Muismodellen voor Graft Arteriosclerosis

Samenvatting

We beschrijven protocollen voor onze muis graft arteriosclerois (GA) modellen die tussenkomst van een muis bloedvatsegment betrekken in een ontvanger van dezelfde inteeltstam. Door terugkruisen extra genetische veranderingen in het vat donor kan het model het effect van specifieke genen op GA beoordelen.

Samenvatting

Graft arteriosclerois (GA), ook wel allogreffevasculopathie is een pathologische laesie die zich ontwikkelt over maanden tot jaren in getransplanteerde organen gekenmerkt door diffuse, perifere stenose van het gehele transplantaat vaatstelsel. De meest kritische component van GA pathogenese is de proliferatie van gladde spier-achtige cellen in de intima. Wanneer een menselijke kransslagader segment wordt geplaatst in de infra-renale aorta van immunodeficiënte muizen, kan de Intimas te breiden in reactie op adoptief overgedragen humane T-cellen allogeen de slagader donor of exogeen humaan IFN-γ in de afwezigheid van menselijke T-cellen. Tussenplaatsing van een muis aorta van een stam naar een andere muis stam ontvanger beperkt als model voor chronische afstoting bij mensen omdat het acute celgemedieerde afstotingsreactie in dit muismodel volledig elimineert alle donor-afgeleide vasculaire cellen van het transplantaat binnen twee tot drie weken. We hebben recent ontwikkelde twee nieuwe mOuse modellen om deze problemen te omzeilen. Het eerste model betreft tussenkomst van een segment schip uit een mannelijke muis in een vrouwelijke ontvanger van dezelfde inteeltstam (C57BL/6J). Transplantaatafstoting in dit geval alleen gericht tegen kleine histocompatibility antigenen gecodeerd door het Y-chromosoom (aanwezig in de mannelijke maar niet de vrouwelijke) en afstotingsreactie die volgt voldoende lui om donor-afgeleide gladde spiercellen behouden gedurende enkele weken. Het tweede model is sprake tussenplaatsing van een slagader segment van een wildtype muis C57BL/6J donor in een gastheer muizen van dezelfde stam en geslacht de receptor mist IFN-γ gevolgd door toediening van muizen-IFN-γ (geleverd door infectie van de muis lever met een adenovirale vector. er geen afstoting in dit geval zowel de donor en ontvangende muizen van dezelfde stam en geslacht maar donor gladde spiercellen prolifereren in reactie op de cytokine terwijl gastheer-afgeleide cellen, ontbreekt receptor voorDit cytokine, niet reageren. Door terugkruisen extra genetische veranderingen in het vat donor kunnen beide modellen worden gebruikt om het effect van specifieke genen op GA progressie beoordelen. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor onze muis GA-modellen.

Inleiding

Graft arteriosclerois (GA), ook wel allogreffevasculopathie is een pathologische laesie die zich ontwikkelt over maanden tot jaren in getransplanteerde organen gekenmerkt door diffuse, perifere stenose van het gehele transplantaat vaatstelsel ^7. Vroeg stadium kan veroorzaken excentrieke en focale vernauwingen die zijn meer voor de hand in de slagaders, waardoor meer gelijkenis vertonen met vernauwingen gezien in conventionele atherosclerose. Het lumen verlies van het transplantaat vaartuigen resultaten van intimale uitzetting door infiltratie van gastheer T-cellen en macrofagen en vooral accumulatie van extracellulaire matrix en gladde spier-achtige cellen afkomstig van graft, host of beide ^{5, 13, 19,} die onvoldoende wordt gecompenseerd door uiterlijke schip verbouwen. In cardiale allotransplantaten, de klinisch significante laesies die in de epicardiale en intramyocardiale kransslagaders. Uiteindelijk zal GA van de coronaire arteriën ischemisch hartfalen. GA is de belangrijkste oorzaak van late cardiale graft verlies. De stenose van GA stoppen bij de hechtdraad lijnen, sterk implicating de gastheer respons op graft alloantigenen in de pathogenese en leidt ons naar GA classificeren als een vorm van chronische afstoting ^3. Echter, kunnen andere vormen van arteriële schade het risico van GA verhogen, hetzij door middel van het verhogen van de netto lasten van letsel of door intensivering en / of moduleren van de allo-respons. De endotheelcel (EC) bekleding van graft slagaders bewaard in menselijk GA en de oppervlakkige gebieden van de intima naast de EC voering is de plaats zwaarst geïnfiltreerd door gastheer-afgeleide IFN-γ-producerende T-cellen en macrofagen ^11, in sommige patiënten GA wordt geassocieerd met de ontwikkeling van donor-specifieke alloantistoffen die binden aan graft EC ¹⁶ maar de vaartuigen leveren weinig bewijs van fibrinoïde necrose die karakteristiek acute antilichaam-gemedieerde afstoting ^11.

De meest kritische component van GA pathogenese is deproliferatie van gladde spier-achtige cellen in de intima, of deze taak kan worden aangehouden, GA waarschijnlijk vooruitgang. Eerdere werk van onze groep had aangetoond dat Intimas van menselijke kransslagader segmenten geplaatst in de infra-renale aorta's van immunodeficiënte muizen uit te breiden in reactie op adoptief overgedragen menselijke T-cellen allogene aan de slagader donor en dat dit proces kan worden geremd door het neutraliseren van de menselijke IFN- γ ^18. Verder exogene humane IFN-γ kan intimale veroorzaken (en mediale) vasculaire gladde spiercel (VSMC) proliferatie in deze arteriële grafts in de afwezigheid van menselijke T-cellen ^{15, 17.} (Het is belangrijk op te merken dat de mens en muis IFN-γ niet oversteken species, het uitsluiten van indirecte effecten op de muis gastheer in deze experimentele systeem.) Deze gehumaniseerde muismodellen hebben het voordeel van recapituleren menselijke T-cel / vasculaire cel interacties en de intima laesies zijn grotendeels uit humaan (bijvoorbeeld graft-afgeleide cellen)zoals is waargenomen in klinische monsters, maar zij niet volledig de klinische situatie herhalen omdat ze voorbijgaan aan de rol van gastheer macrofagen en mogelijk andere celtypen betrokken bij klinische transplantatie laesies. Een conventionele muismodel van dit proces kunnen theoretisch probleem aanpakken, als aanvulling op de beperkingen van de gehumaniseerde model door met een compleet gastheerimmuunsysteem en die de extra voordeel dat de kracht van de muis genetische benaderingen worden toegepast GA. De twee meest gebruikte muismodellen betrekken heterotopische harttransplantatie en orthotopische slagader transplantatie ^1. De letsels die zich ontwikkelen in de slagaders van heterotopische hart enten zijn grotendeels opgebouwd uit gastheercellen, waarschijnlijk van beenmerg herkomst, terwijl intima cellen van de bloedvaten in het menselijke hart enten zijn overwegend van graft oorsprong ^{5, 13, 19.} Dit is een belangrijk onderscheid dat ons ertoe alternatieve muismodellen ontwikkelen. Tussenplaatsing vaneen muis aorta van een stam naar een andere muis stam ontvanger nog beperkter als een model voor chronische afstoting bij mensen omdat het acute celgemedieerde afstotingsreactie in dit muismodel volledig elimineert alle donor-afgeleide vasculaire cellen van het transplantaat binnen twee tot drie ¹⁹ weken. Bijgevolg is de volgende veranderingen gezien in de tussengelegen segment vaartuig zijn slechts een antwoord van gastheercellen die de ontcelde vaartuig scaffold zijn herbevolkt, waardoor een sterk artefact situatie van beperkt belang als een model voor de veranderingen in graft vaten die zich in de kliniek. We hebben recent ontwikkelde twee nieuwe muismodellen om deze problemen te omzeilen ^21. Het eerste model betreft tussenkomst van een segment schip uit een mannelijke muis in een vrouwelijke ontvanger van dezelfde inteeltstam (C57BL/6J). Het tweede model gaat invoegen van een slagader segment van een wild-type C57BL/6J muis donor in een gastheer muis van dezelfde stam en het geslacht dat de rec ontbreekteptor voor IFN-γ (IFN-γR-KO) gevolgd door toediening van muizen-IFN-γ (geleverd door infectie van de muizenlever met een adenovirale vector. We beschrijven hier gedetailleerde protocols en voordelen van onze muis GA modellen.

Protocol

Muis transplantaat en syngeen graft transplantatiemodel

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele dieren verzorging en commissies gebruik van Yale University. Voor allotransplantaat model, werden segmenten van thoracale aorta van mannelijke, 4-5 weken oude WT (C57BL/6J) of IFN-γR-KO muizen geplaatst in de abdominale aorta van de vrouwelijke ontvanger, 8-12 weken oude WT met een end-to -end microchirurgische anastomose techniek (zie volgende voor details). Voor syngeen graft-model, werden segmenten van thoracale aorta's van mannelijke, 4-5 weken oude WT muizen geplaatst in de abdominale aorta's van mannelijke, 8-12 weken oude IFN-γR1-KO met behulp van een end-to-end microchirurgische anastomose techniek. Op 1 week na de operatie werden de dieren geïnoculeerd met iv Ad5.CMV-muizen-IFN-γ of Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) en 1 x 10 ⁹ PFU. Serum muis IFN-γ-niveaus werden gemeten met ELISA (eBioscience) op 1 en 5 weken na toediening adenovirus. Bepaalde dieren kregen BrdU(Sigma-Aldrich) en 100 mg / kg sc gedurende 2 weken vóór opoffering.

End-to-end microchirurgische anastomose techniek (video zal worden genomen voor dit deel):

1. Donor Procedure

1. Verdoven de donor muizen met intraperitoneale injecties van ketamine (50 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg).
2. Na een adequate verdoving, plaatst de donor muizen onder de operationele microscoop bij X8-30 vergroting op een dienblad in een liggende positie, en gebruik jodium Prep Pad en Alcohol Prep Pad voor borstwand voorbereiding.
3. Incise de voorste borstwand door de ribben en het middenrif aan het hart bloot te leggen.
4. Open het rechter atrium, injecteer 10 ml heparine (100 U / ml) zoutoplossing in de linker ventrikel van de muizen met een 10-ml injectiespuit met een 25-gauge naald spoelen.
5. Resectie van het hart en longen naar de gehele lengte van thoracale aorta bloot.
6. Ontleden de thoracale aorta aandachtig naar de directe trauma, whil minimaliserene identificeren, afbinden en verdeel het hout takken met 11-0 hechtdraad in de buurt van de aorta.
7. Zodra de thoracale aorta is vrij van het omringende weefsel, accijnzen de gehele thoracale aorta voor transplantatie.
8. Spoel het afgesneden uiteinde van de donor aorta met heparine (100 U / ml) zoutoplossing, en opslaan in dezelfde oplossing op ijs (tot 6 uur) tot transplantatie.

2. Ontvanger Procedure

1. Injecteer de ontvangende muizen met ip ketoprofen (5 mg / kg) voor analgesie en thenanesthetize de muizen met ip ketamine (50 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). De ontvangende muizen zijn diep verdoofd binnen 10 minuten voor een duur van 60-90 minuten. Tijdens de operatie wordt het niveau van de anesthesie onderzocht om de 15 min door te knijpen in de buikwand of de voet met behulp van een tang. Indien het dier reageert op de schadelijke stimuli op elk moment tijdens de operatie een extra dosis ketamine en xylazine (1/4 of 1/3 origineel dosis) sc of im toegediend
2. Na een adequate verdoving, afscheren het bont in de voorste buikwand met behulp van een elektrisch scheerapparaat, het reinigen van de huid met behulp van jodium Prep Pad en Alcohol Prep Pad, de ogen te bedekken met oogzalf. Tijdens de operatie wordt de volgende aseptische techniek worden toegepast voor de activiteiten, zoals het reinigen van de operatietafel met 10% bleekmiddel, dragen steriele handschoenen en met gesteriliseerde instrumenten voor microchirurgie (stoom-gesteriliseerde instrumenten voor het begin van de bewerking, dan heet glaskraal gesteriliseerd instrumenten tussen meerdere operaties, enz.).
3. Plaats de ontvangende muizen onder de operationele microscoop bij een vergroting van X8-30 op een dienblad in een liggende positie.
4. Incise de buikwand op de middellijn van xyphoid tot schaambeen, en verspreid de buikwand uit elkaar met behulp van een micro-oprolmechanisme aan de buikholte bloot te leggen.
5. Trek de darmen superiorly en wikkel met gaas bevochtigd met een zoutoplossing. De ontvangende muizen raken gekoeld door het verlies van heat door veruiterlijkte darmen. Het is belangrijk dier warmte te handhaven. Echter, de verwarmende raad niet gebruikt tijdens de chirurgie als bescheiden onderkoeling van voordeel tijdens occlusie van de aorta bloedstroom en er inefficiënt warmteoverdracht afwezige bloeddoorstroming naar de onderste helft van de muizen lichaam voorkomen ruggenmergletsel.
6. Verplaats de voortplantingsorganen inferiorly, wikkel de buik gebied van ontvangende muizen met zout-oplossing-bevochtigd gaas, en gebruik deze om het rectum trekken naar de rechterkant van de buik. De blootgestelde weefsels worden periodiek geïrrigeerd met zoutoplossing tijdens de transplantatie.
7. Ontleden botweg een segment van de infrarenale aorta tussen de renale vat proximaal en aortabifurcatie distaal en scheiden van vena cava inferior (IVC) voorzichtig.
8. Identificeren en afbinden alle van de kleine takken afkomstig van dit segment van de abdominale aorta met 11-0 Polyamide Monofilament hechtdraad.
9. Cross-klem de geïsoleerde segment van eenbdominal aorta met twee vasculaire klemmen proximately 5 mm van elkaar, een aan elk uiteinde.
10. Doorsnijden van de abdominale aorta tussen de klemmen met scherpe micro-schaar om de anastomotische sites te maken.
11. Resectie een klein segment van de abdominale aorta (tot 0,4 mm in lengte) van het ene afgesneden uiteinde van de doorgesneden ontvanger aorta naar de donor aorta graft tegemoet.
12. Spoel de aorta segmenten tussen de klemmen met behulp van heparine zoutoplossing om het resterende bloed te verwijderen. De aorta segmenten tussen klemmen en de donor aortaprothese wordt periodiek geïrrigeerd met gehepariniseerde (100 U / ml) zoutoplossing (tot 40 ml / kg) gedurende anastomose.
13. Transect beide zijden van de donor aorta met scherpe micro-schaar om een ​​segment transplantaat van 2,5 mm in de lengte voor transplantatie te creëren.
14. Plaats de donor aortaprothese in de orthotope positie anastomose de donor de proximale en distale einde van de proximale en distale snijdende van abdominale aorta van de ontvanger, respectievelijk, met een eind-to-end model met 11-0 Polyamide Monofilament hechtdraad.
15. Voor de continue hechtingen, plaatst het verblijf hechtingen op 3 en 9 uur posities in de eerste plaats. Tussen twee verblijf hechtingen aan elke kant van transplantaat, anastomose beide snijkanten in 3-4 steken met de running hechtingen, en bind de running hechtingen om hechtingen te verblijven met een dubbele knoop. Aangezien beide lagen sluiting continu zijn, wordt het risico van dehiscence toegenomen. De donor aortaprothese moeten in geschikte lengte proximale en distale snijdende van abdominale aorta van de ontvanger verbinden.
16. Voor de onderbroken hechtingen, construeren vier anastomose op 3 en 9 uur posities in beide zijden van graft enerzijds en anastomose beide snijranden 3-4 steken tussen twee blijven hechtingen aan weerszijden van transplantaat.
17. Laat de distale klem om de retrograde stroom in graft toestaan, identificeren het bloeden sites en maak extra steken binnen 3 minuten.
18. Na het vaststellen van bevredigende hemostase, laat de proximale klem.
19. Bevestig graft patency door de aanwezigheid van krachtige pulsaties in het transplantaat en het aangrenzende proximale segment van natief abdominale aorta, in het bijzonder in het distale aangrenzende segment van abdominale aorta en inferior mesenterica. Overweeg trombose in anastomosen als de pulsatie verminderen binnen enkele minuten na het herstel van de bloedstroom.
20. Keer de darmen in de buikholte.
21. Hechtdraad sluit de buikwand met 5-0 nylon hechtdraad in de spierlaag en huidlaag, respectievelijk.
22. Plaats de ontvangende muizen in een schone kooi bovenop een verwarmingselement en wacht 1-2 uur gedurende de muizen herwinnen bewustzijn en herstellen van anesthesie. Het is belangrijk dier voldoende warmte behouden gedurende herstel. Houd de muizen in de warme en droge kooi voordat dier kielzog van anesthesie.
23. Beoordeelt de motorische functie van de achterste ledematen na muizen herstel, en opnieuw op de tweede dag. Een succesvolle transplantatie operatie zal worden bevestigd if geen storing van achterpoten wordt waargenomen in ontvangende muizen op de tweede dag.
24. Dien de ontvangende muizen met Ketoprofen in drinkwater (5 mg / kg / d = 27 ug / ml in drinkwater) gedurende 48 uur. Indien een ontvangende muizen last van pijn niet verlicht door de postoperatieve pijnstillers zoals blijkt uit het verlies van mobiliteit, niet de bruidegom, abnormale gebundelde houding, etc, zullen ze worden gedood. De dieren worden gedood op vooraf bepaalde eindpunten na 1-60 dagen.

Graft-analyse

Artery transplantaten in allograft werden verkregen bij 4 weken transplantaten in syngene transplantaat model waren 6 weken na operatie (5 weken na virale infectie) en geanalyseerd door standaard histologische technieken Elastica-van Gieson (EVG) kleuring, hematoxyline en eosine (HE) kleuring en immunofluorescentie kleuring. Foto's zijn gemaakt met behulp van een immunofluorescentie microscoop systeem (Zeiss). Cel telling van kernen omringd door positieve immunostaining was voerened onder hoge vergroting en nam het gemiddelde van 5 doorsneden voor elke graft. De ent gebied metingen van het lumen (binnen het endotheel), intima (tussen het endotheel en de interne elastische lamina, IEL), media (tussen IEL en externe elastische lamina, EEL), wanddikte (tussen het endotheel en externe elastische lamina) en totale houder (binnen de EEL) werden berekend uit 5 serial dwarsdoorsneden, 150 urn apart voor elk transplantaat, met behulp van computer-ondersteunde beeldanalyse en NIH Image 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).

Statistische analyse

Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Tweezijdig, gepaarde t-toetsen en een twee-weg ANOVA-analyse werd uitgevoerd met behulp van het Prism software (GraphPad Software). Verschillen met p <0,05 werden als statistisch significant geven.

Resultaten

Muis allograft arteriosclerose (GA) model: In dit model wordt een mannelijke donor aorta getransplanteerd in vrouwelijke ontvangende zodat de gastheer induceert alloreactieve T-cel-gemedieerde respons tegen een allo minor Y antigen (het mannelijk-specifieke minor histocompatibility antigen HY) uitgedrukt het transplantaat ^12, en op zijn beurt T-cel-geproduceerde IFN-γ drives proliferatie van VSMC ²⁰ zoals waargenomen in andere harttransplantatie modellen ^{2, 6, 8-10, 14.} ...

Discussie

De beschreven protocollen zijn gericht op de muis GA-modellen. De procedures kunnen worden toegepast op andere graft transplantatiemodellen. Deze modellen omvatten gehumaniseerd xenograft (dwz menselijke kransslagader segmenten geplaatst in de infra-renale aorta's van immunodeficiënte muizen) en acute afstoting muis GA-model (dat wil zeggen een muis aorta van het ene genetische zeef in een andere genetische ontvangende stam). Onze beschreven muismodellen zijn meer voor de menselijke GA letsels slui...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weken) Ontvanger (8-12 weken)
Ketamine Hydrochloride Injectie	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Opslagoplossing(50 mg/ml) Werkoplossing(5 mg/ml)
Xylazine steriele oplossing	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Opslagoplossing(100 mg/ml) Werkoplossing(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Opslagoplossing(100 mg/ml) Werkoplossing-oraal (0,027 mg/ml)
Heparine Natrium	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400	Opslagoplossing(1000 U/ml) Werkoplossing(100 U/ml)
Zoutoplossing (Steriele 0,9% natriumchloride)	CareFusion	AL4109
0,9% Natriumchloride-injectie	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	Voor het bereiden van het anestheticum
Vaselinum Ophthalmicum Zalf	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Jodium-prep-pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol-prep-pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscoop	Leica	MZ95
Microschaar	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Springschaar	F.S.T	15009-08	Om de aorta van donor of ontvanger te doorsnijden
Extra smalle schaar	F.S.T	14088-10
Naaldhouder/pincetten	MICRINS	MI1542	Om de naald vast te houden
Fijne pincetten	F.S.T	11254-20
Pincet	F.S.T	11251-35
Standaard patroon pincet	F.S.T	11000-12
Pincet	F.S.T	13011-12
LANCASTER Oogsprei	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Microvasculaire klem	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Microklem aanbrengforceps met vergrendeling	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Zwarte polyamide monofilament naad	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 naad, Naald=70 micron
Zwarte monofilament nylon naad	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 naad
Niet-geweven gaasjes	McKesson Corp.	Bestelnummer 94442000
1 ml-sering	BD	REF 309659
3 ml-sering	BD	REF 309657
10 ml-sering	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermische naald	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermische naald	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermische naald	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermische naald	BD	REF 305106
Verwarmingspad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
Tabel 2. Specifieke reagentia en apparatuur.