Direct Imaging van ER Calcium met Targeted-esterase-Induced Dye Loading (TED)

Samenvatting

Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED) ondersteunt de analyse van de intracellulaire calcium winkel dynamiek door fluorescentie beeldvorming. De methode baseert op richten van een recombinant carboxylesterase het endoplasmatisch reticulum (ER), waar het verbetert de lokale ontmaskering van synthetische lage affiniteit Ca ^{2 +} Indicator kleurstoffen in het ER lumen.

Samenvatting

Visualisatie van calciumdynamiek is belangrijk om de rol van calcium in celfysiologie begrijpen. Aan calcium dynamiek te onderzoeken, hebben synthetische fluorescerende ^{Ca2 +} indicatoren populair geworden. Hier laten we TED (= gericht esterase-geïnduceerde loading dye), een werkwijze voor de afgifte van ^{Ca2 +} verbetering indicator kleurstoffen in het ER lumen van verschillende celtypes. Tot op heden werd TED in cellijnen, gliacellen en neuronen in vitro. TED bases op efficiënte, recombinant richten van een hoge carboxylesterase activiteit om het ER lumen met behulp van vector-constructies die express carboxylesterasen (CES). De meest recente TED vectoren bevatten een kernelement van CES2 gefuseerd met een rood fluorescerend eiwit, waardoor gelijktijdig twee-kleuren beeldvorming. De dynamiek van de vrije calcium in het ER worden afgebeeld in een kleur, terwijl de desbetreffende ER structuur verschijnt in het rood. Aan het begin van de procedure worden cellen getransduceerd met een lentivirus. Vervolgens, de geïnfecteerde cellen eenopnieuw gezaaid op dekglaasjes om eindelijk live cell imaging mogelijk. Vervolgens worden levende cellen geïncubeerd met de acetoxymethylester (AM-ester) vorm van lage-affiniteit Ca ^{2 +-indicatoren,} bijvoorbeeld Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, of Mag-fura2-AM. De esterase activiteit in de ER klieft uit hydrofobe zijketens van de AM-vorm van de Ca ^{2 +-indicator} en een hydrofiele fluorescerende kleurstof / Ca ^{2 +} complex wordt gevormd en opgesloten in het ER lumen. Na kleurstof laden, worden de cellen geanalyseerd op een omgekeerde confocale laser scanning microscoop. Cellen zijn continu geperfuseerd met Ringer-achtige oplossingen en de ER calciumdynamiek direct gevisualiseerd door time-lapse imaging. Calcium afgifte uit het ER wordt geïdentificeerd door een afname in fluorescentie-intensiteit in de gebieden van belang, terwijl het bijvullen van de ER calcium opslag veroorzaakt een toename in fluorescentie-intensiteit. Tenslotte wordt de verandering in fluorescentie-intensiteit in de tijd bepaald door berekening van AF / F _0.

Inleiding

Om de fysiologische calcium reacties van de ER op te lossen, hebben we een nieuwe strategie om de vangst van synthetische calcium-gevoelige kleurstoffen in de ER verbeteren ontwikkeld. De methode kan de directe, niet-verstorende real-time monitoring van de vrije ER calcium in aanwezigheid van extracellulair calcium.

Functie en signalering van ER Calcium

Calcium signalen zijn te vinden in verschillende celtypen, bijvoorbeeld spier-cellen, neuronen en gliacellen en hun functies variëren van bemiddelen spiercontractie om een betrokkenheid bij synaptische transmissie in leren en geheugen ^1,2. Veranderingen in de concentratie vrij calcium van groot wetenschappelijk belang omdat calcium is betrokken bij de regulatie van gentranscriptie, celproliferatie, neuronale prikkelbaarheid, celdood en andere cel signalerende gebeurtenissen ^1-7. Al deze cellulaire calcium signalen functioneel verbonden en bijdragen tot intracellulaire calciumwinkel dynamiek ^8-10.

Een gemeenschappelijk kenmerk van alle calcium signalen is de stroom van calcium tussen de extracellulaire ruimte, het cytosol en organellen, vooral de ER en mitochondria. Hierdoor dynamische veranderingen in calciumconcentratie in deze organellen, die worden waargenomen door verschillende signaleringscomponenten. In het algemeen is de calciumconcentratie in het ER varieert tussen 100-800 uM, in het cytosol de calciumconcentratie dicht bij 100 nM en in de extracellulaire ruimte is de concentratie ongeveer 1-2 mM. Dienovereenkomstig is er een grote chemische motor voor calcium stromen naar het cytosol ^2,9,10.

De meest onderzochte ER-afgeleide calcium signalen afhankelijk van de stimulatie van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR) die vervolgens activeren fosfolipase C (PLC). PLC op zijn beurt produceert inositol 1,4,5-trifosfaat _(IP-3) ^1. Na binding van _IP3 zijn receptor (IP _3-Rec, figuur 1) in de ER-membraan, worden calciumionen vrij uit het ER lumen. Historisch gezien, IP _{3-gemedieerde} calcium vrijlating uit de ER was eerste - hoewel indirect - gemeten in acinar alvleeskliercellen door Streb et al. in 1983 ^11.. Deze publicatie voorgesteld voor het eerst een signalerende cascade met acetylcholine, fosfolipase C en _IP3. Deze manier van calcium release algemeen aangeduid _{IP3-geïnduceerde} calciumafgifte (IiCR) (figuur 1). Kinase-afhankelijke activering van fosfolipase Cy door receptor tyrosine kinases banden de actie van groeifactoren en neurotrofe factoren aan ER calcium signalering na IP ₃ elevatie ^12. Naast IiCR, kan calcium hoogte worden gemedieerd door ionotrope calciumingang, bijvoorbeeld via spanningsafhankelijke calciumkanalen (Ca _V) en vervolgens calcium geïnduceerde calcium afgifte (CICR) door re ryanodineceptors (RyR). IiCR en CKP zijn fysiologisch gekoppeld aan winkel-bediende calciumingang (SOCE). SOCE omvat de werking van STIM (stroma interactie molecule), een sensor voor ER calcium release. STIM is aangetoond extracellulair calcium ingang stimuleren door transient receptor potential kanalen (Trp) ¹³ Orai calciumkanalen ¹⁴ en zelfs spanningsafhankelijke calciumkanalen ¹⁵ (figuur 1). Verlies van ER calcium wordt dynamisch gered door de werking van de sarco-endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA), die actief pompen calcium terug in het ER. Het blokkeren van de SERCA met drugs zoals thapsigargin onthult een continu verlies van ER calcium aan de cytosolische compartiment. Deze ER calcium "lek" wordt veroorzaakt door ER intramembrane porie complexen zoals het Sec61-eiwitcomplex ^16,17 (Figuur 1).

In 1998 Berridge publiceerde een model, de "neuron binnen een neuron model", which suggereert een principe fysiologische rol van de ER in het integreren van neuronale calcium ^5. Dit model beschouwt het bestaan ​​van een continu ER membraan systeem vormen een intracellulair "imago" van de neuronale plasmamembraan ^5. Deze binaire eukaryote membraan systeem werd beweerd dat een basisvoorwaarde voor temporele en ruimtelijke integratie van snelle en langzame calcium signalen in neuronen zijn. Calcium signalen die ofwel optreden gelijktijdig of nadien in verschillende stekels of dendrieten van de zelfde neuron worden verleend aan soma of nucleus via de ER, waar ze worden opgeteld ^5,18 van de cel. Dan kunnen hun som effecten op de prikkelbaarheid van het neuron, regulatie van gen transcriptie of integratie van signaleringscascades hebben. Dus de ER ondersteunt de integratie van calcium signalen. Een voorwaarde voor dit concept is de continuïteit van de ER in een cel, die is geclaimd door verscheidene studies die bewezen althans somato-dendritic gebieden en de korte afstand axonale projecties ^19-21. Of sprake is van ER continuïteit binnen lange axonale projecties is een kwestie van debat.

Strategieën om de stroom van vrij calcium via ER membraan meten

Calcium signalen worden meestal gevolgd in het cytosol ^22,23. Derhalve kan niet gemakkelijk worden onderscheiden of Ca ^{2 +} stroomt in het cytosol van extracellulaire of intracellulaire opslagplaatsen ^6,24. Om deze beperking te omzeilen, hebben methodologische strategieën voor directe ER calcium beeldvorming ontwikkeld. Samenvattend worden de volgende strategieën: (1) ER-gerichte genetisch gemanipuleerde eiwit-indicatoren ^25-27 eiwit gebaseerde lage affiniteit ^{Ca2 +} indicatoren de bioluminescent eiwit GFP aequorine of in combinatie met een calcium gevoelige eiwit.. Deze genetisch gemanipuleerde Ca ^{2 +-indicatoren} (GECIS) kangericht naar de ER met behulp van een signaalpeptide en actief blijven in het ER met een retentietijd en retrieval motief. Gemeenschappelijke ER Ca ^{2 +-indicatoren} te baseren op de Cameleon principe en zijn de Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon split YC7.3ER ^29, en Cameleon D1 ^30. (2) Direct esterase-based dye laden van AM-ester lage affiniteit Ca ^{2 +-indicatoren 31,32.} AM-derivaten van de indicator kleurstoffen (Mag-fura2-AM, Mag-Fluo4-AM of Fluo5N-AM) passeren de biologische membranen in een lipofiele, calcium-ongevoelige toestand. Vervolgens, in het cytosol en in de ER, endogene esterases splitsen van de AM-estergroep en laat de Ca ^{2 +-indicator,} met achterlating van een bepaalde hoeveelheid actieve kleurstof in het cytosol en in de ER. Daarom is deze benadering bruikbaar onder omstandigheden van een hoge concentratie calcium in de ER zolang de cytosolische calciumconcentratie ruim beneden de debescherming limiet van de lage-affiniteit-indicatoren, met name tijdens karakteristieke calcium signalen (bijv. nM tot laag uM). (3) AM-ester loading in combinatie met plasma membraan permeabilisatie ^32. Overgebleven cytosolische Ca ^{2 +-indicator} wordt verwijderd door plasma-membraan permeabilisatie met kleine hoeveelheden van een "mild" detergens (bijvoorbeeld saponine) in een kunstmatige intracellulaire buffer. Aldus kan de intracellulaire membranen worden gestimuleerd, bijv. met _IP3 in de intracellulaire buffer, rechtstreeks via "poriën" in de plasmamembraan. (4) Dialyse van het cytosol onder whole-cell configuratie en gelijktijdige metingen van Ca ^{2 +} in het ER lumen en het cytosol ^32,33. Een cel wordt eerst geladen met een lage affiniteit Ca ^{2 +-indicator} (bijv. Mag-fura2- AM, ratiometrisch, UV-licht). Daarna, met de hulp van een patch pipet, eventueel resterende cytosolic lage affiniteit Ca ^{2 +-indicator} wordt gedialyseerd uit het cytosol met een buffer met een hoge affiniteit Ca ^{2 +-indicator} (bijv. Fluo-3, zichtbaar licht). Deze strategie maakt het mogelijk gelijktijdig opnemen van cytosol en ER afgeleide signalen. (5) Gerichte-esterase-geïnduceerde kleurstof laden ^8,34. A carboxylesterases (CES) is gericht op het lumen van het ER en biedt een high esterase activiteit efficiënte vangst van de AM-ester vorm van lage affiniteit ^{Ca2 +} indicatoren.

Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED)

Het richten van lage-affiniteit Ca ^{2 +-indicatoren} om de ER lumen te verbeteren, is TED ontwikkeld. TED vereist overexpressie van een ER gerichte muis carboxylesterase (CES2) (Figuur 2), hetgeen wordt bereikt door expressieconstructen. Cellen die een recombinant CES-construct worden geïncubeerd met het AM-ester vorm van calcium inindicator kleurstof (Fluo5N-AM, figuur 2). Vervolgens, in het ER, wordt de kleurstof omgezet in de ^{Ca2 +} gevoelige membraan doorlaatbare Ca ^{2 +} complex indicator (Fluo5N/Ca ^{2 +)} door de hoge esterase activiteit dan het vangen van de kleurstof in een hoge concentratie in het ER lumen ^{8 , 34.} De werkwijze is bijzonder nuttig voor ER calcium-afgifte te onderzoeken via de IiCR-wegen bijvoorbeeld via metabotrope, purinerge-of glutamaatreceptoren ^8,34 en ER calcium uitputting visualiseren via "lek kanalen" direct, bijvoorbeeld na blokkade van de SERCA ^{17 , 34.} Onze ervaring de lage affiniteit Ca ^{2 +-indicator} Fluo5N-AM is momenteel de best beschikbare indicator om te gebruiken met de TED kleurstof laden strategie. Fluo5N-AM heeft een lage affiniteit voor Ca ^{2 +} (dissociatieconstante K _D ~ 90 uM, figuur 2), is vrijwel non-tl in zijn AM-vorm, maar biedt een hoge fluorescentie-emissie bij calcium. binding ^8,34. De Fluo5N/Ca ^{2 +} complex geëxciteerd kan worden met een standaard lichtbron van ~ 490 nm, wat overeenkomt met standaard kleurstoffen zoals FITC, Alexa 488 of eGFP. Cytosolische calcium signalen nauwelijks een concentratie in het lage uM range bereiken en worden derhalve nauwelijks gedetecteerd door Fluo5N in de cytosol ^35.

Om TED verbeteren, werden verschillende recombinante vector constructen ontwikkeld (figuur 3). Oorspronkelijk TED vectoren op basis van de coderende sequentie van CES2 (Refseq toegangsnummer NM_145603, CES2c) en best TED werking wordt waargenomen met stabiele expressie van CES constructen. Nieuwe TED vectoren drukken een kernelement van CES2 gefuseerd met de rode fluorescentie eiwit TagRFP-T2 ^36. Deze vectoren hebben het voordeel dat zij kunnen worden geïdentificeerd getransduceerde cellen en de rode fluorescentie als een interne controle voor de normalisatie van veranderingen in Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescentie. De rode fluorescentie biedt ook de mogelijkheid om de structurele verdeling van de ER en veranderingen in ER processen onder de stimulatiecondities visualiseren.

Protocol

Dit protocol introduceert TED toegepast op cellijnen, hippocampale neuronen en corticale gliacellen. TED prestaties best wanneer TED vectoren stabiel tot expressie gebracht, bijvoorbeeld door lentivirale vectoren. Een schematisch overzicht van de TED werkwijze wordt getoond in figuur 4.

1. Voorbereiding van Solutions

De volgende oplossingen worden bereid voordat en kunnen worden opgeslagen zoals aangegeven. Wij gebruiken over het algemeen gesteriliseerd glas en plastic materiaal en geautoclaveerd water.

1. Bereid HEPES-Ringer (in mM): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 _MgSO4 .7 _H2O, 2 _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H O. _2. Calcium-free HEPES-Ringer bestaat uit (in mM): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 _MgSO4 .7 _H2O, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O en 0,1 EGTA.. Zonder glucose deze beeldvormende oplossingen kunnen be bewaard bij 4 ° C. De benodigde hoeveelheid D-glucose wordt vers toegevoegd vóór gebruik.
2. Voor TED analyse in hippocampale neuronen, is kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) aanbevolen. ACSF bestaat uit (in mM): 127 NaCl, 23 _NaHCO3 3 KCl, 2,5 NaHPO ₄ H ₂ O 25 D-glucose.H ₂ O, 2 _CaCl2, 2 _MgCl2 .7 H ₂ 0 in DDH. ₂ 0.
3. Bereid Fluo5N-uur tot een concentratie van 5 mM. Om oplosbaarheid commentaar 8,9 pl 20% Pluronic F-127 (in DMSO, bewaard bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht en vocht) tot 50 ug gelyofiliseerd Fluo5N-AM. Dan oplosbaar Fluo5N-AM door middel van een waterbad ultrasoonapparaat minstens 2 minuten. Store porties à 0,5 ul bij -20 ° C, beschermd tegen licht en vocht.
4. Bereid antagonist en agonist aandelen als nodig is. Bijvoorbeeld: a) 10 mM ATP of ADP (in H ₂ O, metabotropische activering van purinerge receptoren), b) 10 mM carbachol in _H2O (agonistmuscarine acetylcholine receptor), c) 30 mM Cyclopiazonzuur (CPA) in DMSO (inhibitor van de SERCA), d) 50 mM DHPG in PBS (metabotrope glutamaat receptor agonist voor mGluR _I mGluR _5), e) 10 mM glutamaat in H ₂ O, f) 1 mM ionomycine in DMSO (ionofoor), g), 5 mM thapsigargin in DMSO (hoge affiniteit blocker van de SERCA). WINKEL aliquots bij -20 ° C.
5. Lentivirale vectoren: Dit protocol omvat het gebruik van lentivirale TED expressievector deeltjes. Hun productie en opslag is geen onderdeel van dit protocol. We gebruiken lentivirale vectoren van de tweede generatie voor de overdracht van recombinante carboxylesterasen cellijnen, gliale cellen en neuronen. Ons lentivirale systeem bases op de expressie vector FUGW ^37, en de verpakking plasmiden pCMVΔR8.91 of psPAX2 en de pseudotypering plasmide pMD2.G ^38,39 LET OP:. Bedenk dat het werken met recombinant self-inactiveren lentivirale vectoren vereist de zorgvuldigeafweging van bioveiligheid richtlijnen. In veel landen zijn deze vectoren geklasseerd als biologisch risicogroep 2. Voor meer informatie verwijzen naar http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Voorbereiding en virale infectie van de muis hippocampus Neuronen

1. Wassen dekglaasjes in een glazen petrischaal van 20 cm diameter (100 dekglaasjes per schaaltje) 1x in 70% ethanol gedurende ongeveer 30 minuten. Tot slot, voeg 100% ethanol (pa) voor 2 minuten. Verwijder de resterende ethanol en droog de dekglaasjes onder een steriele kap.
2. Bereid twee verschillende soorten media voor hippocampale neuron culturen: (a) Neurobasal medium met B27 1:50; (b) volledige medium: Neurobasal medium met B27 01:50, Glutamax 1:100, en N2 supplement 1:100. Steriele filtraat de media en bewaar ze in de cel incubator tot gebruik.
3. Een dag voor dissectie worden de dekglaasjes bereid door eerst een steriel 10 mm dekglaasje in elkgoed van een 4-well celkweek schotel. Daarna zorgvuldig jas elke dekglaasje met 80-100 ul 0,1% Poly-L-lysine en bewaar de gerechten in een incubator 's nachts.
4. Op de dag van dissectie en celkweek, beginnen wassen van de dekglaasjes driemaal met 100 ul HBSS en breng 100 ui Neurobasal medium aan elk dekglaasje. Leg de schalen in een incubator voor evenwicht (bijv. tijdens dissectie van muizen).

Ontleding

Wij voeren onze experimenten met muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Unie, zoals goedgekeurd door onze institutionele verzorging van dieren en het gebruik commissie.

5. Verwijder de totale hersenen en ontleden de hippocampus bilateraal.
6. Verwijder zorgvuldig de hersenvliezen en het weefsel dan de hippocampus en plaats elk in een 1,5 ml buis met 450 pi HBSS een zeepaardje. Sla het weefsel op ijs tot een voldoende hippocampus is geïsoleerd.

Cel cultuur

7. Voeg 50 ul 1% trypsine (Worthington) aan elke buis en incubeer ze in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Schud de buizen af. Om de spijsvertering reactie te stoppen, voeg 50 ul 1% trypsine-remmer aan elke buis en keer de buis een paar keer.
8. Breng alle weefsels tot 5 hippocampus een 15 ml Falcon buis toelaat de overdracht van vloeistof. Voeg B27-medium (a) tot een eindvolume van 5 ml.
9. Vermaal het weefsel met behulp van een brand gepolijste Pasteur glazen pipet door voorzichtig en neer te pipetteren. OPGELET: Vermijd luchtbellen!
10. Spin bij 400 xg gedurende 3 min, aspireren en resuspendeer de celpellet in 5 ml B27-medium (a).
11. Vermaal het weefsel opnieuw met de glazen pipet, en vervolgens twee keer met de hulp van een 1000 ui plastic filter tip. Voer deze zoals beschreven in stap 2.9 en 2.10.
12. Na de laatste centrifugatie, resuspendeer de cel pellet in 2 ml volledig medium (b) en vermaal cellen met een 200 ul plastic filter tip. Om de resterende celklonten scheiden van de single-celsuspensie, laat celklonten settelen voor 1-2 minuten.
13. Telling cellen en berekent het totale aantal cellen die nodig zijn voor virale infectie. Voor TED imaging 25.000 cellen per 10 mm dekglaasje.
14. Plating om 25.000 niet-getransduceerde cellen als controle wordt aanbevolen met dit punt.

Virale infectie

15. Breng de celsuspensie voor virale infectie in een frisse 15 ml falcon buis en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 x g.
16. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 300 ul medium (b)
17. Voeg een geschikte hoeveelheid infectieuze lentivirale TED expressievector deeltjes en laat de Falcon buis staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
18. Vul de buis met volledig medium (b) het eindvolume nodig voor plating (100 ul per 10 mm dekglaasje), Zuig het medium van de coverslip, en meteen plaats 100 pi celsuspensie op elke dekglaasje.
19. Leg de schalen in de broedstoof totdat alle cellen zijn neergestreken (ca. 2 uur) aandachtig en vullen de borden totdat ze bevatten 2 ml medium (b).
20. Laat neuronen groeien ten minste een week. Vervang 50% van het medium elke week.

3. Cultuur en virale infectie van de Muis Corticale gliale cellen

Voorbereiding

1. Begin met glia bereiden basaal medium (1:1 mengsel van DMEM/F12 met 10% FCS, 5% HS, 1% penicilline / streptomycine, 0,45% glucose) en bekleding van een T75 celkweek kolf met 4 ml 0,5 ng / ml Poly -DL-ornithine hydrobromide (PORN) (verdund in 150 mM boorzuur oplossing, pH 8.35). Na incubatie bij 37 ° C gedurende 2 uur of 's nachts, was de celkweek kolf driemaal met HBSS en voeg 18 ml glia basaal medium bevattende B27 1:50 en 10 ng / ml EGF. Equilibreer de celkweek kolf in de incubator (maximaal 3 uur).

Dissection

1. Wij voeren onze experimenten met muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Unie, zoals goedgekeurd door onze institutionele verzorging van dieren en het gebruik commissie.
2. Ontleden van de hersenen van een P5-P7 muis en verwijder de hippocampus en de hersenvliezen uit beide hemisferen, zoals beschreven in 2.5.
3. Ontleden de frontale cortex, snijd deze in verschillende kleine stukjes en verzamel ze in een 1,5 ml buis met HBSS. Bewaar de buis op ijs en ga verder met de celkweek deel.

Celcultuur

4. Breng alle weefsel van de buis naar een 15 ml falcon buis met behulp van een brand geslepen glazen pipet.
5. Voeg basismedium tot een eindvolume van 5 ml en vermaal het weefsel door pipetteren meerdere malen op en neer met een vuur gepolijste glazen pipet. Na centrifugatie bij 300 xg gedurende 3 min, zuig het medium en resuspendeer de celpellet in 5 ml basismedium.
6. Herhaal stap 3.5 tweemaal.
7. Na de third centrifugatie, resuspendeer de cel pellet in 2 ml glia basaal medium bevattende B27 (01:50) en 10 ng / ml EGF.
8. Titruate nogmaals en breng de celsuspensie op de voorbereide T75 celkweek kolf en laat cellen groeien gedurende 3-4 dagen.

Wassen van gliacellen (na 3-4 dagen in cultuur):

9. Was de cellen eenmaal met 10 ml PBS en krachtig tik of zachtjes raakte de kolf een paar keer met je hand, terwijl het strak in de andere hand. Door deze stap celafval en celgroepen uit de kweek worden verwijderd.
10. Zuig het PBS en voeg verse basaal glia medium met B27 (01:50) en 10 ng / ml EGF. Verder cultiveren de cultuur voor 5-7 dagen tot de cellen te bereiken 80% confluentie.

Splitsen, transductie en laatste zaaien van gliacellen:

11. Coat 10 mm dekglaasjes met 100 ul Poly-D-lysine (Stockoplossing: 0.1%, 1/50 verdund ad 20 ug / ml in PBS of HBSS) en incubeerze in een incubator 's nachts. Was de dekglaasjes drie keer met HBSS en voeg 100 ul basaal glia medium. Evenwicht dekglaasjes in de incubator (3 uur).
12. Was tweemaal het gliacellen met 10 ml PBS, zuig het PBS, en voeg 3 ml trypsine (TrypLE, onverdund). Trypsinize cellen voor maximaal 1 minuut. OPGELET: Vermijd over-behandeling met trypsine. Gewoonlijk meer dan 80% van de cellen losgemaakt na 1 min en dit is voldoende om miljoenen van gezonde cellen.
13. Stop de reactie door het toevoegen van 10 ml basaal glia medium, breng de celsuspensie om een ​​15 ml falcon buis, centrifuge bij 300 xg gedurende 3 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 5 ml basale glia medium.
14. Opnieuw draaien en aspireren zoals beschreven in stap 3.15, dan resuspendeer cellen in 5 ml Glia basaal medium.
15. Breng het vereiste aantal cellen een 1,5 ml buis. 10 ^{4-2x10 4} gliacellen zijn voldoende voor een 10 mm dekglaasje. Meestal is de schorsing volume te transduceren voor een 4-well-dish minder dan 200 pl. Voeg een geschikte hoeveelheid lentivirale TED expressievector deeltjes aan de cellen en incubeer deze bij kamertemperatuur 10 minuten. Vul dan de ophanging met basale glia medium tot het zaaien volume (100 pl per dekglaasje).
16. Zaad 100 pi geïnfecteerde cellen per dekglaasje en incubeer gedurende ongeveer 2 uur, voeg glia basaal medium met B27 1:50 en 10 ng / ml EGF tot een eindvolume van 2 ml.
17. Voor ideale kweekomstandigheden te gebruiken cellen voor experimenten op dag 3-7 na plating.

4. Generatie en cultuur van Reporter Cell Line

TED reporter cellijnen werden vastgesteld op basis van HeLa, BHK21, Hek293 en SH-SY5Y. Hier bieden wij het protocol voor HeLa-cellen, maar het protocol kan worden overgedragen naar een andere cellijn ook.

Generatie van stabiele HeLa-cellijn

1. Splits een wild-type HeLa-cellijn en overdracht 100.000 cel in een volume van 200 ul van een 1,5 ml buis.
2. Voeg een geschikte hoeveelheid lentivirale TED expressievector deeltjes aan de buis en incubeer de cel-virus suspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Dan zaad de cellen in een totaal volume van 2 ml medium (DMEM, 10% FCS, 1% penicilline / streptomycine) in een 30 mm schaal en incubeer gedurende 3 dagen.
3. Na een keer wassen met PBS, zuigen medium en voeg 500 ul trypsine (TrypLE, 2:03 in PBS). Incubeer gedurende ca. 3 min en dan stoppen de reactie door het toevoegen van 3 ml medium. Breng de suspensie over in een 15 ml falcon buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 3 minuten.
4. Resuspendeer de celpellet in 200 pl medium en opnieuw infecteren van de cellen met lentivirale deeltjes zoals beschreven in 4.2. Vervolgens zaadcellen in een T25 celkweek kolf in 10 ml medium.
5. Groeien cellen tot een confluentie van 60-80% wordt bereikt. Vervolgens splitsen de cultuur.

TED reporter cellijnen

6. TED reporter cellijnen kan worden behoudened in een standaard medium, zoals DMEM dat 5% of 10% FCS en 1% penicilline / streptomycine gebruikt.
7. Plaat een geschikt aantal cellen in een 4-putjes bevattende steriele 10 mm dekglaasjes (zie boven), bijvoorbeeld 10.000 tot 20.000 cellen per dekglaasje.
8. Groeien cellen gedurende ten minste twee dagen alvorens ze voor TED beeldvorming.

5. Voorbereiding voor de Live Imaging Procedure op een omgekeerde microscoop

1. 1. Voorverwarmen HEPES-Ringer tot kamertemperatuur en voeg D-glucose.
   2. Voorverwarmen de ACSF (zonder ^{Ca2 +} en ^{Mg2 +)} tot kamertemperatuur en voeg D-glucose. Beluchten de ACSF met carbogen gedurende 5 minuten. Voeg dan 1 M voorraadoplossingen van _CaCl2 en _MgCl2 tot eindconcentraties van 2 mM elk.
2. Start de live-imaging microscopen en alle computerprogramma's.
3. Start perfusie op een "dummy" imaging kamer gebracht en evenwicht de buis systeem.
4. Voorverwarmen de inline oplossing kachel en de beeldvorming kamer in de microscoop podium. Bevestig de beeldvorming kamer in een verwarmings-inzetstuk.
5. Evenwicht van het systeem tot 32-37 ° C voordat u de kleurstof laden te starten. LET OP: Om onbedoelde stroming van perfusie-oplossing in de microscoop systeem dat we gebruiken haar banden rond de doelstellingen en elastomeer silicone sheets (1mm) ter bescherming van de microscoop podium te vermijden.

6. Dye Laden van beide Cell Type

1. Resuspendeer 1 portie van Fluo5N-AM (zie 1.3) in 100 ul voorverwarmde imaging-oplossing (HEPES-Bel of ACSF).
2. Oplosbaar Fluo5N-AM in de imaging-oplossing (HEPES-Bel of ACSF) in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 90 sec.
3. Gebruik een vers 4 - of 24-well plaat en overdracht 400 ul voorverwarmde imaging oplossing voor een goed. Voeg de kleurstofoplossing aan dezelfde put naar 500 pi van een 5 uM oplossing te komen.
4. Plaats een dekglaasje voorzichtig met cellen (bv.10-18 mm in diameter) in de put, cellen naar boven.
5. Incubeer gedurende een passende tijd in een celkweek incubator bij 37 ° C (inmiddels beeldvorming instellingen voor te bereiden op de microscoop podium). Typische dye-laadtijden zijn voor neuronen en gliacellen 7-15 min en voor cellijnen 10-20 min.

CRUCIALE: Dye-laadtijd en kleurstof concentratie afhankelijk van het celtype, celdichtheid, en experiment-specifieke behoeften! Lange incubatietijden in aanwezigheid van de kleurstof kan schadelijk zijn voor de cellen, in het bijzonder primaire neuronen en primaire gliale cellen en dit is essentieel voor de respons op fysiologische stimuli. Lange incubatietijden (bijvoorbeeld 30 min) zijn alleen nuttig voor ER calcium lokalisatie experimenten de verdeling van ER calcium investigeren in subcellulaire structuren, bijvoorbeeld fijn neurieten of stekels. In sommige experimenten, kan een mengsel van 1/3 groeimedium met beeldvormingsoplossing helpen om cellen te beschermen tijdens Fluo5N-AMladen.

6. Direct, de overdracht van de dekglaasje aan een andere celcultuur putje met imaging-oplossing (HEPES-Bel of ACSF) en start de montage van de cellen in de beeldvorming kamer.

7. ER-calcium live cell imaging met een Inverted laser scanning confocale microscoop

1. Gebruik een kwast om hoog vacuüm vet op een imaging kamer. Het vet is nodig om het dekglaasje fixeren op de bodem van de perfusie kamer. We maken gebruik van self-made imaging kamers voor 10-12 mm dekglaasjes met een klein volume, waardoor hoge perfusie snelheden tot 15-voudig bufferuitwisseling per minuut. Een in de handel verkrijgbaar perfusie kamer voor 18 mm dekglaasjes, kunnen worden gekocht bij Warner instrumenten (RC-49FS). Deze kamer kan tevens gebied stimulatie van neuronen.
2. Pak de dekglaasje met Fluo5N geladen cellen en voeg een druppeltje weergaveoplossing (50-100 ul) op de cellen om cellen bedekt met weergaveoplossing houden.Draai het dekglaasje ondersteboven en monteer de cellen in de beeldvorming kamer. Om het dekglaasje druk in de silicium-lijm, gebruik dan een wattenstaafje (bijv. Q-tips).
3. Veeg resterende buffer van de bodem van het glas dekglaasje met wattenstaafjes. LET OP: voorzichtig wegvegen restvocht bij gebruik van een olie-objectief met een hoge numerieke apertuur voor hoge-resolutie imaging. Overblijvende zout wordt best verwijderd door water. Toevallige uitstrijkje vet kunnen worden verwijderd met aceton of pure ethanol.
4. Exchange de "dummy" beeldvorming kamer met de experimentele beeldvorming kamer. Was de cellen gedurende 5-10 minuten door continue perfusie.
5. Was de cellen gedurende 5-10 minuten door continue perfusie.
6. Voor het selecteren van cellen gebruiken een minimale hoeveelheid laser belichting, hoge scansnelheden (2-4 Hz), een klein beeldformaat, en een high gain.
7. LET OP: Voor de selectie van Fluo5N-gelabelde cellen niet meer dan licht of directe verlichting met epifluorescen gebruikent licht. Heldere verlichting van Fluo5N/Ca ^{2 +} complexen veroorzaakt het volledig verlies van ER-specifieke fluorescentie binnen 2-4 sec (figuur 5).
8. Stel de microscoop volgens de geplande experiment. Ter oriëntatie zijn representatieve gevallen voor beeldvorming met verschillende TED vectoren in tabel 1. Voor omgekeerde confocale laser scanning microscopie, gebruiken we een Olympus IX81 microscoop gecombineerd met een FluoView 1000 confocale systeem dat is voorzien van diode lasers (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 mW) en een spectrale detector systeem.
9. Aan het begin van het experiment document de cellen van belang bij hoge-resolutie x, yz image stacks.
10. Presteren x, yt beeldvorming om ER calciumdynamiek monitoren onder de specifieke experimentele omstandigheden. Typische waarden voor ons systeem worden in tabel 2.
11. Monitor veranderingen in ER calcium onder continue perfusie met imaging-oplossing. Typische buffer wisselkoersen zijn exemplarily: (a) wassen en opslag cel depletie van SERCA block: 1,5 ml / min, (b) ATP / DHPG stimulatie: 3 ml / min.
12. Acquire digitale beelden bij voorkeur met 12-bit (4096 grijswaarden). Voor parallelle beeldvorming van Fluo5N/Ca ^{2 +} en RFP, 8-bits afbeeldingen (256 grijswaarden) kan uw systeem te redden van data overflow.
13. Slaan wonen cel tijdreeksen afbeeldingen (x, yt) of 3D-beeld stacks (x, yz) (voor cellulaire distributie van Fluo5N/Ca ^{2 +} complexen) in een ImageJ compatibel formaat (bijv. TIFF).

8. Image Processing en data-analyse

1. Open de afbeelding stapel in de ImageJ programma. In het geval van multicolor beeldvorming, splitsen de RGB-kanalen wanneer gevraagd door ImageJ.
2. Identificeer uw regio ('s) van belang (ROI) door een zorgvuldig onderzoek van het beeld stacks (bijv. met behulp van een intensiteit versus tijd grafiek)
3. Gebruik de Time-Series Analyzer plugin om het uitlezen van de gemiddelde pixelintensiteit in een ROI (F _rauw). Depending op doel, tekenen ROI rond ofwel de volledige ER of kleine gebieden van de ER bv ER van dendrieten van perifere cel regio. Ook 1-3 ROI in gebieden zonder cellen voor achtergrond aftrekken.
4. Bereken de gemiddelde achtergrond fluorescentie (F _b) door berekening van de gemiddelde fluorescentie waarde van de achtergrond ROI en aftrekken van de achtergrondwaarde F _b van de F _ruwe waarden van de F _roi waarde te krijgen.
5. Bereken F _0, de basale fluorescentie van de cellen, door berekening van de gemiddelde waarde van tien tot 30 fluorescerende waarden voor elke ROI in een rusttoestand.
6. Bereken de achtergrond gecorrigeerde relatieve veranderingen in fluorescentie van AF / F ₀ door de formule:

7. Aanwezig relatieve veranderingen in fluorescerennce als een spoor met AF / F ₀ voor de Y-as en tijd voor de X-as.

Resultaten

Dit protocol voorziet in een niet-verstorende benadering voor directe beeldvorming van gratis ER calcium. Lage affiniteit synthetische ^{Ca2 +} indicatoren worden vrijgegeven en gevangen in het ER lumen met behulp van een ER gerichte recombinante esterase enzymactiviteit. Betere belading van de Ca ^{2 +-indicator} kleurstoffen aan het ER lumen maakt een directe en snelle beeldvorming van ER calcium winkel dynamiek.

Celtypen voor TED

De haalbaarheid v...

Discussie

De voor-en nadelen van de TED-methode zijn uitgebreid besproken in recente publicaties ^34,35. Vergeleken met andere werkwijzen die hierboven beschreven TED omzeilt het probleem te verstoren en perfuseren van de cellen. Bovendien, twee aspecten moeten worden benadrukt. Het beginsel van TED ER calcium imaging (1.) De gerichte expressie van actief carboxylesterase in het ER lumen met behulp van TED vector constructen en (2.) Rationeel en preferentiële afgifte van laag-affiniteit synthetische AM-esters of vereist...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham's F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.