Methodenartikel

Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie

DOI:

10.3791/50197

⸱

11 februari 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We tonen een minimaal invasieve techniek genoemd neonatale subventriculaire zone elektroporatie. De techniek bestaat uit het injecteren plasmide DNA in de laterale ventrikels van neonatale pups en toepassen elektrische stroom te leveren en genetisch manipuleren neurale stamcellen

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurale stamcellen (NSC's) langs de postnatale laterale ventrikels en leiden tot verschillende celtypen die neuronen, astrocyten en ependymale cellen 1 omvatten. Inzicht in de moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor de NSC zelfvernieuwing, betrokkenheid, en differentiatie is van cruciaal belang voor het benutten van hun unieke potentieel om de hersenen te herstellen en beter te begrijpen het centraal zenuwstelsel. Eerdere methoden voor het manipuleren van zoogdiersystemen vereist de tijdrovende en dure onderneming van genetische manipulatie in het gehele dier level 2. Zo hebben de meeste studies onderzocht de functies van NSC moleculen in vitro of in ongewervelden.

Hier tonen we de eenvoudige en snelle techniek om neonatale NPCs die wordt aangeduid als neonatale subventriculaire zone (SVZ) elektroporatie manipuleren. Vergelijkbare technieken werden tien jaar geleden ontwikkeld om embryonale NSCs studeren en hebben geholpen studies over cortical ontwikkeling 3,4. Meer recent werd dit toegepast op de studie van de postnatale knaagdier voorhersenen 5-7. Deze techniek resulteert in robuuste etikettering van SVZ NSCs en hun nageslacht. Zo postnatale SVZ elektroporatie zorgt voor een kosten-en tijdbesparende alternatief voor zoogdieren NSC genetische manipulatie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze procedure is in overeenstemming met Yale IACUC eisen. Wetenschappers moeten ervoor zorgen dat IACUC richtlijnen worden goedgekeurd en gevolgd op basis van hun institutionele eisen.

1. Afdeling 1. Bereiding van DNA, oplossingen en glazen pipetten

  1. Genereer hoge zuiverheid (OD 260/280> 1,80) hoge concentratie (ug / ul> 2.5) endotoxine-vrij DNA.
  2. Bereid 0,9% zoutoplossing en steriel gefiltreerd door een 22 pm filter.
  3. Plaats 10 cm brand gepolijst borosilicaatglas capillaire buizen (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in een model PP-830 Narishige PC-10 glazen pipet trekker met een Kanthal draad. Stel trekker om een ​​een stap gewogen pull bij 70,5 ° C. Break tips met ronde tang en inspecteren onder een dissectie microscoop voor gekartelde randen. Bevel tips en plaats onder een UV-lamp gedurende 15 minuten. Getrokken pipetten worden gemarkeerd op 2 mm van de rand van de tip.
  4. Bereid 0,1% gewicht / volume snel groen Solutidoor mengen steriel gefiltreerd 0,9% zoutoplossing met droog snel groen.

2. Sectie 2. Animal Voorbereiding, glazen pipet met laden en Plasmide Injectie

  1. Verwijder postnatale dag 0-1 pups individueel uit kooien, plaats op een glazen petrischaal voorgekoeld tot 4 ° C, en daarna op nat ijs.
  2. Na ongeveer 5 min, is de stand van verdoving door gebruikmaking van de voet pinch reactie. Als er geen beweging optreedt, onder voorbehoud van pups tot intraventriculaire injectie.
  3. Het is belangrijk op te merken dat de combinatie van fast green, DNA en zoutoplossing kan resulteren in een snelle verdamping, kristallisatie en blokkade van glazen pipetten. Daarom het genereren van een stockoplossing aanwezig zijn en aliquot 1 tot 2 pl op parafilm onmiddellijk voorafgaand aan injecties.
  4. Zuig het hele hoeveelheden verdeeld volume met de getrokken glazen pipet.
  5. Houd de kop van de pup tussen uw duim en wijsvinger van uw minder dominante hand.
  6. Zet lamp eend Houd het hoofd van pup net buiten lichtbundel. Indien nodig zoutoplossing op het hoofd van de hoeveelheid licht die gereflecteerd door pup verminderen. De ventrikels nu branden.
  7. Met je dominante hand, steek de naald in laterale ventrikel het dichtst bij u (Figuur 1A en 1B). De plaats van injectie ongeveer gelijke afstand van de lambdoïde hechtdraad en oog en 2 mm lateraal van de pijlnaad. Plaats getrokken pipet om de 2 mm voor een merk P0 pup die moet doordringen in het laterale ventrikel. Toevallig, ziet u wellicht terug vullen van CSF in de pipet uit de release van intracraniale druk. Om intracraniale druk, die helpt bij injectie van plasmide te verminderen, maak je grip op het hoofd van de pup.Step 2.8. Injecteer ongeveer 0,5 ul van plasmide in laterale ventrikel met behulp van een lucht-druk injector (Picospritzer, Parker).

3. Sectie 3. Elektroporatie en Herstel

  1. Set de spanning van de generator voor elektroporatie 5 vierkante pulsen, 50 msec / puls bij 100 volt met 950 msec intervallen. De ruimtelijke specificiteit van elektroporatie plasmide wordt bepaald door de richtingsgevoeligheid van ladingsoverdracht. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de plaatsing vanwege de heterogeniteit van stamcelpopulaties langs de SVZ 8. Verschillen in de tarieven van de proliferatie en lot van de cel zijn geïdentificeerd voor ventrale-dorsale en rostrale-caudale locaties 9,10.
  2. Zodra het plasmide wordt geïnjecteerd, duik pincet elektroden in PBS. Deze stap is om overdracht van lading te maximaliseren en brandwonden veroorzaakt door weerstand te voorkomen.
  3. Plaats de positieve elektrode op de dorsale laterale wand van de pup bij het ​​oor ipsilaterale de site van plasmide injectie (figuur 1C en 1D). Plaats de negatieve elektrode op de contralaterale hemisfeer ventrale lateraal van de pup snuit.
  4. Start stroomoverdracht door te drukken op de pols footsheks pedaal en de elektroden vegen van dorsale laterale met ~ 25 ° hoek intervallen.
  5. Plaats geëlektroporeerd pups op een verwarming pad gedurende 5 minuten. Voorzichtig rondgedraaid pups elke 30 seconden met een milde stimulatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neonatale subventriculaire zone elektroporatie resulteert in de etikettering van bijna alle radiale glia grenst aan de dorsale, laterale dorsale en laterale subventriculaire zone na de "vegen" beweging van de pincet elektrode (figuur 1E). Echter, elektroporatie worden afgestemd op de eisen van de respectieve experiment maar niet vegen de elektrode en met specifieke plaatsing en richting zoals beschreven in de video. Bijvoorbeeld, omdat dorsaal gelokaliseerde radiale glia afwijken van de bekled...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier detail de techniek van neonatale SVZ elektroporatie, een techniek om snel en krachtig labelen en manipuleren SVZ stamcellen en hun nakomelingen. Er zijn verschillende voordelen die elektroporatie heeft in vergelijking met andere technieken. Eerste, gezien de focale kenmerken van cellen, een cel kan zelfstandige en niet-cell autonome effecten onderscheiden. Tweede genetische manipulatie met behulp van induceerbare systemen kan een vergelijking effecten vóór of na synaptische integratie. Verder kan een bypass het geb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen mededelingen te doen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Defensie (Idee ontwikkeling award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT stamcellen subsidie ​​(AB) en een National Institute of Health NRSA 10668225 (DMF). De huidige materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door de staat Connecticut in de Connecticut Stem Cell Research Grants Program. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de staat Connecticut, het ministerie van Volksgezondheid van de staat Connecticut of CT Innovations, Inc De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit tot publicatie, of de bereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer Opmerkingen (optioneel)
Zware Gepolijst Borosilicate Tubing Sutter Instrument BF150-110-10
Dual-Stage Glas Micropipet Puller Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 blokgolf generator Harvard Apparatus 45-0.052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45 tot 0488
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-562-36
Tungsten Halogeenlamp USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Instrumenten 052-0312-900

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).
  3. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883(2008).
  6. Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517(2008).
  7. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  8. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
  9. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13(2011).
  10. de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
  11. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
  12. Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
  13. Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Electroporatie van de neonatale SVZneurale stamcellenelectroporatietechniekDNA injectieimmunohistochemiemicroscopische analyseelektrofysiologische methodenanalyse van het cellotanesthesie van pups

Gerelateerde artikelen