Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

24.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50289

⸱

24 september 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Institute, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Division of Cardiology, Sapienza University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Samenvatting

Het gebruik van primaire cardiomyocyten (CMS) in cultuur heeft een krachtige aanvulling verstrekt aan muismodellen van hart-en vaatziekten in het bevorderen van ons begrip van hart-en vaatziekten. Met name de mogelijkheid om ion homeostase, ionenkanalen, cellulaire exciteerbaarheid en excitatie-contractie koppeling en hun veranderingen te bestuderen in zieke omstandigheden en ziekteverwekkende mutaties geleid tot aanzienlijke inzichten hartziekten. Bovendien zijn het ontbreken van een adequate vereeuwigd cellijn te bootsen volwassen CM's, en de beperkingen van neonatale CM's (die veel van de structurele en functionele biomechanica kenmerk van volwassen CM missen) in de cultuur van ons begrip van de complexe wisselwerking tussen signaalwegen belemmerd, ionkanalen en contractiele eigenschappen in het volwassen hart versterken het belang van het bestuderen van geïsoleerde hartspiercellen volwassene. Hier presenteren we methoden voor de isolatie, cultuur, manipulatie van genexpressie door adenovirale-expressed eiwitten en daaropvolgende functionele analyse van cardiomyocyten van volwassen muis. Het gebruik van deze technieken zullen helpen mechanistisch inzicht ontwikkelen tot signaalwegen die cellulaire exciteerbaarheid reguleren, Ca2 + dynamiek en contractiliteit en een veel fysiologisch relevante karakterisering van cardiovasculaire ziekte.

Inleiding

Muismodellen van cardiovasculaire ziekte hebben gediend als doeltreffende instrumenten voor het ophelderen fundamentele ziektemechanismen 1,2 en voor het identificeren van potentiële therapeutische targets 1,3. Met name het gebruik van beide muizenmodellen van verworven hartziekte (zoals druk-overbelasting) 4,5 en transgene muismodellen hebben ons begrip van hartkwaal 6-8. Het gebruik van celkweek technieken signalering cascades 3,9,10 en veranderingen te bestuderen in individuele eiwitten die cellulaire exciteerbaarheid en excitatie-contractie koppeling grondslag liggen in het hart 11-13 op het niveau van de cel zijn een aanvulling op de in vivo muismodellen. Echter, het gebrek aan adequate cellijnen die volwassen CM structuur en functie weerspiegelen een belangrijke beperking geweest. Onderzoekers hebben geprobeerd om dit te overwinnen door het bestuderen van afzonderlijke eiwitten, zoals ionenkanalen, in heterologe expressiesystemen 14, en terwijl deze studies hebben ons voorzien van nuttige informatie in termen van ionkanaal biofysica of eiwit mensenhandel, onvoldoende vertegenwoordiging van de inheemse micromilieu van CMS is een belangrijke beperking. Ten tweede, aangezien de meeste van deze heterologe cellen een volwassen contractiele apparaat niet, maar het is onmogelijk geweest om contractiele functie en de complexe wisselwerking tussen cellulaire exciteerbaarheid en contractie te bestuderen. Daarom hebben onderzoekers zich tot primaire cardiale celkweken voor veel van hun in vitro functionele studies. Tot slot, geïsoleerde cardiomyocyte studies beoordeling van contractiele functie mogelijk te maken zonder de verstorende factoren van meercellige voorbereiding inclusief het effect van litteken of fibrose en vezeloriëntatie.

Primaire neonatale rat ventriculaire cardiomyocyten (NRVMs) zijn relatief gemakkelijk te kweken, kunnen worden besmet met adenovirussen en lentiviruses genexpressie 15 te manipuleren, eennd zijn daarom succesvol 1 gebruikt, maar hebben beperkingen eigen. Hoewel ze een fysiologische micro 1 en het werkpaard van het veld signalering zijn aanzienlijke verschillen tussen de morfologie en subcellulaire ordening NRVMs en volwassen cardiomyoctyes ze onvoldoende model voor het onderzoek van ionische stromen en excitatie-contractie koppeling in het volwassen hart . Met name NRVMs ontbreekt een definitief t-buisvormige subsysteem 4. Sinds Ca 2 + flux en dynamiek zijn sterk afhankelijk van volwassen t-buis-en sarcoplasmatisch reticulum (SR) structuur 6, Ca 2 + dynamiek en functionele studies van de cardiale contractiliteit in NRVMs zijn geen weerspiegeling van deze kritische processen bij volwassen hartspiercellen. Verder is een aantal onderdelen van signaalwegen verschillen tussen neonatale en volwassen muizen 9, waardoor andere beperking voor het bestuderen van de ziekte processen en hun impact op cellulaire prikkelbaarheid en contractiliteit in NRVMs. Tenslotte, de verdeling van de contractiele machinerie tot multidirectionele en niet-uniforme cel verkorting van de juistheid van de contractiele metingen beperken.

Het gebruik van geïsoleerde volwassen hartspiercellen geeft daarom een nauwkeuriger in vitro modelsysteem. De buitengewone groei van kennis mogelijk gemaakt door de genetische manipulatie van muizen onderstreept het belang van het verkrijgen van functionele geïsoleerde cardiomyocyten van muizen. In feite heeft de karakterisering van volwassen CM's geïsoleerd van muismodellen licht werpen op vele biologische en pathologische gebeurtenissen. Geïsoleerd CMs van transgene muismodellen hebben toegestaan ​​voor studies van de winst of het verlies van de functie van eiwitten op de contractiele eigenschappen van enkele cellen 2,16, en de leefbaarheid in de ziekte van modellen zoals ischemie / reperfusie 17,18, waardoor informatie uit in aanvulling vivo studies over dese muizen. Het gebruik van geïsoleerde volwassen CM's van muismodellen van verworven hartziekten 3,19,20 (zoals dwarse aorta-vernauwing veroorzaakte druk overbelasting, dat nabootst hypertensie of aortaklepstenose) of de uitoefening 5,21 (voor het modelleren van fysiologische hypertrofie) maakt voor het onderzoek van de interactie van signalerende cascades betrokken bij deze processen cellulaire exciteerbaarheid en excitatie-contractie koppeling op het niveau van de cel. Bovendien is de mogelijkheid om genexpressie te manipuleren met behulp van adenovirale aangedreven genexpressie in volwassen CM biedt ons de mogelijkheid om de componenten van complexe signalerende wegen ontleden.

Vanuit een elektrofysiologisch perspectief hebben whole-cell spanning en stroom clamp experimenten op geïsoleerde volwassen CMs kritisch geweest in het ophelderen van de aard van de ionische stromen bij aanvang en bij diverse ziektebeelden. Vanwege de complexe structuur van de celmembraan en het differentieel protein Steigerconstructies tussen volwassen CMS en NRVMs of heterologe cellijnen, de mogelijkheid om volwassen cellen patch geeft een betere weergave van de gevolgen van bepaalde membraaneiwitten, structurele eiwitten, en ionkanaal interactie partners over de elektrofysiologische componenten van het volwassen hart.

Ondanks deze prominente voordelen in het bestuderen van volwassen muizen hartspiercellen, het isoleren en kweken van volwassen muizen hartspiercellen is uitdagend en drong de noodzaak van een systematische en nauwkeurige omschrijving van de methodologie om levensvatbare muis hartspiercellen te isoleren en ze te handhaven in de cultuur om verdere genetische manipulatie mogelijk maken met behulp van virale vectoren. Eerdere studies hebben gebruikt ofwel acuut geïsoleerd muis volwassen CMS of gekweekte ratten volwassen CMS. De laatste zijn gemakkelijker te cultuur dan volwassen muis CMs, en de meeste experimenten manipuleren van genexpressie in vitro hebben gebruikt rat volwassen CMS. Weinig studies hebben met succes veranderd en onderzocht functionale genexpressie in muizen volwassen CM's, die een grote beperking van de reikwijdte van de experimenten. Daarom, hier geven we in detail dergelijke methodieken, gewijzigd ten opzichte van eerdere onderzoeken, voor de isolatie 7,8,22, cultuur 3,10,15,23, adenovirale infectie 11-13,15, en functionele analyse van volwassen muis ventriculaire cardiomyoctyes. Deze isolatieprotocol resulteert in Ca2 +-tolerante, prikkelbare cardiomyocyten dat we met succes gekweekt gedurende maximaal 72 uur en transiënt getransfecteerd met adenovirus. De functionaliteit van deze geïsoleerde cellen kunnen worden beoordeeld met het MMSYS beeldvormingssysteem 14,24 en patch clamp, die ook zal worden besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cardiomyocyte Isolatie

Materials (figuur 1)

Microdissecting tang
Tissue tang
Delicate hemostatische tang
Hemostatische tang
Microdissecting, getand, gebogen tang
Operationele schaar, recht
Operationele schaar, gebogen
15 ml Falcon buizen (5)
60 mm petrischaal
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
Nylon Mesh - 400 um poriegrootte
Kleine trechter
Wax coating, gevlochten zijden 4-0, 19 mm, 7-10 cm lang
Non-injectienaald, stomp uiteinde, 24 G of commerciële vervoedering naald (24 x 1 in, W/1-1/4)
Heparinenatrium
Ketamine / xylazine mengsel
Pasteurpipetten
OptiVision Dissecting Goggles
IonOptix MMSYS systeem

Opmerking: Als het kweken van cellen, zie rubriek 2 op celkweek voor het begin van dit protocol.

Opmerking: Alle muizen werden verzorgd ineen barrière faciliteit en geofferd volgens de goedgekeurde IACUC regelgeving, praktijken en procedures.

Opmerking: Voorafgaand aan het begin van de procedure, moet het hele systeem worden voorverwarmd zodat alle elementen van het Langendorff (figuur 2A, figuur 3) worden verwarmd tot 37 ° C om goede en volledige collagenase activiteit.

  1. Injecteren volwassen muizen (~ 12 weken) met 150 USP eenheden heparine natrium in de buikholte.
  2. Verdoven met een injectie van ketamine / xylazine mengsel bij een gewicht-afhankelijke dosis (Tabel 1).
    1. 80:12 mg / kg ketamine: xylazine recept: 2,6 ml ketamine (100 mg / ml) + 0,4 ml xylazine (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Finale: ketamine = 6,5 mg / ml; xylazine = 1 mg / ml
  3. Zet de muis verdoofd om het besturingssysteem pad, accijnzen het hart, en plaats in een schotel van kamertemperatuur PBS of 0,9% zoutoplossing (Figuur 1J). PhyIOLOGISCHE zoutoplossing kan het intacte hart samentrekken betere extrusie van bloed in de kamer en gemakkelijke identificatie van de aorta voor stap 1.6. Muizen werden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat ze diep onder narcose via het verlies van de achterste ledematen teen knijpen reflex en een vertraging van de ademhalingsfrequentie voorafgaand aan de aanvang van de thoracotomie.
  4. Gebruik OptiVision ontleden bril (Figuur 1A) te identificeren en bloot de aorta. Verwijderen van het weefsel rond de aorta, hoewel het de visualisatie van het vaartuig, is niet nodig voor het optimaliseren van de cel isolatie als de aortawortel duidelijk zichtbaar.
  5. De pomp met perfusie buffer (tabel 2). De temperatuur moet worden gehouden op 37 ° C voor de duur van de procedure met een gecontroleerde, circulerend waterbad (figuur 2D).
  6. Monteer het hart op de Langendorff Apparatus (Figuur 2A). Met behulp van twee-micro ontleden tang (fig. 1D-E), prIME de aorta rond de niet-onderhuids, stompe einde naald (24 G) met siliconen buis aan de distale punt. Als alternatief kan een commerciële vervoedering naald (24 x 1 in, W/1-1/4) kan worden gebruikt. De siliconen buis op de 24 G naald of de diervoeding naald zal zorgen voor het vastzetten van de hechtdraad over de groef. Plaats de aorta op de naald als een sok. (Figuur 2C).
    1. Opmerking: Het is belangrijk om te zorgen dat het uiteinde van de naald rust in de omhooggaande aorta, bij voorkeur in de aortawortel distale rechts innominate, maar dat het niet uitstrekken door de aortaklep in de linker ventrikel, omdat dit zal sterk beperken het vermogen van de buffers effectief perfuseren door het hart via de coronaire arteriën.
  7. Bevestig het hart om de naald door binden een kleine lengte van hechten zijde (7-10 cm) (fig. 1K) rond de bovenkant van de aorta, zodat de band op het niveau van de aorta ascendens, onder de juiste innominate artery, maar boven het uiteinde van de naald.
  8. Laat het hart in het inwendige van de conische glazen (figuur 2B) om een geschikte omgevingstemperatuur te handhaven.
  9. Perfuseren het hart perfusie buffer gedurende 5 minuten bij een snelheid van 1 ml / min en klem de glazen kamer uitstroom zodat het perfusaat te verzamelen in de conische glas en envelop het hart. Het schema voor de vertering van het hart wordt getoond in figuur 3.
    1. Op dit moment moet u het volume van het hart stijging zien. Daarnaast zal bloed in hartweefsel vervangen door perfusaat, waardoor weefsel bleekheid.
  10. Laat de uitstroom klem aan het perfusaat uitlekken. Stop de pomp om de slang verplaatsen van de perfusie buffer container het enzym buffervat (figuur 2E). Start de pomp kan worden naar het hart perfuseren met enzym buffer (tabel 2) bij 1 ml / min. Klem de uitstroom weer om het enzym buffer om de envelophart.
    1. Hier, zoals het enzym wordt perfunderen het hart en het verteren van het bindweefsel, het hart zal bleker worden en de structurele integriteit zal afnemen.
    2. Om te bepalen wanneer de ventrikels gesneden uit de verteerde hart, til het hart uit de conische glas, knijp het hart met een tang en het verzamelen van een paar druppels perfusaat in een kleine petrischaal en controleer om te zien of enkele cellen dalen .
    3. Voor de beginner is het handig om de perfusie lijn met een manometer aansluiten. Wanneer het hart wordt steeds verteerd zal de druk snel te dalen, als het bindweefsel niet de weerstand te houden. De manometer is ook nuttig voor de beginnende zodat de positie van de naald boven de aortaklep en niet in de ventrikel. Lage druk geeft aan dat de naald in de ventriculaire kamer en hogedruk aangegeven dat de naald raakt het ventiel.
  11. Snijd de ventrikels van het hart in een schaalvol overdracht buffer (A) (tabel 2) wanneer de ventriculaire druk begint te dramatisch dalen of wanneer u in staat om enkele cellen zien in het perfusaat zijn. Dit duurt meestal ~ 7-10 minuten.
  12. Wederom met behulp van micro-ontleden pincet (figuur 1C), gehakt de ventrikels in kleine stukjes te distantiëren. Een succesvolle vertering zal vrijwel geen vaste stukjes weefsel verlaten na het hakken, met de meeste van het weefsel steeds amorfe op dissociatie.
    1. Om verder dissociëren het weefsel, pipet de oplossing / uit met een kunststof Pasteur pipet (figuur 4), waarvan de punt was gesneden in een ~ 45 °. Deze wijziging dient om de inwendige diametrale ruimte van de pipetpunt aldus verminderen van de hoeveelheid schuifspanning op de cellen als het weefsel getritureerd verhogen.
    2. Voor ontleden van het weefsel met de tang is het mogelijk om de afzonderlijke kamers te scheiden en afzonderlijk dissociëren atrium, linker ventrikel of recht ventriculaire cellen.
  13. Beveilig de vierkante mazen (figuur 1 M) tot een kleine trechter (figuur 1L) met klemmen en plaats deze filtering apparaat in een 15 ml Falcon buis (figuur 1I).
  14. Gebruik de gemodificeerde Pasteur pipet om de cel oplossing uit de schaal verwijderd en filtreer de oplossing in de Falcon buis.
  15. Laat de levende cellen om zich te vestigen op de bodem van de buis (live cell sedimentatie moet 2-4 min. duren).
  16. Aliquot 2,5 ml van elk van de vier calciumoplossingen (tabel 3) in 4 afzonderlijke 15 ml Falcon buizen.
  17. Wederom met een standaard Pasteur pipet, verwijder de celpellet van de bodem van de buis en breng de cellen de eerste van de calciumoplossingen.
  18. Laat de cellen naar de bodem van de buis en stap 1.17 herhalen de volgende calciumoplossingen totdat de cellen in de laatste oplossing.
  19. Laat de cellen zich te vestigen in de fourth calcium oplossing. Doe het buisje dicht en zet hem op zijn kant.

2. Celkweek

  1. Voor de isolatie, plaat 1 ug / ml natuurlijke muis laminine op dekglaasjes en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C en 2% CO2. Ook laat de platen en kweekmedia (tabel 4) te verwarmen in de incubator bij 37 ° C en 2% CO2. Hierdoor kan het opgeloste CO2 in de media in evenwicht.
    1. Verwijder de bovenkant van de media. Draai gewoon de top om besmetting te voorkomen.
  2. Laat de geïsoleerde cellen pellet op de bodem van de Falcon buis.
  3. Verwijder de pellet met een standaard kunststof Pasteur pipet en resuspendeer in de juiste hoeveelheid plating media.
  4. Plaat de cellen op de laminine beklede dekglaasjes in de juiste maat schotel en incubeer bij 37 ° C en 2% CO2 gedurende ten minste 30-60 minuten zodat de cellen hechten aan de dekglaasjes.
  5. ** Als transfecteren met adenovirus, verdunnen het virus in een geschikte hoeveelheid van plating media en vervang de beplating media in de schaal met de virus-bevattende media. Laat het virus op de cellen incuberen gedurende 2 uur bij 37 ° C en 2% CO2. **
  6. Verwijder de beplating media uit de schotel en te vervangen door de cultuur media.
  7. Wijzigen voorzichtig het kweekmedium dagelijks om niet de cellen op de dekglaasjes verstoren.

Met deze procedure werden cellen met succes gekweekt tot 72 uur. Afbeeldingen van gekweekte en GFP getransfecteerde cellen zijn te vinden in figuur 5.

3. MMSYS System

  1. Power de MMSYS dat waarborgt dat de booglamp eerste wordt gestart.
  2. Sluit de buizen van de pomp naar de juiste inlaat en uitlaat van de MMSYS kamer (figuur 6).
  3. Vul het systeem met calcium buffer (B) (Tabel 2).
  4. Plaats een ca.opriately sized glazen dekglaasje in de kamer en zet hem vast (figuur 6E). De meeste MMSYS kamers gebruiken ofwel 22 mm of 25 mm vierkant dekglaasjes. Raadpleeg uw MMSYS handleiding om de juiste dekglaasje voor uw kamer bepalen.
  5. Breng 500 pi van de celoplossing om een ​​kleine Eppendorf buis.
  6. Voeg 0,5 ul fura2-AM (voorraadoplossing van 1 ug / ul) aan het buisje van cellen en laat ze incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5-7 minuten. Hierdoor kan de fura2-AM tot "load" in de cellen door snelle passieve diffusie door het celmembraan.
    1. Laat de Fura-2 geladen cellen neer op de bodem van de buis, en was de overmaat Fura met 500 ui buffer calcium B.
  7. Schakel verlichting in de kamer.
  8. Met een standaard Pasteur pipet, druppel 1-2 druppels (afhankelijk van de celconcentratie) van het "beladen" cel oplossing in het midden van de kamer (figuur 6C) en laat de celleo vestigen op het dekglaasje gedurende 5 minuten.
    1. De dichtheid van de cellen in de kamer moet zodanig zijn dat enkele niet-overlappende cellen gemakkelijker kunnen worden weergegeven in de MMSYS data acquisitie platform.
  9. Beginnen zorgvuldig om calcium buffer (B) stroomt door de kamer.
  10. Verhoog de kamertemperatuur tot 37 ° C.
    1. BELANGRIJK: Schakel de verwarming apparaat totdat de stroom is gestart. Dit kan de feedback thermocoupler (figuur 6A) ernstig beschadigen.
  11. Zorg ervoor dat de kamer is verbonden met de MyoPacer via verbindingsdraden (figuur 6B) en beginnen de cellen tempo 5 Hz met 1,5 x de stimulatiedrempel van de cellen.
  12. Kies een cel die slaat op de juiste frequentie en beweeg het in de framing diafragma.
  13. Stel de camera en lijsten diafragma afmetingen, zodat de hele cel in het midden van het venster, horizontaal gerichte, met de sarcomeren apouder.
    1. Voor cel lengte aan te passen de rode en groene (rechts en links) fotodiode indicatoren aan de rand van de cel. Stel nu het contrast zwart / wit contrast aan de randen van de cel te optimaliseren. Raadpleeg de Ionoptix handleiding voor meer informatie.
  14. Plaats het vat in een gebied van de cel met welomschreven sarcomeren en de scherpstelling naar de top van het vermogensspectrum (rood) optimaliseren. Ook de helderheid van de microscoop om de blauwe smoothing raam en zwarte contrast informatie te optimaliseren.
  15. Pas de groene drempel bars om zoveel mogelijk van de rode vermogensspectrum (piek) en zo weinig achtergrond mogelijk vast te leggen.
  16. Begin met opnemen.
  17. Nadat voldoende data is opgeslagen, op "Pauze" om de opname tijdelijk te stoppen, zodat noch het gericht en afmetingen van het weergavevenster worden gewijzigd, verplaats stadium van de microscoop om een ​​gebied van het dekglaasje waarin geen cellen of cellulair materiaal kan gezien. LenGTH van de opname is afhankelijk van de onderzoeker experimentele protocol.
    1. Opmerking: Als u op "Stop" wordt de opname te stoppen en geen achtergrond kunnen worden geregistreerd voor die cel zal zijn.
  18. Klik op "Doorgaan" om een ​​achtergrond meting opnemen.
  19. Na genoeg achtergrond is opgeslagen klik op "Stop" om de opname te stoppen.
  20. Klik op "Bestand >> Opslaan" om alle sporen van die cel in een enkele. ZPT bestand wilt opslaan.
  21. Herhaal stap 3,12-3,20 totdat voldoende cellen zijn opgenomen.
  22. Raadpleeg de IonOptix-MMSYS Gebruikershandleiding 12 voor instructies over de analyse van de geregistreerde gegevens. Kenmerkend opgenomen data van wildtype cardiomyocyten in figuur 7.

4. Patch Clamp

Patchklemmen van verschillende celtypen zijn goed eerder beschreven in dit tijdschrift 25-28. Daarom richten we ons op sommige criticusal parameters voor een succesvolle patchklemmen van volwassen hartspiercellen geïsoleerd met behulp van ons protocol beschreven.

  1. Met behulp van een pipet trekker en borosilicaatglas (met gloeidraad: OD 1.5 mm, ID 0,86 mm - 10 cm lengte) trekken een pipet die vertoont ~ 2,0-3,0 MQ wanneer gevuld met pipet oplossing (tabel 5).
  2. Brand-polish de pipet tip zachtjes met een Narishige of ander verticaal vuur polijstmachine. De weerstand van de patch pipet moet 2-4 MO na brand polijsten zijn.
  3. Zet de computer, versterker (Axopatch 200B), AD-omzetter (Digidata 1440A, Axon Instruments) en Micromanipulator (MP-285). Voor gehele cel patch clamping beginnen we met standaardparameters zoals eerder beschreven.
  4. Voor gekweekte volwassen CM's, verwijder ze uit de couveuse en voorzichtig te wassen het dekglaasje waarop de CM's zijn bedekt met PBS bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder voorzichtig het dekglaasje en plaats deze in de perfusie kamer op de omgekeerde microscoop (Nikon TE 2000).
    1. Zorg ervoor dat de inlaat voor het perfusie systeem steekt (zuiging) net boven het oppervlak van het dekglaasje.
  6. Begin perfuseren met de juiste extracellulaire oplossing (Tabel 5).
  7. Voor net losgemaakte volwassen CMs, plaats een collageen gecoate dekglaasje in de perfusie-systeem zoals hierboven.
    1. Omdat de cellen in oplossing plaats voorzichtig het extracellulaire oplossing buffer.
  8. Met behulp van de gewijzigde Pasteur pipet (figuur 4), voorzichtig resuspendeer de cellen in de extracellulaire buffer, neem een hoeveelheid en plaats het op het dekglaasje.
  9. Laat de cellen hechten gedurende 10-15 minuten voor aanvang van de perfusie als in 4.4.
  10. Back-vul de gehele cel patch pipet met intra-cellulaire buffer met behulp van een Microfil (World precisie-instrumenten, 28 G) naald. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de punt van de pipet, tik voorzichtig om de luchtbellen te zweven naar de surface van de oplossing.
  11. Bevestig de gevulde patch pipet om de pipet-houder, zodat er contact is tussen de micro-elektrode en de interne oplossing.
    1. We maken gebruik van zilverchloride elektroden, maar zorgen voor 'chloriding' de zilveren draden minstens een keer per week door onderdompeling gedurende de nacht in bleekwater.
  12. Sluit voorzichtig de pipet in het bad, zodat het bad elektrode is ondergedompeld te allen tijde in het bad / extracellulaire oplossing. Offset elke vloeistof junction mogelijkheden op dit moment. Grote kruispunt potentials kan een teken van de verslechterende zilverchloride op de elektroden zijn.
  13. Gezonde cilindrische volwassen CMs worden geïdentificeerd in de microscoop en gecentreerd in het gezichtsveld. Zoals eerder beschreven, een combinatie van het verplaatsen van de micromanipulator en de scherpte maakt nabijheid van de patch pipet en het oppervlak van het GH.
    1. Zodra ze zijn in hetzelfde focal plane, maken we gebruik van een combinatie van visuelenisatie van de cel en testimpuls (beschikbaar in de Axopatch 200B).
    2. Wanneer de weerstand van de pipet af doormidden (suggereert dat de pipet in contact met het oppervlak van de cel), en de cel blijft cilindrische kijken we na gigaohm afdichting met zachte zuigkracht.
    3. CMS, geven we de voorkeur mond zuig om negatieve druk te vestigen. Als een gigaseal succes wordt verkregen, we weer gebruik maken van zachte ritmische mond afzuigen 'break-in' om de cel te whole cell patch mode vast te stellen.
  14. Typische rust mogelijkheden van gezonde CM's zijn in de orde van -85 tot -90 mV. Zodra een gigaseal wordt verkregen, het meten van de rust membraanpotentiaal behulp stroomtang met I = 0 pA.
    1. Als de rust membraanpotentiaal gedepolariseerd dit een beschadigde cel of een slechte afdichting kan aangeven.
  15. Omdat de CM's zijn grote cellen met veel oppervlakte, moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan compensatie capaciteit, vooral when snel activeren stromingen zoals natriumkanaal moet worden bestudeerd. Indien er voldoende capaciteit schadevergoeding niet kan worden verkregen met behulp van de ingebouwde compensatie instellingen van de pulsgenerator, prepulses bij sub-threshold voltage en tegengestelde polariteit kan moeten worden toegepast en de resulterende stroom afgetrokken van het opgenomen signaal. Een dergelijk protocol is eenvoudig te programmeren in Axopatch.
  16. Zodra whole cell patch mode is vastgesteld, wacht 15 minuten, zodat een evenwichtstoestand en stabiliteit van de afdichting te garanderen voorafgaand aan het begin spanning of stroom clamp protocollen. Wij maken gebruik van standaard protocollen die eerder zijn beschreven in deze en andere tijdschriften en zullen niet worden ingegaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De isolatie van volwassen cardiomyoctyes resultaten staafvormige, gegroefd en zwakke (niet spontaan kloppen) cellen (Figuur 5A). Dode cellen zullen afgeronde kijken en geen strepen zullen aanwezig zijn. Rustende cellen kunnen gekweekt en getransfecteerd met adenovirus genexpressie (Figuren 5B en 5C) manipuleren. Na 24 uur van de cultuur, de morfologie van de levende cellen niet verandert, ze nog Ca 2 +-tolerant en kunnen worden afgepast door veldstimulatie. M...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit verslag hebben we de technieken die noodzakelijk zijn voor een succesvolle isolatie en kweek van volwassen CMS in het muizenhart beschreven. De techniek maakt vervolgstudie CM functie en prikkelbaarheid volgens de hierboven beschreven werkwijzen. De kritische parameter voor het bestuderen functionaliteit van volwassen CM is de gezondheid en de geïsoleerde CM. Zoals hierboven beschreven, onze technieken maken een hoge opbrengst van functionele cellen die vatbaar zijn voor manipulatie van genexpressie met adenovira...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sodium ChlorideSigmaS7653
Potassium ChlorideSigmaP9333
Magnesium ChlorideSigmaM8266
HEPESSigmaH3375
Sodium Phosphate MonobasicSigmaS8282
D-glucose minimumSigmaG8270
TaurineSigmaT0625
2,3-Butanedione monoximeSigmaB0752
Collagenase BRoche Applied Science11088807001
Collagenase DRoche Applied Science11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseusSigmaP5147
Albumin from Bovine SerumSigmaA2153
Calcium ChlorideSigmaC8106
Minimum Essential MediaSigma51411C
Albumin solution from bovine serumSigmaA8412
L-glutamineSigmaG3126
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplementSigmaI1884
Cesium ChlorideSigma289329
GlutamateSigmaG3291
Adenosine 5'-triphosphate magnesium saltSigmaA9187
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acidSigmaE3889
Cesium Hydroxide SolutionSigma232041
Tetraethylammonium hydroxide solutionSigma86643
OptiVisor optical glass binocular visorDohegan Optical Company Inc.N/A
Tissue forceps, 5.5", 1x2 teethRoboz ScientificRS-8164
Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated Roboz ScientificRS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mmRoboz ScientificRS-4966
Packer Mosquito Forceps 5" Straight FlatRoboz ScientificRS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp Roboz ScientificRS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mmRoboz ScientificRS-5907

Referenties

  1. Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
  2. Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
  3. Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
  4. Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
  5. Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
  6. Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
  7. Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
  8. Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
  9. Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
  10. Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
  11. Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
  12. Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
  13. Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
  14. Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
  15. Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
  16. Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
  17. Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
  18. Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
  19. Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
  20. Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
  21. Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
  22. Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
  23. Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
  24. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
  25. Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269(2011).
  26. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936(2008).
  27. Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107(2010).
  28. Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351(2010).
  29. Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
  30. Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
  31. Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
  32. Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Cardiomyocyten van volwassen muizenisolatie van cardiomyocytenkweek van cardiomyocytenanalyse van calciumhuishoudingmeting van contractiliteitadenovirale genexpressieperfusiebuffersysteemenzymatische bufferdigestiemeting van sarcomerlengteratio metrische analyse
Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.