Arginine-vasopressine (AVP) regelt fine-tuning van het lichaam van het water homeostase door het vergemakkelijken waterherabsorptie door renale opdrachtgever cellen. Hier presenteren wij een protocol voor de teelt van primaire rat binnenste medullaire verzamelen duct cellen die geschikt zijn voor de opheldering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen AVP-gemedieerde water reabsorptie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kweken Primaire Rat Inner Medullary Verzamelen Duct Cells
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Arginine-vasopressine (AVP) faciliteert waterherabsorptie door renale opvangbuis voornaamste cellen en daardoor verfijnt lichaam waterhomeostase. AVP bindt aan vasopressine V2-receptoren (V2R) op het oppervlak van de cellen en daardoor leidt tot de vorming van cAMP. Dit stimuleert cellulaire signalering processen die leiden tot veranderingen in de fosforylering van het waterkanaal aquaporin-2 (AQP2). Proteïne kinase A phoshorylates AQP2 en daarmee het startsein voor de translocatie van AQP2 van intracellulaire blaasjes in de plasmamembraan faciliteren waterherabsorptie uit primaire urine. Aberraties van AVP vrijlating uit de hypofyse of AVP-geactiveerde signalering in hoofdsom cellen kunnen verzwakking van het centrale of nefrogene diabetes insipidus, respectievelijk een verhoogde bloedplasma AVP wordt in verband gebracht met hart-en vaatziekten, zoals chronisch hartfalen en het syndroom van inadequate secretie van antidiuretisch hormoon.
Hier, een protocol voor cultivati presenteren weop van de primaire rat binnenste medullaire verzamelbuis (IMCD) cellen, die uitdrukkelijk V2R en AQP2 endogeen. De cellen zijn geschikt voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die de controle AQP2 en aldus nieuwe targets voor de behandeling van ziekten geassocieerd met ontregeling van AVP-gemedieerde waterreabsorptie ontdekken. IMCD cellen worden verkregen van rat nier binnenste medullae en worden gebruikt voor experimenten zes tot acht dagen na het zaaien. IMCD cellen kunnen worden gekweekt in normale celcultuurschalen, flacons en micro-titer platen van verschillende formaten, de procedure vereist slechts een paar uur, en is geschikt voor standaard celkweek laboratoria.
Inleiding
In renale verzamelbuis OG cellen, arginine-vasopressine (AVP) regelt waterherabsorptie door bevordering van de insertie van het waterkanaal aquaporin-2 (AQP2) in de plasmamembraan. AVP bindt de G-eiwit-gekoppelde vasopressine-type-2 receptor (V2R) adenylylcyclase stimuleren en daardoor vorming van cAMP. Inleiding van deze signalering cascade leidt tot activatie van proteïne kinase A (PKA). PKA fosforyleert AQP2 op serine 256 (S256), die de belangrijkste trigger voor de herverdeling van intracellulaire blaasjes in de plasmamembraan. Het membraan inbrengen vergemakkelijkt waterherabsorptie langs een osmotische gradiënt en verfijnt het lichaam water homeostase.
Ontregeling van AVP-gemedieerde water reabsorptie, als gevolg van afwijkingen van AVP secretie of AVP-geactiveerde signalering oorzaken of gepaard gaat met ernstige ziekten. Verminderde waterherabsorptie veroorzaakt door mutaties van V2R of AQP2 leidt tot nefrogene diabetes insipidus, terwijl een elevated bloedplasma AVP niveau wordt geassocieerd met overmatig water reabsorptie in cardiovasculaire ziekten zoals chronisch hartfalen en het syndroom van inadequate secretie van antidiuretisch hormoon (SIADH).
De betekenis van de AVP-gemedieerde waterherabsorptie komt niet alleen voort uit zijn betrokkenheid bij ziekte. De AVP-geïnduceerde translocatie van AQP2-dragende blaasjes en fusie met de plasmamembraan is strikt cAMP-afhankelijke exocytose-proces, dat nog niet goed begrepen. Andere voorbeelden van een cAMP-afhankelijke exocytose zijn renine secretie in de nier en H + secretie in de maag. Daarom opheldering van de moleculaire mechanismen die AQP2-translocatie in renale belangrijkste cellen helpt niet alleen soortgelijke moleculaire processen te begrijpen in andere celtypes, maar kan ook tot aan nieuwe therapieën voor de behandeling van ziekten die geassocieerd zijn met afwijkingen in AVP-gemedieerde waterreabsorptie effenen .
Elucidating mechanismen die AQP2 vereist opvangbuis hoofdsom cell modellen. Hiervoor is een aantal verschillende zoogdiercellen nier cellijnen beschikbaar. Echter, deze modellen hebben een aantal nadelen. In veel mobiele systemen het eiwitgehalte van AQP2 is laag (tabel 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, anderen ectopisch overexpressie menselijke (MCD4, WT10) 11,12 of rat (CD8) 13 AQP2. In MCD4 en COS-7 cellen de V2 receptor niet tot expressie. Voor zover bekend geen permanente cellijn als model beschikbaar, die is afgeleid van de nier binnenste medullaire verzamelbuis, dat deel van de nier waar AQP2 expressie meest voorkomende, maar van de corticale verzamelbuis 1,11,13-16 . Dergelijke celmodellen zijn bijvoorbeeld de veelgebruikte geïmmortaliseerde mpkCCD (bijv. 17) of de recent opgerichte mTERT-CCD 14 cellijnen. Beide cellijnen endogeen uitdrukkelijke AQP2 en V2R maar omdat ze zijn afgeleid van decorticale collecting duct bevatten hoogstwaarschijnlijk een andere proteoom vergeleken met innerlijke medullaire verzamelbuis (IMCD) cellen. Zij moeten bijvoorbeeld uiten verschillende Na + transportsystemen.
Hier presenteren we een protocol om cultuur primaire IMCD cellen die V2R en AQP2 endogeen. Dit model vormt derhalve het meest de fysiologische toestand in de renale verzamelen duct. Zoals oprichting van de cultuur vereist enige standaard laboratoriumapparatuur andere laboratoria kunnen gemakkelijk deze aanpak.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding
- Voorbereiden van de cultuur gerechten
- Ontdooi Collageen Type IV O / N bij 4 ° C en oplossen in steriele 0,1% azijnzuur. Het volume is afhankelijk van het soort en aantal schotels waarin de cellen worden gezaaid. Gebruik 2 ug / cm 2.
- Incubeer gerechten tenminste gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en twee keer wassen met gedestilleerd water (A. tridest).
- Laat de gerechten goed drogen.
- Suppletie van middelgrote
- Verhoging van het glucosegehalte tot 4,5 g / L door het toevoegen van 1,75 g glucose tot 500 ml medium. Aan het medium tot 600 mosmol passen, voeg 100 mM NaCl en 100 mM ureum, aan de osmolariteit te verhogen met 200 mosmol en 100 mOsmol, respectievelijk.
- Voeg 1% niet-essentiële aminozuren, 1% ultroser, 500 uM dbcAMP, 20 U / ml nystatine en 0,25 ug / ml gentamicine (1:200 verdunning van voorraad-oplossing met een concentratie van 50 ug / ml) tot 600 mosmol DMEM medium vers op de dag van bereiding.
- Enzymoplossing
- Voeg 1 mg / ml hyaluronidase en 2,2 mg / ml collagenase aan DPBS-dat 0,25 ug / ml gentamicine en nystatine. Bereid 1 ml van de enzymoplossing voor de vertering van 2 nieren binnen medullae. De oplossing moet worden gesteriliseerd door filtratie en bewaard in 50 ml Falcon buizen.
2. Teelt van primaire Rat Inner Medullair Verzamelen Duct (IMCD) Cells
Alle procedures voor de behandeling van dieren in overeenstemming moeten worden uitgevoerd met de lokale en federale regelgeving.
- Verdoven ratten in CO 2 (in een doos verzadigd met CO 2) of isofluraan (U-400 Anesthesie-eenheid, Univentor Ltd, Malta; luchtstroom 350-400 ml / min met 2-2,5% isofluraan). Onthoofden de dieren voor bloedingen die precieze detectie van de grens tussen de witachtige binnenste en de donkere buitenste medulla toelaat. Bovendien minimaliseert de bloeding het aantal geïsoleerde erytrocyten. Verwijder nieren enwas ze in steriele DPBS aangevuld met gentamicine en nystatine (zie boven) op ijs. Alle verdere stappen worden onder steriele clean bench omstandigheden worden uitgevoerd.
- Overdracht van nieren van de DPBS oplossing op een steriel kompres om overmatige vloeistof te verwijderen. Verwijder het vet niercapsule met steriele pincet en een schaar.
- Nadat de nier nog in het kompres vastgesteld gesneden iets naast de lengteas van de buitenste (corticaal) zijde. Zorg ervoor dat niet te snijden door middel van volledig, maar om het te verlaten in een stuk, verbonden in het nierbekken.
- Met gebogen schaar zorgvuldig ontleden de witachtige innerlijke medullae, die worden omgeven door de rose glinsterende buitenste medulla. Verzamel ze in DPBS, met gentamicine en nystatine in een 60 mm cultuur schotel op ijs.
- Zodra alle medullae worden geïsoleerd en op ijs verzameld, zet het volume van DPBS tot een niveau waarop ze gewoon zijn bedekt met buffer. Gebruik een steriel scheermesje om de medullae snijd ze in blokjes van 53 mm.
- Smelt en rond het scherpe uiteinde van een steriele Pasteur pipet door het houden van deze kort in een vlam. Zorg ervoor dat de pipet wordt voordat u verder afgekoeld.
- Overdracht van het weefsel schorsing aan de 50 ml Falcon buizen met vers bereide steriele enzymoplossing met hyaluronidase en collagenase (zie 1.3.1) met behulp van de afgeronde Pasteur pipet. Sluit het deksel stevig en incubeer bij 37 ° C onder continu roeren (220 rpm) in een regelmatig tafelblad waterbad gedurende 1,5 - 2 uur.
- Voor fijnwrijving van de schorsing, pipet het mengsel op en neer meerdere malen met de ronde Pasteur pipet (zie boven) totdat de schorsing wordt homogeen troebel.
- Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 300 g en 16 ° C. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet grondig in DPBS, met gentamicine en nystatine en centrifuge opnieuw. Herhaal deze wasstap eenmaal.
- Resuspendeer de cellen in volledig aangevuld medium en zaad ze in cULTUUR gerechten en / of micro-titer well platen. De bereiding van 2 medullae (1 dier) voldoende cellen opleveren voor een 60 mm cultuur schotel.
- Na 24 uur, wassen cellen tweemaal met 600 mosmol DMEM en voeg vers medium. Gedurende de volgende week de cellen 2-3 keer (figuur 1) worden gewassen. 6-8 dagen na het zaaien, kan IMCD cellen worden gebruikt voor experimenten. Vergeet niet om ze broeden in medium zonder dbcAMP en nystatine voor 24 uur voor aanvang van het experiment. Anders AQP2 zullen uitsluitend worden gevestigd in de plasmamembraan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De succesvolle kweken van primaire rat IMCD cellen zal resulteren in een confluente monolaag 6-8 dagen na het zaaien (figuur 2). Per 60 mm cultuur schotel zijn er ongeveer 6 x 10 6 cellen. De cellen strak houden aan de cultuur gerechten, zoals deze werden bekleed met collageen type IV, een basale membraan component 18. Daarom IMCD cellen zullen niet eens gedurende enkele grondige wasprocedures los. Tot 80% van de gekweekte cellen brengen endogeen V2R en AQP2. Dit zijn de belangrijk...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We presenteren een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en het kweken van primaire rat IMCD cellen. De aanpak levert tot 21 cm2 van cellen van een rat 20. Het experiment vereist standaard celkweek apparatuur en kan door slechts een persoon binnen ca. 6 uur worden uitgevoerd. Daarom is deze benadering geschikt als standaard laboratoriummethode.
Primaire rat IMCD cellen worden gezaaid in kweekplaten van verschillende grootte, variërend van 96 well platen 60 mm sch...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL 1415/3-2 en KL 1415/4-2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Collagen Type IV Mouse | BD Biosciences | 356233 | |
| Hyaluronidase | SIGMA | H6254 | |
| Collagenase type CLS-II | Biochrom AG | C2-22 | |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 | |
| Nystatin | SIGMA | N4014 | |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 | |
| Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | |
| Gentamicin | Invitrogen GIBCO | 15710 | |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
Referenties
- Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
- Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
- Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
- Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
- Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
- Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
- Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
- Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
- Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
- Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
- Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
- Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
- Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
- Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
- Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
- Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
- Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
- Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
- Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
- Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
- Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
- Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
- Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
- Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
- Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
- Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
- Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.
A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Enno Klussmann
instead of:
Enno Klussman
