Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

Samenvatting

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren in Drosophila: Het klimmen / schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis assay waarmee de functionele effecten van DA neuronen degeneratie en tyrosine hydroxylase immunokleuring die wordt gebruikt om DA neuronen in volledige hersenen mounts identificeren en tellen bestuderen.

Samenvatting

Drosophila melanogaster is een waardevolle modelorganisme om veroudering en pathologische degeneratieve processen te bestuderen in het zenuwstelsel. De voordelen van de vlieg als een experimenteel systeem omvatten de genetische traceerbaarheid, korte levensduur en de mogelijkheid te observeren en kwantitatief analyseren van complexe gedrag. De expressie van ziekte-gebonden genen in specifieke neuronale populaties van de Drosophila hersenen, kan worden gebruikt om menselijke neurodegeneratieve ziekten zoals Parkinson en Alzheimer ⁵ model.

Dopaminerge (DA) neuronen zijn de meest kwetsbare neuronale populaties in het verouderen menselijke hersenen. Bij de ziekte van Parkinson (PD), de meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening, de versnelde verlies van DA neuronen leidt tot een progressieve en onomkeerbare achteruitgang van motorische functie. Naast leeftijd en blootstelling aan giftige stoffen, is het verlies van DA neuronen versterkt door specifieke mutaties in de coderendeof promotorregio's van verschillende genen. De identificatie van dergelijke PD-geassocieerde allelen verschaft de experimentele basis voor het gebruik van Drosophila als een model voor neurodegeneratie van DA neuronen in vivo. Bijvoorbeeld, de expressie van de Parkinson-gerelateerde humane α-synucleine gen in Drosophila DA neuronen recapituleert sommige elementen van de menselijke ziekte, bijv. progressief verlies van DA neuronen en dalende motorische functie ^2. Dienovereenkomstig is dit model met succes gebruikt om potentiële therapeutische targets te identificeren in PD ^8.

Hier beschrijven we twee assays die gewoonlijk zijn gebruikt om leeftijdsgebonden neurodegeneratie van DA neuronen te bestuderen in Drosophila: a climbing assay gebaseerd op het schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis reactie en tyrosine hydroxylase immunokleuring van hele volwassen hersenen zwellend aantal DA neuronen toezicht op verschillende leeftijden. In beide gevallen, in vivo expressie van UAS tspecifiek ransgenes in DA neuronen worden bereikt door een tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver lijn ^{3, 10.}

Inleiding

De specificiteit van de assays beschreven gebaseerd op het gebruik van een Gal4 vlieg lijn die de regulerende sequenties van de tyrosine hydroxylase gen specifieke expressie in dopaminerge neuronen ³ bereiken exploiteert. Tyrosine hydroxylase katalyseert de eerste en snelheidsbepalende stap in dopamine synthese. TH immunoreactiviteit in de volwassen vliegen hersenen overlapt met dat van dopamine, waardoor TH een goede kandidaat om DA neuronen in vivo (zie voorbeeld ⁶⁾ te identificeren. Bovendien, het expressiepatroon van THGal4 is specifieker dan andere Gal4 lijnen zoals DdcGal4 die regulerende sequenties bevat van het dopa decarboxylase gen en rijdt transgene expressie niet alleen in DA neuronen, maar ook in serotonerge neuronen en gliacellen subsets van ³ .

Feany en Bender (2000) voor het eerst waargenomen dat de pan-neuronale expressie van het Parkinson-gerelateerde menselijke α-synucleïne gen versnelt het progressief verlies van startle-geïnduceerde negatieve geotaxis gedrag in Drosophila. We hebben soortgelijke resultaten met behulp van de DA-neuron specifieke THGal4 lijn naar de expressionof een α-synucleïne transgen ¹⁰ rijden geobserveerd en gebruikt dit functionele uitlezing aan de neuroprotectieve rol van de Nrf2 pathway in deze studie Drosophila model van PD ^14. De specifieke assay beschreven wordt aangepast van ² en ^3.

De Drosophila hersenen bevatten meer dan 100 DA neuronen, gerangschikt in ten minste 5 verschillende clusters (PPL1, PPL2, PAL, ppm1 / 2, ppm3) die volledige hersenen mounts kan worden gevisualiseerd door confocale microscopie (zie voorbeeld ¹¹ en ^7). Het is nog steeds controversieel of het aantal DA neuronen in de Drosophila hersenen afneemt met de leeftijd ^{9, 11,} maar wordt leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie waargenomen bij vliegen wanneer PD-gebonden genen gemuteerd / overexpressie op menselijke ziekten modelleren5. De expressie van humaan α-synucleïne in DA neuronen heeft zo'n effect en derhalve is gebruikt als een model voor PD. Hier beschrijven we een test voor DA neuronen tellen in hele brein mounts met TH als een cel marker. Deze test is aangepast van ¹³ en ^10.

Protocol

1. Schrikreactie-geïnduceerde Negatieve geotaxis Assay

1. Selecteer vliegen van het gewenste genotype, ze scheiden naar geslacht, willekeurig groeperen ze in cohorten van 20-30 dieren en draai ze in nieuwe voedingsmiddelen flacons om de 2-3 dagen; testen elke set van vliegen (dwz leeftijd gematchte cohorten, een cohort / genotype) minstens een keer per week.
2. Dertig minuten voor de negatieve geotaxis test, verdoven de vliegen met CO ₂ en plaats ze in de pre-gelabelde plastic buizen met twee lege flesjes voedsel (zie Materialen tabel) toegetreden bij hun openingen met doorzichtige tape (kamer afmetingen: 19 cm x 2.85 cm). In onze tests gebruiken we meestal 25 vliegen / buis.
   Opmerking. De hersteltijd verdoving kan variëren van enkele minuten tot enkele uren (bijvoorbeeld O / N) en moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke geteste genotypes.
3. Markeer verschillende hoogtes (van 1 tot 20 cm) op een stuk vloeipapier en tape het papier op een verticale surface, loodrecht op de bank.
4. Plaats de buizen in de voorkant van het papier: de buizen moet alles uitgelijnd en zo dicht mogelijk bij het papier om nauwkeurige hoogtemeting toestaan.
5. Plaats de digitale camera (zie de "Special Equipment" tabel) voor de buizen, op een afstand van 20-30 cm van het papier, op een stand (bijv. een pipet tip doos), selecteert u de optie "film" en start opname, op dit moment moet je ook beginnen met een timer voor het bijhouden van de tijd tussen opeenvolgende trials te houden.
6. Laat de vliegen te verzamelen op de bodem van de buis door op de buis gedurende enkele seconden (bijvoorbeeld 10 seconden). Deze stap moet consequent worden uitgevoerd (dat wil zeggen dezelfde duur, dezelfde kracht, dezelfde operator) het hele experiment.
7. Record vliegt 'bewegingen met de digitale camera gedurende 10 sec.
8. Herhaal de stappen 1,5-1,7 veertien keer op een-min intervallen.
9. Analyseren van gegevens:
   1. Tel het aantal vliegen die boven de2 cm merk na 10 sec door visuele inspectie van de opgenomen films.
      Opmerking: In onze test omstandigheden deed de vliegen 'negatieve geotaxis gedrag niet lang na de eerste 10 seconden na het verrassende (dwz vliegen begon bewegen in alle richtingen 10 sec na verrassende hen). De minimale afstand beklommen door controle vliegen (dus 1 week oud vliegt uiting van de THGal4 driver, zie legenda van figuur 1) in dit tijdvenster was 2 cm. Zo gebruikten we de 2 cm merk als een referentie voor het analyseren van de klimactiviteiten van vliegen van verschillende leeftijden en genotypes 10 seconden na het starten van het gedrag. Deze parameters vereisen aanpassing rekening met verschillen in het gedrag van de geteste vliegen (door bijvoorbeeld verschillende genetische achtergronden of laboratoriumomstandigheden). Merk op dat in onze testomstandigheden, alle geteste genotypes slechter uitgevoerd of op dergelijke wijze aan de vliegen van de controle genotype.
   2. Bereken het gemiddelde van de resultaten van de vijftientrials.
   3. Express gemiddelde als percentage van het totale aantal vliegen in de buis (= klimmen% activiteit), het aantal herhalingen (N) wordt gegeven door het aantal geteste per genotype onafhankelijke cohorten
   4. Beoordelen statistische significantie tussen verschillende genotypen in de tijd. Dit kan worden bereikt met een Student's t-test (bij vergelijking van twee genotypen) of een 2-weg ANOVA analyse gevolgd door Bonferroni post hoc test (bij het ​​uitvoeren van meerdere vergelijkingen) met commerciële software zoals GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA).

Nota

Wij voeren al onze tests op hetzelfde tijdstip van de dag, bij kamertemperatuur en onder dezelfde lichtomstandigheden. Houd de vliegen in een 12 uur licht / donker cyclus omgeving raadzaam te controleren voor het effect van circadiaanse ritmes van de vliegen locomotorisch gedrag.

2. Tyrosinehydroxylase ImmunofluorescentieAssay van Whole Brain Mounts

Oplossingen en buffers

Fixatief: 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)

Wasbuffer 0,1% Triton X-100 in PBS

Blocking buffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 en 0,5% BSA

Montage media: Mowiol-Dabco (zie protocol in Harlow E, Lane D., Antibodies-A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988 beschreven))

Procedure

1. Zet vliegen in een dissectie schotel gevuld met 70% EtOH gedurende ongeveer 1 min. tot de cuticula was te verwijderen.
2. Transfer vliegt naar een andere dissectie schotel gevuld met ijskoude PBS.
3. Ontleden van de hersenen:
   1. Plaats het vliegen met de ventrale zijde naar boven (optioneel: verwijder vleugels en poten).
   2. Trek het hoofd van het lichaam: gebruik een set van tang omvasthouden aan het lichaam en een ander te houden aan de cuticula onder oogletsel de hersenen te voorkomen
   3. Verwijder de slurf.
   4. Hou het hoofd cuticula aan weerszijden van de spleet opengelaten na verwijdering van de zuigorganen en trek in tegengestelde richting totdat de hersenen verwijderd uit de kop capsule.
   5. Verwijder alle cuticula van de hersenen.
   6. Verwijder alle lucht gevulde tracheaweefsel, dit zal voorkomen dat de hersenen van zweven tijdens de volgende incubatie stappen.
4. Snijd een paar millimeter van de punt van een P-200 pipetpunt en equilibreren met een 0,1% Triton X-100/PBS oplossing
5. Het bereide P-200 pipet, breng de hersenen om een ​​0,5 ml Eppendorf buis gevuld met 0,5 ml van 4% PFA / PBS en op ijs bewaren totdat de dissectie is voltooid.
6. Bevestig de hersenen bij RT gedurende 20 min: breng een zachte rotatie door de invoering van de Eppendorf buisjes op een rek en het plaatsen van het rek op een nutator.
7. Verwijder het fixeermiddelmet behulp van een P-1000 micro pipet, voeg 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS, meng door omkeren en laat incubeer gedurende 1 min.; herhaal deze wasstap eenmaal.
8. Verwijder de buffer van de tweede wasbeurt, voeg 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS en laat incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min; herhaal deze stap tweemaal.
9. Verwijder de wasbuffer en laat de hersenen incuberen in blokkerende buffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 en 0,5% BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
10. Incubeer de hersenen met een 1:100 verdunning van anti-TH-antilichaam (zie "Tabel reagentia") in blockingbuffer, gedurende twee dagen bij 4 ° C onder zachtjes rotatie (zie stap 2.6.).
11. Herhaal wasstappen 2.7. en 2,8 ..
12. Equilibreren van de hersenen met een 1:200 verdunning van secundair antibodyin blokkerende oplossing gedurende twee dagen bij 4 ° C onder zachtjes rotatie.
13. Herhaal wasstappen 2.7. en 2,8 ..
14. Bereid de montage dia zie figuur 2A:
    1. Eendd 2 X 25 pl druppels montage media om een ​​dekking van glas (24 x 60 mm, nee. 1.5).
    2. Plaats twee dekglaasjes (18 x 18 mm, geen. 2) op de montage media verlaten van een gat in het midden van de dia en laat drogen.
    Mee. Controleer de monsterhouder op het podium van de confocale microscoop. U kunt de dekking van glas te maken van dezelfde grootte van een 25 x 75 mm dia door het aanbrengen van een 22 x 22 mm 1.5 dekglas aan een van de uiteinden (gebruik nagellak en tape).
15. Verwijder de wasbuffer, voeg 50 ul van fixeermiddelen en laat de hersenen equilibreren om vóór en neer te pipetteren.
16. Met behulp van een cut P-200 pipet tip (zie stap 2.4) overdracht van de hersenen om de dia in de ruimte tussen de twee dekglaasjes en bedek ze met een dekglaasje nee. 1.5 (zie Figuur 2A, te oriënteren de hersenen op de dia zie ^7).
    Opmerking: de monsters worden gemonteerd tussen twee dekglaasjes tot visualisatie van zowel de voorste en de poste toestaanrior kant van de hersenen.
17. Vult de hele ruimte tussen de deksel glazen met montage media; pipet van de ene hoek naar de lucht te verwijderen, laten drogen en afdichting met nagellak.
18. Om het aantal dopaminerge neuronen te beoordelen in een bepaald cluster verwerven van een reeks optische doorsneden langs de z-as met een 1,0 um stapgrootte met behulp van een confocale microscoop (de anatomische identificatie van dopaminerge clusters in Drosophila volwassen hersenen zie ^7).

Resultaten

We hebben de assays beschreven de rol van de stress beschermende Nrf2 signaalweg in een Drosophila model van PD ^14. Dit model is gebaseerd op de expressie van het humane α-synucleine gen in DA neuronen met een TH Gal4 driver ^{2, 10.}

Figuur 1 toont een representatief resultaat van een schrikreactie geïnduceerde negatieve geotaxis (klimmen) test bij mannelijke vliegen die verschillende transgenen onder controle van de TH Gal4 driver. Alle geteste ...

Discussie

De assays beschreven een nuttige benadering van de rol van specifieke genen te bestuderen signaaltransductiewegen of kleine verbindingen in het onderhoud van DA neuronen bij veroudering en verschillende ziekte-gekoppelde genetische achtergronden (beoordeeld in ^5).

De schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis gedrag van Drosophila is uitgebreid gebruikt als een functionele uitlezing voor de functionaliteit van DA neuronen in verschillende genetische achtergronden, vooral i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Konijn anti-tyrosine hydroxylase antilichaam	Millipore	AB152
Donkey TRITC-gelabeld anti konijn IgG antilichaam	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
Apparatuur
Polystyreen vials	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Digitale camera	Canon	PowerShot A3100IS (model)	12.1 Megapixels 4X Optische Zoom
Glazen dekglas nr. 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Maten: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glazen dekglas nr. 2	VWR	48368-040	Maat: 18 x 18 mm
Dissectie schotels	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Grootte: 30 mm O.D.
Dumostar nr. 5 pincetten	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomicroscoop	Carl Zeiss	Stemi 2000 (model)
Confocale microscoop	Leica	SP2 of SP5 (model)
Materiaaltafel.