Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED) ondersteunt de analyse van de intracellulaire calcium winkel dynamiek door fluorescentie beeldvorming. De methode baseert op richten van een recombinant carboxylesterase het endoplasmatisch reticulum (ER), waar het verbetert de lokale ontmaskering van synthetische lage affiniteit Ca 2 + Indicator kleurstoffen in het ER lumen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Direct Imaging van ER Calcium met Targeted-esterase-Induced Dye Loading (TED)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Visualisatie van calciumdynamiek is belangrijk om de rol van calcium in celfysiologie begrijpen. Aan calcium dynamiek te onderzoeken, hebben synthetische fluorescerende Ca2 + indicatoren populair geworden. Hier laten we TED (= gericht esterase-geïnduceerde loading dye), een werkwijze voor de afgifte van Ca2 + verbetering indicator kleurstoffen in het ER lumen van verschillende celtypes. Tot op heden werd TED in cellijnen, gliacellen en neuronen in vitro. TED bases op efficiënte, recombinant richten van een hoge carboxylesterase activiteit om het ER lumen met behulp van vector-constructies die express carboxylesterasen (CES). De meest recente TED vectoren bevatten een kernelement van CES2 gefuseerd met een rood fluorescerend eiwit, waardoor gelijktijdig twee-kleuren beeldvorming. De dynamiek van de vrije calcium in het ER worden afgebeeld in een kleur, terwijl de desbetreffende ER structuur verschijnt in het rood. Aan het begin van de procedure worden cellen getransduceerd met een lentivirus. Vervolgens, de geïnfecteerde cellen eenopnieuw gezaaid op dekglaasjes om eindelijk live cell imaging mogelijk. Vervolgens worden levende cellen geïncubeerd met de acetoxymethylester (AM-ester) vorm van lage-affiniteit Ca 2 +-indicatoren, bijvoorbeeld Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, of Mag-fura2-AM. De esterase activiteit in de ER klieft uit hydrofobe zijketens van de AM-vorm van de Ca 2 +-indicator en een hydrofiele fluorescerende kleurstof / Ca 2 + complex wordt gevormd en opgesloten in het ER lumen. Na kleurstof laden, worden de cellen geanalyseerd op een omgekeerde confocale laser scanning microscoop. Cellen zijn continu geperfuseerd met Ringer-achtige oplossingen en de ER calciumdynamiek direct gevisualiseerd door time-lapse imaging. Calcium afgifte uit het ER wordt geïdentificeerd door een afname in fluorescentie-intensiteit in de gebieden van belang, terwijl het bijvullen van de ER calcium opslag veroorzaakt een toename in fluorescentie-intensiteit. Tenslotte wordt de verandering in fluorescentie-intensiteit in de tijd bepaald door berekening van AF / F 0.
Inleiding
Om de fysiologische calcium reacties van de ER op te lossen, hebben we een nieuwe strategie om de vangst van synthetische calcium-gevoelige kleurstoffen in de ER verbeteren ontwikkeld. De methode kan de directe, niet-verstorende real-time monitoring van de vrije ER calcium in aanwezigheid van extracellulair calcium.
Functie en signalering van ER Calcium
Calcium signalen zijn te vinden in verschillende celtypen, bijvoorbeeld spier-cellen, neuronen en gliacellen en hun functies variëren van bemiddelen spiercontractie om een betrokkenheid bij synaptische transmissie in leren en geheugen 1,2. Vera....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol introduceert TED toegepast op cellijnen, hippocampale neuronen en corticale gliacellen. TED prestaties best wanneer TED vectoren stabiel tot expressie gebracht, bijvoorbeeld door lentivirale vectoren. Een schematisch overzicht van de TED werkwijze wordt getoond in figuur 4.
1. Voorbereiding van Solutions
De volgende oplossingen worden bereid voordat en kunnen worden opgeslagen zoals aangegeven. Wij gebruiken over het algemeen gesteriliseerd glas en plastic materiaal en geautoclaveerd water.
- Bereid HEPES-Ringer (in mM): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO4 .7
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol voorziet in een niet-verstorende benadering voor directe beeldvorming van gratis ER calcium. Lage affiniteit synthetische Ca2 + indicatoren worden vrijgegeven en gevangen in het ER lumen met behulp van een ER gerichte recombinante esterase enzymactiviteit. Betere belading van de Ca 2 +-indicator kleurstoffen aan het ER lumen maakt een directe en snelle beeldvorming van ER calcium winkel dynamiek.
Celtypen voor TED
De haalbaarheid v.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De voor-en nadelen van de TED-methode zijn uitgebreid besproken in recente publicaties 34,35. Vergeleken met andere werkwijzen die hierboven beschreven TED omzeilt het probleem te verstoren en perfuseren van de cellen. Bovendien, twee aspecten moeten worden benadrukt. Het beginsel van TED ER calcium imaging (1.) De gerichte expressie van actief carboxylesterase in het ER lumen met behulp van TED vector constructen en (2.) Rationeel en preferentiële afgifte van laag-affiniteit synthetische AM-esters of vereist.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 en de Friedrich-Baur-Stiftung. Wij willen graag Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories dank aan de University of California, San Diego voor ons met Tag-RFP-T2. We dankbaar erkennen David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, en Didier Trono, Universiteit van Genève, Genève, voor het verstrekken van ons de lentivirale plasmiden FUGW en psPAX2/pMD2.G.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| (S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
| 5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham's F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
| Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
| Materials | |||
| Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
| Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
| NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006 | ||
| Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
| Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
| Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
| Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
| Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
| Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. |
Referenties
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calci....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
