Methodenartikel

A Novel Hoge-resolutie

14.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50363

⸱

16 juni 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Brain Tumor Research Centre, Hospital for Sick Children, Toronto Medical Discovery Tower, 2Ontario Cancer Institute, Princess Margaret Hospital, 3Neurosurgery, Toronto Western Hospital

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een roman In vivo Beeldvormende techniek die koppels fluorescerende chimere muizen met intracraniële ramen en hoge-resolutie 2-foton microscopie. Dit imaging platform helpt studies van dynamische veranderingen in het hersenweefsel en microvasculatuur, op een single-cell niveau, na pathologische beledigingen en is aanpasbaar aan intracraniële drug delivery en distributie te beoordelen.

Samenvatting

We hebben met succes geïntegreerd eerder vastgestelde Intracranial venster (ICW) technologie 1-4 met intravitale 2-foton confocale microscopie een roman platform dat zorgt voor directe visualisatie op lange termijn van weefsel structuur verandert intracranially ontwikkelen. Imaging bij een enkele cel resolutie in een real-time mode biedt aanvullende dynamische informatie geven dan die welke door de standaard eindpunt histologische analyse, die uitsluitend wordt gekeken naar 'snap-shot' dwarsdoorsneden van weefsel.

Oprichting van deze intravitale beeldvormende techniek in fluorescerende chimere muizen, zijn we in staat om het vier fluorescente kanalen tegelijk. Door het opnemen van fluorescent gelabelde cellen zoals GFP + beenmerg, is het mogelijk om het lot van deze cellen studie op lange termijn migratie, differentiatie en integratie in weefsel te volgen. Verdere integratie van een secundaire reporter cel, zoals een mCherry glioom tumor lijn, zorgt voor kenmerkenterization van cel: cel interacties. Structurele veranderingen in het weefsel micro kunnen worden gemarkeerd door de toevoeging van intra-vitale kleurstoffen en antilichamen, bijvoorbeeld antilichamen en CD31 gelabeld dextran moleculen.

Bovendien beschrijven we de combinatie van onze ICW beeldvorming model met een klein dier micro-bestraler dat stereotactische bestraling geeft, het creëren van een platform via welke de dynamische veranderingen weefsel die optreden na toediening van ioniserende straling kan worden beoordeeld.

Huidige beperkingen van ons model zijn penetrantie van de microscoop, die beperkt is tot een diepte van 900 urn vanaf de sub corticale oppervlak, weergave beperkend voor de dorsale as van de hersenen. De aanwezigheid van het schedelbot maakt de ICW een uitdagende technische procedure in vergelijking met de meer gevestigde en benut kamermodellen momenteel gebruikt borstweefsel en vetkussentjes 5-7 bestuderen. Bovendien, de ICW provides veel uitdagingen bij het optimaliseren van de beeldvorming.

Inleiding

Een beter begrip van de structurele en biologische veranderingen die naar aanleiding van verschillende pathologieën ontstaan ​​in de hersenen en therapeutische interventies is essentieel voor het verbeteren behandelingsstrategieën. Een van de uitdagingen op het bestuderen van deze structurele en biologische veranderingen, met name wat de intracraniële pathologieën, is de ontoegankelijkheid van weefsel en het onvermogen om de temporele evolutie en dynamisch verloop van veranderingen in een in vivo omgeving te bestuderen. De opwekking van het "venster" technologie eerder succesvol gebleken bij de behandeling zachte weefsel veranderingen door tumorontwikkeling 5-7. Ontwikkeling van ICW modellen blijkt een grotere technische uitdaging vanwege de noodzaak om het schedelbot zonder beschadiging op aanzetten infectie in de onderliggende cerebrale weefsel. Vorige kranten hebben geprobeerd om de schedel aan het weefsel 8-10 visualiseren echter dun, in een hoge resolutie duidelijk im producerenleeftijden volledige verwijdering van de schedel bot is vereist 11. Herhaal lange termijn imaging (30 dagen +) is pas sinds kort een haalbare optie door beeldvorming 1,11 geworden, hebben eerder kortere frames bestudeerd 5.

In het afgelopen decennium een ​​belangrijk doel is om de herkomst van neovasculatuur volgende pathologische stimuli toe te lichten, in het bijzonder wanneer tumorvorming en progressie van nieuwe therapeutische doelwitten voor de behandeling van tumoren bieden. Veel controverse blijft rond de bron van nieuwe bloedvaten in de hersenen tijdens tumorontwikkeling of na bestraling. Traditioneel vascularisatie wordt geacht plaats te vinden door middel van angiogenese, een proces waardoor nieuwe vaartuigen vormen de kiemen of reeds bestaande schepen 12. Meer recente studies suggereren echter dat de eerder aangenomen embryonale vasculogenese proces een belangrijke rol kan spelen in de vorming van pathologische vasculatuur. Vasculogenesis omvat de werving van de volwassen angioblast tegenhangers uit het beenmerg, die op hun beurt worden vervolgens direct betrokken bij de vorming van het nieuwe schip endotheel 12-14. Accumuleren bewijsmateriaal wijst erop dat endotheliale voorlopercellen worden gemobiliseerd uit het beenmerg naar de novo bloedvatvorming in reactie op oncogene bemiddelaars 15-17 initiëren. Echter, deze studies tegenstrijdig bewijs voor de rechtstreekse bijdrage van deze beenmerg afgeleide cellen (BMDCs) naar vat endotheel met procentuele bijdrage varieert met het type pathologische stimulus en de respons op de behandeling 18-21.

Daarom vaststelling reproduceerbare experimentele methoden die hoge-resolutie intravital imaging zorgen voor herhaalde langdurige studie van het proces van integratie in BMDC tumorvasculatuur en respons op therapie onschatbare waarde. Standaard histologische technieken niet aan de dynamische informatie verstrekkenvereiste informatie de lange-termijn overleving, differentiatie en integratie van de cellen die tot neovasculatuur en derhalve niet definitief aantonen van de mechanismen van cel interactie bepalen.

We hebben aangetoond in onze experimentele benadering dat er een verschillende mate van BMDC recruitment zowel na intracraniale ioniserende straling en tumorgroei, een recruitment dat echter is, pathologie plaatsgebonden en geen invasie van het gehele weefsel intracraniale 11,22. We hebben aangetoond dat de werving volgt een tijdgevoelige patroon blijkt uit het repeterend afbeelden van een enkel dier 11,22. Ook in vivo beeldvorming kan ook waardevolle inzichten in tumorcellen mimicry waarbij fluorescent gelabeld tumorcellen kunnen worden afgebeeld en gevolgd met een intra-vitale CD31 antilichaam voor endotheelcellen de mogelijkheid tumorcel transdifferentiatie rechtstreeks vormen eigen endotheel markeren.

De veelzijdigheid van het model wordt versterkt door het vermogen om fluorescent beeld 4 kanalen, een exhaustieve aantal combinaties voor de studie van verschillende cellulaire en biologisch proces. Wij zijn in staat om intravitally afbeelding GVB (blauw), GFP (groen), Cherry / RFP (rood), en Alexa647/APC (ver-rood), tegelijkertijd in een enkel veld herhaaldelijk in de tijd. Onderzoekers kunnen genetisch modificeren cellen fluorochromen voor elk van de kanalen en aankoop kleurstoffen en antilichamen uit naar structurele veranderingen van bijzonder belang te benadrukken. Tot op heden kleurstoffen en antilichamen gebruikt in studies omvatten CD31 en dextran die zowel highlight microvasculature en veranderingen in weefsel 1,11,23,24, hoewel we gebruik gemaakt van de ver-rode kanaal hiervoor beide beschikbaar voor gebruik in de andere kanalen genoemd. Zo hebben andere kleurstoffen zoals Sytox Orange, die gebieden blootleggen van apoptose en markers zoals die van het bedrijf Visen, spe geweestciaal ontworpen voor gebruik in vivo. Naar aanleiding van de vier meest gebruikte fluorescerende genoemde kanalen, kan een tweede harmonische generatie (SHG) kanaal worden toegevoegd en geoptimaliseerd om het imago van de endogene collageenvezels van het model 7, het visualiseren van de kelder membraan rond vaatstelsel.

Het aanpassingsvermogen van ons model, evenals de bovengenoemde cel-cel interacties aan te tonen, hebben we in staat om drugs-cel interacties te bestuderen geweest. We hebben gekeken naar drug-remmers zoals AMD3100, een SDF-1-remmer, en haar rol in de signalering netwerken die betrokken zijn bij de werving BMDC 11. Op dezelfde manier hebben we genetisch gemanipuleerde uit U87 glioma xenografts cellen om VEGFTrap, een VEGF-remmer 25, uitdrukken in samenhang via een IRES een GFP-molecuul. Door RFP + BM kunnen wij de rol VEGF op de rekrutering van BMDCs de vasculatuur bestuderen. Meest recent hebben we het model om drug kinetiek studeren benut kijken naar de mechanism achter de tumor-afbakenen drug Fluorescein 26, op cellulair niveau. Door het gebruik van een speciaal gebouwd in het huis kleine dieren stralingapparaat we kunnen stereotactische geleverde straling te integreren om de respons van zowel tumor en BMDCs de behandeling te beoordelen zijn.

Door het gebruik van onze nieuwe intravitale beeldvormende methode onderzoekers inzicht te krijgen in het eencellige real-time veranderingen die optreden in de verschillende pathologieën en systemen, medeplichtigheid aan de opheldering van de vele functionele en biologische eigenschappen van het weefsel verandert.

Protocol

ALLE DIEREN WERK IS UITGEVOERD ONDER EEN DIER ZORG EN GEBRUIK COMITÉ goedgekeurde protocol en uitgevoerd in overeenstemming met alle geldende richtlijnen, REGELS EN regelgevende agentschappen.

Voor het oplossen van problemen referentie Tabel 2.

1. Bone Marrow Reconstructie (optioneel) Figuur 1 (30 min prep, 5 min per muis)

Alle operaties moeten worden uitgevoerd met strikte aseptische techniek met geautoclaveerd steriele apparatuur.

Een donor muis wil reconstrueren drie gastheer muizen.

  1. Algemene Chirurgie ontvanger NODscid muizen en positie, met lood om het hoofd te beschermen, in het midden van de Gammacell 40 'afperser' bestraler.
  2. Bestralen NODscid muizen met 2,5 Gy totale lichaamsbestraling (TBI).

Kritische stap: Optimalisatie van TBI kan nodig zijn als gevolg van variatie in de dosis die nodig is voor voldoende gastheerimmuunsysteem cell uitputting in verschillende muizenstammen.

Pauze punt: Host muizen kunnen worden bestraald op voorhand, maar moet worden gebruikt binnen 24 uur van bestralen.

  1. Euthanaseren donormuizen volgens de richtlijnen institutionele dier zorg commissie. Reinig de achterpoten en verwijder het scheenbeen en het dijbeen van beide, het strippen van alle overtollige weefsel uit de botten (figuren 1ai, 1aii).

Kritische stap: fibulaire botten zijn niet haalbaar voor gebruik door zeer smalle lumen.

  1. Neem het lagerhuis aan beide uiteinden van vier gewonnen botten en spoel ze uit met behulp van een 22 G naald en 1 ml steriel PBS tot ze wit uiterlijk (figuur 1aiii). Referentie Tabel 2.
  2. Meng de uitgepakte beenmerg (BM) vering goed en trekken 300 pl in drie 27 G tuberculine naalden. Onttrokken BM moet ongeveer 2 x 10 7 cellen bevatten enis genoeg voor 3 gastheer muizen reconstructies. Referentie Tabel 2.
  3. De suspensie injecteren in de laterale staartader van drie eerder bestraalde NODscid muizen uit stap 1.1 (Figuur 1b). Referentie Tabel 2.

LET OP: Om de steriliteit van de BM controleren ingespoten wij raden plating de resterende BM en cultuur voor 24 uur te controleren op infecties. Doodsoorzaak op dit punt is in de nieuwe infectie gereconstitueerde muizen.

2. Intracraniële Window Generation - Figuur 2 (30 min per muis)

Alle operaties moeten worden uitgevoerd met strikte aseptische techniek met geautoclaveerd steriele apparatuur en onder een warmtelamp voor dieren warm (Figuur 2A) te houden.

  1. Algemene Chirurgie NODscid ontvangende muizen met IACUC goedgekeurde verdoving Avertin IP injectie van 0,5 mg / g en positie met lood om het hoofd te beschermen, in het midden van deGammacell 40 'afperser' bestraler. Haal haar uit de hoofdhuid. Daarnaast gelden tear gel corneale uitdroging te voorkomen.
  2. Clean hoofdhuid eerst met Betadine oplossing en daarna met alcohol, dan een insnijding aan het middelpunt van de oren tot net boven de ogen. Verwijder de hoofdhuid 3 mm aan weerszijden van de eerste incisie, het blootstellen van de schedel en monumenten van de schedel oppervlak (zie 2BI).
  3. Elevate het periost door het injecteren van 2% lidocaïne: epinefrine-oplossing en ontleden weg van de schedel oppervlak (zie 2BII).
  4. Met behulp van 2.7 mm trephine boor, verzwakken een 2.7 mm cirkel van de schedel boven de cortex van de rechter hersenhelft tussen lambda en bregma. NOOIT het bot NIET penetreren met de boor (figuur 2Biii). Referentie Tabel 2.

Kritische stap: als boor gaat door de schedel de hersenen oppervlak zal beïnvloeden van resultaten worden beschadigd met extra trauma. Daarnaast zal overmatig bloeden optreden voorkomen dat een helder venster van wordt gegenereerd.

  1. Verwijder het verzwakte bot flap met dissectie pincet en tandheelkundige haak en weloverwogen, maar beheerste kracht (figuur 2Biii).
  2. (Optioneel) Indien bekeken door tumor pathologie, injecteer gekozen tumorcellijnen (met fluorescente reporter-gen) in het midden van het gegenereerd in stap 2.5.
    1. Laad 10 pl 30 G Hamilton spuit met celsuspensie en lading naald in een stereotactische frame.
      Kritische stap: Aantal cellen moeten worden geoptimaliseerd voor tumorcellen in gebruik en tijdpad groei vereist. Voor U87 culturen gebruiken we 2 x 10 5 cellen in 10 pi per muis.
    2. Laad de muis op de digitale stereotactische kadreren de naald naar het middelpunt van het venster gegenereerd.
    3. Lagere naald totdat deze tegen de corticale oppervlak en de digitale coördinaten resetten.
    4. Laagre van de naald tot 3,2 mm in de corticale weefsel en injecteer op 3 mm diep.
    5. Trekken naald langzaam verwijder vervolgens de muis uit het frame.
      Kritische stap: Spuit oplossing over de duur van 1 min en laat de naald op zijn plaats na de injectie om ervoor te zorgen terug verminderde doorstroming.
      Kritische stap: Indien er slechts kleine bloeding is opgetreden spoelen met een steriele zoutoplossing gedurende 1-5 minuten tot oppervlakkige bloeden te stoppen. Ga verder met de volgende stappen.
  3. Bevochtig hersenen oppervlak met een druppel steriele PBS het hersenweefsel geïrrigeerde houden.
  4. Float a 3 mm dekglaasje op de hersenen oppervlak volledig af te dichten rond de mm venster 2.7 gegenereerd. Referentie Tabel 2.
  5. Droge omliggende schedel bot dan van toepassing Vetbond om de hele schedel bloot te reseal scalp weefsel om de schedel bot en het dekglaasje op zijn plaats. NOOIT een overmaat niet van toepassing want het zal lekken onder het glas en verminderen de beeldvorming mogelijkheden.
  6. Mix verse tandheelkundige acryl poeder en oplossing, ongeveer 30% (w / v), en passen over de bovenkant van de Vetbond. Om een goede afdichting te garanderen overlappen de acryl lichtjes op de glazen dekglaasje rand (figuur 2Biv). Referentie Tabel 2.

LET OP: Dental acryl is zeer gevaarlijk dus we raden het gebruik van handschoenen en een masker in de procedures.

Kritische stap: Dental acryl nodig heeft om soepel te blijven tijdens het vormen van een goede afdichting te garanderen en risico. Opbouwen van acryl op het venster worden de beelden vervagen.

  1. Laat muizen te herstellen in een warme kooi.

3. Stereotactische Straling (optioneel) - Figuur 3 (25 min per muis)

Variaties bestaan ​​in de verschillende stralers gebruikt en als zodanig optimalisering vereist. We gebruikten een op maat ontworpen bestraler.

  1. Verdoven muizengebruik Isoflurane op 4% voor inductie gevolgd door 1,5-2% tijdens de gehele procedure met 0,5-1 liter O 2 een min, en de plaats op maat head restrainer binnen de stereotactische bestraler (figuur 3AI).
  2. Verkrijgen van een 360 ° cone beam CT-scan met de röntgenbuis draait op 40 kVp en 0,05 mA door een 2 mm aluminium filter. Gebruik de afbeelding om de beweging van het podium begeleiden, het richten van de straling isocentrum om de rechter hersenhelft te zorgen het is centraal in de dorsale ventrale richting.
  3. Plaats de hemisferische collimator, 8 mm x 11 mm blok.

Kritische stap: Collimators kunnen worden ontworpen voor veel verschillende opstellingen en kan dus worden verbeterd zijn en zijn verschillende delen van de hersenen. 8 mm x 11 mm wordt een halfronde gebied van de hersenen.

  1. Verkrijgen enkele CT orthogonale beelden zowel van boven (AP) en onder (PA) door de collimator om verder de plaatsing van de hersenen, anatomical botstructuren kan voor reproduceerbaarheid.
  2. Exchange de aluminium filter voor een 0,93 mm koperen behandeling filteren en beheren de helft van de gewenste stralingsdosis met de röntgenbuis draait op 225 kVp en 13 mA van de top in een AP richting.
  3. Terug gantry naar de onderste stand en het beheer van de tweede helft van de stralingsdosis opnieuw met de röntgenbuis draait op 225 kVp en 13 mA vorm van de bodem in een PA richting.

Kritische stap: Het is essentieel om bestralen vanaf de boven-en onderzijde van de RT helling verminderen door het hersenweefsel, het helpt ook de uitlijning van het isocentrum naar het centrum van de hersenen.

4 In vivo Twee Photon Laser Microscopy -. Figuur 3 (1-3 uur per sessie)

Variaties bestaan ​​in de verschillende microscopen en daarom optimalisering vereist. We gebruikten een Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning Confocal Microscope.

  1. Verdoven muizen met IACUC goedgekeurde verdoving, Avertin IP injectie van 0,5 mg / g en schoon raam met alcohol spray.
    1. (Optioneel) Injecteer tagged vasculaire kleurstof 5-10 minuten voorafgaand aan de beeldvorming, in de staartader voor beeldvorming. Alexa647-Dextran gebruikt 0,35 ug / g of APC-CD31 gebruikt bij 0,2 ug / g. Zie Tabel 2.
    2. (Optioneel) Injecteer Fluoresceïne via de staartader in een dosis van 7,7 mg / kg, 5 min voor beeldvorming van de tumor af te bakenen. Referentie Tabel 2.
  3. Setup kanalen op de confocale microscoop zoals bepaald door het fluorochroom in de chimère muis gegenereerd. Tabel 1 toont de in dit model beschreven kanalen.
  4. Muis omkeren op de beweegbare microscoop podium en stabiliseren van het hoofd op zijn plaats met vormbaar plasticine. (Figuur 3Aii) Referentie Tabel 2.

Kritische stap: De ICW moet loodrecht op de laserspot en als zodanig horizontaal worden geplaatst om te zorgen voor de optimale beeldvorming.

  1. Schakel eerste kanaal laser en de positiegegevens in het midden van de ICW.
  2. Gebruik 5x lens en neem een ​​beeld van het gehele venster te gebruiken als een kaart voor verdere hogere resolutie beelden.
  3. Beeldvorming moet worden uitgevoerd met behulp van 10X en 20X 'lange afstand' lenzen om de beste beeldkwaliteit te krijgen.

Kritische stap: Kanalen en doelstellingen op het 2PLM moet worden opgezet met behulp van gemanipuleerde cellen in vitro voorafgaand aan de beeldvorming van muismodellen te zorgen dat ze wijzen op de juiste fluorchroom.

Fluorochroom GVB GFP / Fluoresceine / FITC mCherry / RFP / DsRed APC / Alexa647 SHG Autofluorescentie
Excitatielaser 458 nm 488 nm 543 nm 633 nm Chameleon laser 820 nm
Collectie Filter 480-520 nm 500-550 nm 565-615 nm 650-710 nm 390-465 nm

Tabel 1. Fluorchroom setup. Gidsen voor de gebruiker om de excitatie laser-en emissie-spectra collector gebruikt voor elk van de in het model-kanalen te zien.

Resultaten

De optionele stap van het reconstitueren van het BM van NODscid muizen moet resulteren in een opname 80% van de fluorescerende 'donor' BM in 100% van de NODscid "host" muizen worden echter optimalisering van de TBI verplicht de reconstitutie in andere niet verbeteren -immunocompromsed stammen. Als muizen zonder succes zijn opnieuw samengesteld dat ze ziek zullen worden en sterven snel na de procedure, kunnen verzwakte muizen extra voedsel en waterbronnen nodig.

De ICW eenmaal klaar zou moeten uitzien dat zien in figuur 2Biv. Het is ideaal om een ​​bergkam van acryl rondom de glazen dekglaasje als dit geeft kracht om de join met de schedel hebben. Perfect ramen reproduceerbaar zijn en zorgen voor herhaalde beeldvorming voor maximaal 8 weken na hun generatie (figuur 2C). Beelden geproduceerd door middel van deze optimale ramen eruit zal zien als die gezien in figuur 3BI. Onvolkomenheden in het venster generatie zal beelden van slechte producerenkwaliteit zal bijvoorbeeld luchtbellen onder het raam voorkomen gehele zichtveld wordt afgebeeld, zal gebieden donker als de lucht De laser imaging (figuur 3Bii). Met overtollige lijm en acryl op het dekglaasje zal een hoog achtergrondniveau fluorescentie en gebieden van het veld worden uitgewist zoals te zien in figuur 3Biii, net als er vuil op het raam kleine puntjes van achtergrond fluorescentie zichtbaar zal zijn in het gebied (figuur 3Biv).

Succes van ICW beeldvorming wordt bepaald door de integriteit van de chirurgische techniek, echter, zelfs optimale ICWs u problemen ondervindt tijdens de opnamesessie. Als zodanig, een afstand en mate van duidelijkheid bestaat in de gegenereerde beelden zoals gezien in figuur 3. De beeldkwaliteit publicatie afgebeeld in figuur 3C treedt op wanneer alles is optimaal. Hoewel het niet mogelijk is voor alle muizen, is het mogelijk om te verwachten 80% van het beelds gegenereerd om zo uitzien. Een van de belangrijkste tekortkomingen in de huidige microscopie setup is het gebruik van omgekeerde lasers. Muizen worden geplaatst op de rug en dit resulteert in overmatige stress en ongemak die kunnen leiden tot moeilijke ademhaling tijdens de beeldvorming. Dit levert een beeld 'lined' de ademhaling verstoort het middelen die tijdens de beeldvorming, waarbij elke pixel rij vier maal en het gemiddelde van de vier weergegeven in het uiteindelijke beeld afgebeeld. Elke beweging tijdens het middelen, zoals dat veroorzaakt door moeizame ademhaling, zal een artefact dat verschijnt als een lijn op het beeld, zoals te zien in figuur 3D te creëren. Muizen die zijn onvoldoende verdoofd tijdens de beeldvorming kan dit probleem zich voordoet ook. De 'gevoerde' effect kan worden verminderd door het beperken van de afbeelding gemiddeld om op, maar dit zal op zijn beurt verminderen de afdrukkwaliteit en kan het probleem niet weg. Alternatief muizen kan worden verplaatst of geprobeerd wanneer de ademhaling is genormaliseerd. Het gebruik of een rechtopstaande 2PLM zou dit probleem te ontkrachten als muizen kon worden afgebeeld 'in buikligging'. Een bijkomend probleem met weergave op een omgekeerde 2PLM omvat de beperkte toegankelijkheid voor het positioneren van de ICW nadat de muis op de microscoop, en dit leidt tot "gesegmenteerde" beelden zoals die gezien in figuur 3E. Hier de laser en dekglaasje niet loodrecht op elkaar en als zodanig de beeldvorming plaatsvindt onder een hoek. Dit resulteert in de vorming van een "gesegmenteerde" beeld waar de zijden van het gezichtsveld niet afgebeeld. Het probleem wordt gemakkelijk opgelost met de herpositionering van de muis zorgen dekglaasje volledig horizontaal eenmaal op de kop gemonteerde zoals in figuur 3Aii.

De hier gepresenteerde model werd specifiek gebruikt om de rol van BMDCs onderzoeken de vascularisatie van het tumorweefsel en toont het vermogen drie verschillende kanalen gelijktijdig gebruiken (Cherry, GFP, ver-rood - Alexa647 en APC) making het GVB en SHG overbodig voor dit verhaal. We waren in staat om beeld muizen longitudinaal gedurende maximaal 8 weken, het bestuderen van de rekrutering en integratie van BM cellen in het vaatstelsel bij een enkele cel niveau, zonder nadelige effecten veroorzaakt door het raam. Dit model toont het gemak van het verzamelen dynamische informatie over de bron en de vorming van bloedvaten en de interactie tussen verschillende celtypen plaats, eerder verloren door eindpunt histologische analyse.

Stap Probleem Redenering Oplossing
1.4 Bot versplinteren Stomp gereedschap Verzamel beenmerg vormen een frisse muis met behulp van geslepen schaar of verse scalpel, zal botfragmenten TV injectie remmen
1.5 Lage extractie (laag viscosity) Bone eindplaten cut te distaal; slechte manier van verzamelen Botten moeten zo proximaal mogelijk worden gesneden en verzameld met het been binnenkant collectie buis terugspatten voorkomen
Tijd moet worden besteed aan de BM maximaal en met zorg uit te pakken
Indien nodig zwembad meer dan een muis in 1 ml
Hoge Extraction (hoge viscositeit) Lage collectie buffer Verdunnen out-oplossing met een extra 0,1% BSA, opgesplitst naar drie ontvangende muizen tot 500 pi per muis maximale
1.6 Slechte Intraveneuze injectie Arme vaatverwijding en zichtbaarheid schip Verbeter dilatatie met warmte lamp. Plaats de muis in de staart ader restrainer met ingebouwde lichtbron om toegang te hulp
1 Muizen Sick Infectie Offeren muizen volgens de instelling regels. Zorgen staarten zijn voor de injectie schoongemaakt en check steriliteitvan de gewonnen BM in cultuur
Muizen sterven Slechte opname BM Controleer% van fluorescente BM opname van dode muis.
Optimaliseren van TBI voor spanning van muizen wordt gebruikt
Verhoog hoeveelheid BM injectie (bijvoorbeeld gebruik een donor muis voor twee ontvangers)
2.4 Kleine bloedingen Dura geschonden tijdens het boren Druk met gel pads en en continue steriele zoutoplossing wassen
Grote bloedingen Hersenen beschadigd door boren Offeren muis volgens de instelling richtlijnen
2.8 Luchtbellen onder dekglaasje Slecht contact met de corticale oppervlak voorkomt juiste plaatsing Verwijderen dekglaasje en voeg extra PBS aan het dekglaasje zweven op het raam om luchtbellen te verwijderen
2.10 Slippen van dekglaasje tijdens het lijmen Acrylic massa is zwaar, het plaatsen van de druk op het dekglaasje en beweegt het dekglaasje uit de weg Pincet moet worden gebruikt om dekglaasje ingedrukt terwijl Vetbond en acryl wordt toegepast
4.2 Slechte Intraveneuze injectie Arme vaatverwijding en zichtbaarheid schip Verbeter dilatatie met warmte lamp. Plaats de muis in de staart ader restrainer met ingebouwde lichtbron om toegang te hulp
4.4
Figuur 3C 		'Lined' beelden Moeizame of onregelmatige ademhaling Verwijder de muis uit frame en laten herstellen
Verhoging van het niveau van anestheticum en de positie aan te passen aan nek zorgen is niet overdreven gebogen of uitgebreid ademhaling te voorkomen
Figuur 3C Imago 'Gesegmenteerde' Brein is niet parallel aan doelstellingen Pas positie van dekglaasje om ervoor te zorgen het is plat
Vaartuig niet gevisualiseerd injectie niet intravasculair gezien Redo injectie in alternatieve staart ader, warme staart naar goede vaatverwijding zorgen
High achtergrond Vuile dekglaasje,
Luchtbellen, Acryl 		Veeg dekglaasje met vochtige 70% ethanol doek, niet weken zo onder acryl kan binnendringen en beschadigen het hersenweefsel

Tabel 2. Problemen oplossen. Een leidraad voor corrigerende maatregelen die nodig zijn voor problematische gebieden van de procedures.

figure-results-1
Schema 1. Experimentele stroomdiagram. Dit toont de tijdlijn van de gebeurtenissen door middel van experimenteel stappen 1-4. Muismodellen zijn setup dan een week, naarzorgen voor de BM reconstitutes behoren, en worden niet behandeld worden met geneesmiddelen tot en met dag 7 van de tumor naar de tumor enten garanderen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-2
Figuur 1. BM Reconstructie. (A) BM extractieprocedure i. Dissectie van de achterste ledematen botten. Ii. Ontleed femur en de tibia van de achterste ledematen, schoongemaakt en klaar voor extractie. Iii. Bones met eindplaat verwijderd en doorgespoeld, het aantonen van de witte verschijning de lege botten. (B) Schemata aangeven waar zijtakken voor injectie zijn geplaatst in de staart.

figure-results-3
Figuur 2. ICW generatie. (A) Aseptische setup aanbevolen (B) i. Exposed schedel oppervlak onthult de oriëntatiepunten die nodig zijn voor een operatie, moet ICW worden geplaatst op de rechter hersenhelft op gelijke afstand van de bregma en lambda. Ii. Periostieum opgeheven met lidocaïne-oplossing, klaar voor het verwijderen . iii. Dental haak nodig voor de verwijdering van het bot fragment gemaakt met de boor. iv. Uiteindelijk ICW met tandheelkundige acrylaat. (C) drie vensters voorbeeld tonen de reproduceerbaarheid van de werkwijze.

figure-results-4
Figuur 3. 2PLM verwachte resultaten. Alle beelden tonen groen BM, rood tumor, Blauw (pseudo gekleurde ver rood) vaatstelsel. (A) i. Toont het hoofd frame dat isofluraan stroming binnen het kleine dier bestraler behoudt. De 8 x 11 mm collimator blijkt ook bewegen door portaal. Ii. Mouse in de omgekeerde positie in het hoofdframe vereist voor de beeldvorming, vormbare plastercine verzekert alle ramen kunnen worden ondergebracht. (B) Demonstrative foto van de resultaten van problemen met het raam generatie van i. een optimale venster, ii. een venster met luchtbellen gevangen onder, iii acryl morsen over de dekglaasje en iv. vuil op het raam zelf. (C) wijst op de problemen die zich voordoen met beeldvorming na succesvolle generatie van een ICW i. optimale beeldvorming ii . ademhaling artefactencreëren van een imago 'gevoerd' iii. dekglaasje niet loodrecht op de laser genereren van een imago 'gesegmenteerd'. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-5
Figuur 4. Functionele toepassingen en aanpassingen van het model. (A) GVB bericht imaging processing waarbij het ​​GFP wordt afgetrokken van het GVB afbeelding om de afbeelding echte GVB die kunnen worden overlayed de andere drie kanalen in het wit te onthullen. Green BM, Rood tumor, Wit CSCs, Blauw (pseudo gekleurde ver rood) vaatstelsel (B) demonstratie van het collageen vezels die kunnen worden afgebeeld met SHG. Green dextran, rood BM, cyaan Collagen (C) i. VEGFTrap cellen in Vitro tonen het GFP-signaal geproduceerd met de VEGFtrap. ii. In vivo beeldvorming toont de VEGFtrap cellen duidelijk en bovendien wijst op het gemak van de omschakeling kanalen om het systeem die u zoekt op te tonen. Green VEGFTRap + Tumor, Red BM, Blauw (pseudo gekleurde ver rood) vasculatuur. (D) Toont de verzameling van fluoresceïne in het stroma van de tumor en niet in de cellen direct, blijkt uit het ontbreken van groene licht overlay met rode tumor. Groene Fluorescein, Rood tumor. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussie

De drie kanalen in alle beelden tot dusver beschreven zijn uitwisselbaar voor drie markers van interesse in andere modellen en bladeren onderzoekers met een onschatbare set van tools om een ​​groot aantal soorten en interacties cel opzoeken. Planning is nodig om ervoor te zorgen alle markeringen en celtypen hebben met succes geïntegreerd een verslaggever fluorescentie-molecuul in een aparte kanaal.

Naast de standaard drie kanalen die hier gebruikt maar er is ook een vierde integreren CFP kanaal (Figuur 4A) en een SHG collageen gebaseerde kanaal 7 (figuur 4B). Hierdoor wordt de mogelijkheid die cellulaire interacties in vivo en bovendien kan de gebruiker om de bevolking te mengen om specifieke cel-cel interacties te bestuderen, met behoud van twee kanalen voor andere markers te ondernemen. Zo hebben we gekeken naar tumorcellen (RFP) en kankerstamcellen (GVB) in een verhouding van 1:03 met een interesse in het vergelijken van hun intratummondelinge interacties (figuur 4A). We zagen dat 7 dagen na implantatie van de gemengde bevolking is de verhouding gehandhaafd en beide celpopulaties nog te zien.

De GVB-kanaal levert technische problemen te wijten aan de overlap met het GFP-kanaal in zowel excitatie en emissie spectra en als zodanig vereist bericht imaging processing om de ware GVB definiëren + cellen van de eigenlijk zijn GFP +. Bericht beeldvorming verwerking kan worden uitgevoerd op de 2-foton microscopen gebouwd in Zeiss LSM software direct waarbij, wordt de afbeelding van het GFP afgetrokken van het GVB beeld, wat resulteert in de echte GVB cellen achter (figuur 4A) wordt overgelaten. Het uitgangspunt voor de verhouding aftrekken is afhankelijk van even helder beeld en is te wijten aan het GVB laser (458 nm) fluoresceren zowel GVB en GFP-cellen, terwijl het GFP-laser (488 nm) is te hoog om het GVB cellen fluoresceren. Naast CFP hebben we kunnen eerder gepubliceerde setups om te kijken naar de SHG geweestniveau en dus tonen de collageenvezels waaruit de kelder membraan rond vasculatuur (figuur 4B).

Een andere aanpassing van het model gebruik gemaakt van een hypermoderne kleine dieren stralingapparaat dat de mogelijkheid stereotactische geleide straling om secties van weefsel bestralen van slechts 2 mm in diameter heeft. Door het richten raam met bestraling is het mogelijk om te kijken naar het effect straling op het onderliggende weefsel. We hebben onlangs een studie gepubliceerd te kijken naar het effect straling heeft op de normale hersenweefsel met betrekking tot de werving van BMDCs aan het vaatstelsel, specifiek kijken naar hun rol in de straling weefsel verandert. We vonden dat de werving van de BMDCs was zowel tijd-en dosis-afhankelijke in normaal weefsel 11.

Het is haalbaar om de mechanismen van levering en integratie van geneesmiddelen die het onderzoeksgeneesmiddel wordt gelabeld met een fluorescerende marker. Gedurendeons onderzoek we de productie van VEGFTrap, een anti-angiogene geneesmiddel dat alle VEGF signalering blokkeert in de omgeving van de productie 25 volgen zijn. Door het genetisch modificeren van onze tumorcellen aan de VEGFtrap gen gekoppeld aan een IRES om EGFP (figuur 4Ci) uiten en met RFP 'donor' BM waren we in staat om het imago van de EGFP: VEGFtrap productie, BMDC interactie en vaatstelsel tegelijkertijd (figuur 4Cii). Dit toonde de veelzijdigheid van het model en kanalen. Het is ook mogelijk om te kijken naar kinetiek van het geneesmiddel door de belofte van eencellige resolutie. Fluoresceïne (GFP +) wordt gebruikt om tumoren bakenen tijdens chirurgie te zorgen maximale resectie bereikt 26. Door injectie intraveneus tijdens beeldvorming is het mogelijk aan te tonen dat de afbakening gebeurt niet via de actieve opname van fluoresceïne in de tumorcellen zelf, maar door het verzamelen van het geneesmiddel in de stromale met time, gezien het gebrek aan co-localisatie 10 min na de injectie van fluoresceïne (Figuur 4D).

Kortom onze strategie combineert nieuwe en bestaande technieken om een ​​uniek experimenteel platform, hetgeen voordelig is in de studie van dynamische cellulaire interacties bereiken. Deze strategie heeft zich bewezen als een waardevolle aanpak voor de behandeling van hoge-resolutie eencellige dynamische evolutie van BMDC, tumor en normale hersenen vasculariteit in reactie op de behandeling, intracraniaal zijn. Intravitale beeldvorming kan zorgen voor een beter begrip van de moleculaire regulatoren van BMDC werving, migratie en differentiatie in intracraniale hersentumor vaatstelsel evenals vele andere dynamische processen aan te passen aan andere onderzoeksgebieden. Vermoedelijke remmende factoren die BMDC regelen in combinatie met andere therapeutische strategieën kunnen de beschrijving van de exacte timing van combinatorische therapieën helpen. Bovendien kan deze strategie aangepast worden aan toekomstige projecten gebruik niet alleen in vivo intravitale vlekken kleurstoffen, maar ook kleine moleculaire remmers en nanodeeltjes die fluorescent zijn gelabeld waardoor onderzoekers de verspreiding en migratiepatronen van meer gerichte therapieën te sporen evenals lengterichting kijken naar hun kinetiek.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen graag de Advanced Optical Microscopie Facility dank aan de prinses Margaret ziekenhuis, met name James Jonkman voor hun hulp bij de eerste installatie van de kanalen op de 2Photon microscoop. De auteurs willen graag de tijdruimtelijke Targeting en versterking van de Straling Response (STTARR) programma en haar gelieerde financiers erkennen. Wij danken dr. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael en Dr.Andras Nagy voor het leveren van de VEGFTrap plasmiden en voor hun manuscript correcties en feedback. De voortdurende steun en bespreking van het personeel bij de BTRC is van onschatbare waarde geweest en we zouden graag Dr.Abhijit Guha Herdenken voor zijn wetenschappelijke inbreng. Werk werd gefinancierd door CIHR en NIH subsidies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
NODSCID muizenJackson Lab0013038 weken oud
B5/EGFP MuizenJackson Lab003516
ACTB/DsRED muizenJackson Lab005441
Tear GelNovartisT296/2
2% Lidocaine-EpinephrineBimeda MTC25SPGebruik onverdund
Vetbond3M1469SB
Zelfhardende acrylsetBosworth166260Gebruik ~30% (w/v)
10K MW Dextran-Alexa647InvitrogenD22914Gebruik @ 0,6 mg/kg in Saline
CD31-APCBDPharmingen551262Gebruik @ 0,3 mg/kg in Saline
AK-fluor (Fluorescein) 10%AKORN inc.NDC 17478-253-10Gebruik @ 7,7 mg/kg in Saline
Betadine-oplossingPurdue ProductsNDC 67618-150
Utrusting
Fijne pincettenVWR82027-402
Fijne dissectieschaartVWR25870-002
22G NaaldBD305156
27G 0,5 ml TB-spuitBD305620
Handmatige Micro-boorFine Science Tools18000-17
2,7 mm Trephine-boortjeFine Science Tools18004-27
10 μl 30G Hamilton-spuitSigma Aldrich20909-U
Glazen dekglas 3 mmWarner Instruments64-0720 CS-3R
Fluorescentie-brilBLSFHS/T01Basiskopframe
Stereotaxisch framestoelting51950
Muizenbegrenzer voor IV-injectieBrain Tree LifescienceMTI

Referenties

  1. Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
  2. Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
  3. Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
  4. Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74(2008).
  5. Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
  6. Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
  7. Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
  8. Marker, D. F., Tremblay, M. -E., Lu, S. -M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059(2010).
  9. Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
  10. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
  11. Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366(2012).
  12. Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
  13. Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
  14. Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641(2010).
  15. Zhang, H. -r Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
  16. Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
  17. Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
  18. Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
  19. Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
  20. Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
  21. Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).
  22. Burrell, K., Zadeh, G. Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , InTech. (2012).
  23. Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
  24. Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
  25. Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
  26. Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intracraniaal vensterTweefotonmicroscopieBeenmergprogenitorcellenStereotactische bestralingFluorescente chimere muizenReal time imagingResolutie op enkelcelniveauVascularisatiedynamiekTumormigratieDextranlabeling

Gerelateerde artikelen