Method Article

Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie

DOI:

10.3791/50197

⸱

February 11th, 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We tonen een minimaal invasieve techniek genoemd neonatale subventriculaire zone elektroporatie. De techniek bestaat uit het injecteren plasmide DNA in de laterale ventrikels van neonatale pups en toepassen elektrische stroom te leveren en genetisch manipuleren neurale stamcellen

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurale stamcellen (NSC's) langs de postnatale laterale ventrikels en leiden tot verschillende celtypen die neuronen, astrocyten en ependymale cellen 1 omvatten. Inzicht in de moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor de NSC zelfvernieuwing, betrokkenheid, en differentiatie is van cruciaal belang voor het benutten van hun unieke potentieel om de hersenen te herstellen en beter te begrijpen het centraal zenuwstelsel. Eerdere methoden voor het manipuleren van zoogdiersystemen vereist de tijdrovende en dure onderneming van genetische manipulatie in het gehele dier level 2. Zo hebben de meeste studies onderzocht de functies van NSC moleculen in vitro of in ongewervelden.

Hier tonen we de eenvoudige en snelle techniek om neonatale NPCs die wordt aangeduid als neonatale subventriculaire zone (SVZ) elektroporatie manipuleren. Vergelijkbare technieken werden tien jaar geleden ontwikkeld om embryonale NSCs studeren en hebben geholpen studies over cortical ontwikkeling 3,4. Meer recent werd dit toegepast op de studie van de postnatale knaagdier voorhersenen 5-7. Deze techniek resulteert in robuuste etikettering van SVZ NSCs en hun nageslacht. Zo postnatale SVZ elektroporatie zorgt voor een kosten-en tijdbesparende alternatief voor zoogdieren NSC genetische manipulatie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze procedure is in overeenstemming met Yale IACUC eisen. Wetenschappers moeten ervoor zorgen dat IACUC richtlijnen worden goedgekeurd en gevolgd op basis van hun institutionele eisen.

1. Afdeling 1. Bereiding van DNA, oplossingen en glazen pipetten

  1. Genereer hoge zuiverheid (OD 260/280> 1,80) hoge concentratie (ug / ul> 2.5) endotoxine-vrij DNA.
  2. Bereid 0,9% zoutoplossing en steriel gefiltreerd door een 22 pm filter.
  3. Plaats 10 cm brand gepolijst borosilicaatglas capillaire buizen (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in een model PP-830 Narishige PC-10 glazen pipet trekker met een Kanthal draad. Stel trekker om een ​​ee....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neonatale subventriculaire zone elektroporatie resulteert in de etikettering van bijna alle radiale glia grenst aan de dorsale, laterale dorsale en laterale subventriculaire zone na de "vegen" beweging van de pincet elektrode (figuur 1E). Echter, elektroporatie worden afgestemd op de eisen van de respectieve experiment maar niet vegen de elektrode en met specifieke plaatsing en richting zoals beschreven in de video. Bijvoorbeeld, omdat dorsaal gelokaliseerde radiale glia afwijken van de bekled.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier detail de techniek van neonatale SVZ elektroporatie, een techniek om snel en krachtig labelen en manipuleren SVZ stamcellen en hun nakomelingen. Er zijn verschillende voordelen die elektroporatie heeft in vergelijking met andere technieken. Eerste, gezien de focale kenmerken van cellen, een cel kan zelfstandige en niet-cell autonome effecten onderscheiden. Tweede genetische manipulatie met behulp van induceerbare systemen kan een vergelijking effecten vóór of na synaptische integratie. Verder kan een bypass het geb.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen mededelingen te doen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Defensie (Idee ontwikkeling award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT stamcellen subsidie ​​(AB) en een National Institute of Health NRSA 10668225 (DMF). De huidige materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door de staat Connecticut in de Connecticut Stem Cell Research Grants Program. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de staat Connecticut, het ministerie van Volksgezondheid van de staat Connecticut of CT Innovations, Inc De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen van g....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer Opmerkingen (optioneel)
Zware Gepolijst Borosilicate Tubing Sutter Instrument BF150-110-10
Dual-Stage Glas Micropipet Puller Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 blokgolf generator Harvard Apparatus 45-0.052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45 tot 0488
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-562-36
Tungsten Halogeenlamp USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Instrumenten 052-0312-900

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neonatal SVZ ElectroporationSubventricular ZoneNeural Stem CellsElectroporation TechniqueDNA InjectionImmunohistochemistryMicroscopy AnalysisElectrophysiology MethodsCell Fate AnalysisPup Anesthesia

Related Articles