegankelijke, ontvangen een flowcytometer en cryostaat zijn. Voor de eerste keer onderzoekers moet worden opgemerkt dat in vergelijking met de milt, totale cel opbrengsten van PP's zijn relatief gering. Niettemin, het protocol schetsen we het algemeen rendementen tussen 0,8-1,2 ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Item	Vennootschap	Cat. #	Opmerkingen (optioneel)
Oktober Compound	Tissue-Tek	4583
7x7x5 mm Base Molds	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge Pen	Vector Labs	H-4000
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	4951
Edge Rite Blade	Thermo Scientific	4280L
Anti-Mouse CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
Anti-Mouse CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
Anti-Mouse CD4-PE	BD Pharmigen	553652
Anti-Mouse CD8-PE	BD Pharmigen	553032
Anti-muis CD19-PerCP	BioLegend	115531
Balanced salt Hank's oplossing (HBSS) zonder fenolrood	Fisher Scientific	14175-079
70 urn celzeef	BD Falcon	352350
Spleen Dissociatie Medium	Stem Cell Technologies	7915
Geitenserum	Invitrogen	16210-072
Fc blokkeren	ATCC 2.4.G2	HB-197	Supes verkregen uit cellijn 2.4.G2
Gebogen Schaar	FST	14.061-09
Cryostaat	Leica	3050S
FACS Calibur	BD
Gravin Cell Counter	Invitrogen
Hematoxylin	Richard Allan	7211
Eosine	Richard Allan	71304
Formaline	Starplex Wetenschappelijke	3661
			Tabel 1. Reagentia en apparatuur die in deze studie.