Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Summary

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Abstract

Cryo-electron tomography (cryoET) maakt het mogelijk 3D-visualisatie van cellulaire structuren op moleculaire resolutie in een close-to-fysiologische toestand ^1. Echter, directe visualisatie van individuele virale complexen in hun gastheer cellulaire omgeving met cryoET ² is uitdagend, gezien de lage frequentie en de dynamische aard van virale binnenkomst, met name in het geval van HIV-1. Terwijl de time-lapse live cell imaging veel informatie over de vele aspecten van de levenscyclus van ^HIV-3-07 januari heeft opgeleverd, de resolutie wordt geboden door levende cellen microscopie is beperkt (~ 200 nm). Ons werk is gericht op het ontwikkelen van een correlatie methode die directe visualisatie van de vroege gebeurtenissen van HIV-1 infectie toelaat door het combineren van levende cellen fluorescerend licht microscopie, cryo-fluorescentie microscopie, en cryoET. Op deze wijze kunnen levende cellen en cryo-fluorescente signalen worden gebruikt voor het nauwkeurig geleiden van de bemonstering in cryoET. Bovendien, structurele informatie uit cryoET kunnen be aangevuld met de dynamische functionele data verkregen door middel van live-cell imaging van fluorescent gelabelde doelwit.

In deze video artikel, bieden we gedetailleerde methoden en protocollen voor structurele onderzoek van HIV-1 en gastheer-cel interacties met behulp van 3D correlatieve high-speed Live-cell imaging en hoge-resolutie cryoET structurele analyse. HeLa-cellen geïnfecteerd met HIV-1 deeltjes werden eerst gekenmerkt door confocale microscopie van levende cellen, en het gebied dat dezelfde virale deeltje werd vervolgens geanalyseerd met cryo-electron tomografie voor 3D structurele details. De correlatie tussen de twee reeksen van beeldgegevens, optische beeldvorming en elektronen imaging, werd bereikt met behulp van een zelfgebouwde cryo-fluorescentie lichtmicroscopie podium. De aanpak die hier beschreven zal waardevol zijn, niet alleen voor studie van virus-gastheercel interactie, maar ook voor bredere toepassing in celbiologie, zoals signaaltransductie, receptor membraan handel, en vele andere dynamische cellulaire processen. </ P>

Introduction

Cryo-electron tomography (cryoET) is een krachtige imaging techniek die driedimensionale (3D) visualisatie van cellen en weefsels mogelijk maakt en geeft inzicht in de organisatie van de inheemse organellen en cellulaire structuren op moleculaire resolutie in een dicht-bij fysiologische toestand ^1. Echter, de inherent lage contrast van ongekleurde bevroren gehydrateerde monster, gecombineerd met hun stralingsgevoeligheid, bemoeilijkt gebieden plaats binnen een cel lokaliseren en vervolgens uitvoeren van de tilt series succes zonder beschadiging van het doelgebied. Om deze problemen te overwinnen, een correlatieve benadering die licht en elektronenmicroscopie combineert noodzakelijk. Bijzonderheden gemarkeerd door fluorescentielabelling worden geïdentificeerd en gelokaliseerd door fluorescentie microscopie, en vervolgens de coördinaten worden overgedragen aan de elektronenmicroscoop voor het ingaan van hoge resolutie 3D structurele gegevens. Deze correlatieve methode helpt het lokaliseren van de doelgroep eenReas van belang zijn worden aangepakt. Door de beperking van monsterdikte met cryoEM (<300 nm), nog alleen de randgebieden van de cel geschikt voor 3D structuuranalyse door CryoET. Verdere vermindering van de dikte van bevroren gehydrateerd monsters door glasvocht snijden ⁸ of door cryo-focused ion beam (FIB) frezen ⁹ zou het vermogen van correlatieve beeldvorming breiden.

Voorheen werden correlatieve methoden voornamelijk gebruikt om cryoET data acquisitie voor grote en statische constructies ^10-13 vergemakkelijken. In deze studies zijn cryo-fasen geïmplementeerd om cryoEM roosters accepteren en passen op ofwel een rechtopstaande microscoop of een omgekeerde microscoop ^10,11,14. Hoewel schakelende grids lijkt vrij eenvoudig in hun ontwerpen, zijn er extra stappen die overdracht van de EM rooster, waardoor de kans dat het rooster kan worden vervormd, beschadigd en vervuild. We hebben onlangs aangetoond een technische vooruitgang incorrelatieve microscopie die ons in staat stelt om direct te visualiseren dynamische gebeurtenissen die van nature moeilijk te vangen, zoals HIV-1 en gastheercel interactie in een vroeg stadium van de infectie ^15. We bereikte dit door het ontwerpen en implementeren van een cryo-lichtmicroscopie monstertafel dat een cartridge systeem om het monster schade door raster handling minimaliseren aanpast, waardoor het gemakkelijker correlatie. Ons ontwerp omvat een geïntegreerd exemplaar patroonhouder, waardoor beide cryo-licht en cryo-elektronenmicroscopie worden uitgevoerd, achtereenvolgens, op hetzelfde monster houder, zonder monster overdracht, waardoor het stroomlijnen van het correlatieve proces. Daarnaast hebben we eveneens uitgevoerd een nauwkeurige en betrouwbare correlatie procedure met fluorescerende latex kralen als markeerders.

Protocol

1. HeLa Cell Culture on Carbon coating, Goud EM Finder Grids

1. Gloedlossing de koolstof-kant van een 200-mesh R2 / 2 Quantifoil goud EM finder net onder de 25 mA voor 25 sec.
2. De vacht van de EM rooster met fibronectine, door drijven het, carbon-kant naar beneden, op een 40 pi druppel van 50 ug / ml fibronectine oplossing, desinfecteer het dan onder UV-licht voor 2 uur in een weefselkweek kap.
3. Plaat HeLa cellen op het rooster op een dichtheid van 2 x 10 ⁴ cellen / ml (totaal 2 ml kweek) in een glazen bodem cultuur schotel en groeien de cellen bij 37 ° C, met 5% _CO2, in DMEM aangevuld met 4,5 g / L L-glutamine en glucose, 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, gedurende ongeveer 18 uur. HeLa cellen worden geïnfecteerd na O / N cultuur.

2. HIV-1 infectie en live-cell imaging

1. Voeg een fluorescerende cel tracker (Red CMTPX, 1 ui / 2 ml) in de glazen bodem cultuurschotel (uit stap 1.3) en incubeer de schotel bij 37 ° C gedurende 10 min, om up-opbrengst van de fluorescerende kleurstof.
2. Was de cellen met PBS en voeg 50 ul voorverwarmde vers medium.
3. Zet de schaal op de live-cell kamer, bij 37 ° C, van een bocht beschreven Field confocale microscoop scanner. Selecteer meerdere velden (10-15 posities) die 1-3 cellen / vierkante bevatten, met de cellen tussen twee mitose fasen wanneer ze het meest verspreid-out en platte (zie figuren 2c en 2d), sinds cryoEM vereist relatief dunne gebieden van de monster. Bewaar deze posities voor toekomstige beeldvorming (stap 2.5).
4. Infecteren de cellen met VSV-G pseudo-getypeerde HIV-1 deeltjes die GFP-Vpr bevatten (we gebruiken 40 ul van een monster met 40 ng / ml p24). Bij het toevoegen van het virus deeltjes in de bodem van de schaal, voorzichtig zijn om de EM net niet storen, omdat de posities van beeldvormende reeds geselecteerd en opgeslagen.
5. Onmiddellijk na toevoeging van virions, verzamelen time-vervallen high-speed 3D confocale beelden, bij de eerder gekozen standen (uit stap 2.3) gedurende 20-40 minuten.
6. Confocale beelden werden verkregen met behulp van MetaMorph en geanalyseerd door geautomatiseerde 3D ​​deeltje volgen voor enkel deeltje dynamiek behulp Imaris software (zie figuur 1). Aangezien we correleren het dynamische gedrag van buigingsbegrensde HIV-1 deeltjes met cellulaire ultrastructuur, time-lapse live cell imaging en 3D deeltjes volgen kritisch zijn voor de resultaten. Voor een grote en statische structuur, een eenvoudige fluorescentiebeeld (zonder levende cellen) zou voldoende correlatieve analyse.

3. Frozen-gehydrateerd EM Monstervoorbereiding

Om de vertraging tussen de verzameling van de laatste confocale afbeelding en cryo-fixatie van het monster te minimaliseren, moet de FEI Vitrobot (of ander apparaat vitrificatie) worden geïnitieerd en voorbereid voor duik-bevriezing tijdens het verzamelen van fluorescentie confocale live cell afbeeldingen.

1. Schakel de verglazing apparaat en stel het klimaat temperatuur tot 22 ° C, de doelstelling luchtvochtigheid tot 100%, de blotting tijd om 7 sec, en het wachten en afvoer tijd tot 1 sec.
2. Plaats de opbergbox raster in de zuiger dewar en bereiden koude vloeistof ethaan. Monteer de dewar op de verglazing apparaat.
3. Onmiddellijk na confocale voor live-cell imaging (hoofdstuk 2), plaats de cultuur schotel op een met ijs gekoelde koperen blok en overbrengen naar het cryoEM monstervoorbereiding kamer. Laad de EM rooster op de gespecialiseerde pincet en snel alle media op de grid weg te deppen. De blotting gebeurt handmatig, met filtreerpapier, waarna 4 pl van 15 nm goud kraal oplossing gemengd met 0,2 um wordt fluorescerende microsferen direct op het rooster. De gouden kralen worden gebruikt als ijkmarkeringen om tomografische gegevens verzamelen en uitlijning hulp. De fluorescente microsferen worden gebruikt om de correlatie tussen tl en cryoEM afbeeldingen steun (zie figuur 2c-2f).
4. Laad de pincet op de verglazing apparaat en instrueren het apparaat te wissen en storten bevriezen in vloeibare ethaan ^16. De blotting parameters geoptimaliseerd om het beste resultaat te bereiken zijn: vlek tijd, 7 sec; vlek offset, 0; drain tijd, 1 sec, temperatuur, 22 ° C, en de luchtvochtigheid, 100%.
5. Breng de bevroren-gehydrateerd grid naar een cryoEM houder voor onmiddellijke cryoET beeldvorming, of een vloeibare stikstof opslag dewar voor later gebruik.

4. Cryo-fluorescentie lichtmicroscopie

Een zelfgebouwde, cryo-fluorescentie monsterkamer en fase-systeem (figuur 3) is nodig voor het uitvoeren van de stappen 4,1-4,10. De gedetailleerde specificaties en de beschrijving van de fase kan worden gevonden in juni et al.. ^15.

1. Vul een zelf-druk vloeibare stikstof Dewar met vloeibare stikstof ten minste 2 uur voor aanvang van cryo-fluorescentie microscopie (zie figuur 3a).
2. Monteer een zelfbouw cryo-fluorescence monstertafel ¹⁵ (figuur 3) op een omgekeerde fluorescentie lichtmicroscoop, zoals een Olympus IX 71.
3. Sluit de vloeibare stikstof inlaat van de cryo-monster etappe naar de zelf-druk Dewar en plaats de stikstof overloopbeveiliging afvoer vloeistof in een geschikte container. Sluit een droog stikstofgas lijn naar een huls geplaatst over de doelstelling om de lens aan warme en vorstvrij te houden.
4. Plaats een koperen blok platform (zwarte pijl in figuur 3b) in de cryo-fasekamer voor het laden van de bevroren-gehydrateerde monster raster. Afkoelen en vul de koperen kamer van de cryo-podium met vloeibare stikstof door de inlaat lijn van de self-druk vullen dewarvat.
5. Wanneer de cryo-podium temperatuur van vloeibare stikstof (in ~ 4-6 min) bereikt, dragen de opbergbox raster (uit stap 3.5) naar de cryo-podium.
6. Plaats de bevroren-gehydrateerde monster rooster in de EM specimen cartridge op de koperen blok en clip de gontdoen in plaats met behulp van een C-ring (bij gebruik van een Polara microscoop cartridge), of plaats een pre-gekoelde koperen ring op de top (zwarte pijlpunt in figuur 3d), om het rooster op zijn plaats voor het gemakkelijk terugvinden van het net te houden en ook na cryo-fluorescentie beeldvorming (indien een niet-Polara cryo-elektronenmicroscoop).
7. Plaats de cartridge (uit stap 4.6) in de binnenkamer van de cryo-podium (witte pijl in figuur 3b).
8. Zoek en vind op dezelfde virusdeeltjes uit de live-cell imaging data. Aangezien EM kap heeft een index, is het eenvoudig om hetzelfde deeltje op het rooster zowel levende cellen beelden en cryo-bloei beelden lokaliseren.
9. Acquire cryo-DIC en GFP beelden op de geïdentificeerde posities onder cryo-toestand met behulp van een lichtmicroscoop met een lang werkende (2,7-4 mm) objectief. Tijdens de cryo-fluorescentie beeldvorming, periodiek de vloeibare stikstof niveau in de cryo-podium en vul het, zo nodig, aan het monster podium houden onder de -170° C.
10. Na voltooiing van cryo-fluorescentie beeldvorming, zorgvuldig het model cartridge terug te keren naar de koperen blok platform en bewaar de cartridge in een vloeibare stikstof Dewar voor toekomstige cryoET analyse met een Polara systeem. Bij gebruik van een niet-Polara cryo-elektronenmicroscoop, verwijder de koperen ring, halen het monster rooster, plaats het in een rooster opbergdoos, en het monster op te slaan in een vloeibare stikstof Dewar totdat het monster wordt onderzocht door cryoET.
11. Voor data-analyse, overlappen de verworven cryo-DIC en GFP beelden (uit stap 4.9, zie figuur 4b) en correleren van de posities van de GFP-signalen in de cryo-fluorescentie afbeelding met die verkregen in de live-cell imaging-serie.

5. Cryo-electron tomografie

1. Plaats het monster patroon in de cryo-overslagstation van een elektronenmicroscoop uitgerust met een veldemissiebron, zoals Polara G2 microscoop.
2. Onder lage dosis-zoekmodus bij een vergroting van 140X, identify en sla de bijbehorende rooster vierkanten (van stap 4.11) in een podium bestand.
3. Onder lage dosis-zoekmodus bij een vergroting van 3500 X, plaatst u een 100 um objectieve diafragma, zoek en alle posities gecorreleerd met GFP signalen om in een tweede fase bestand op te slaan.
4. Onder lage dosis-belichting, vinden een leeg gebied aan lichtintensiteit aan te passen aan een dosis van 1 of 2 e ^- / Å ² en verfijnen van de tilt-as, met behulp van het podium y-functie, door het wegbranden van het ijs in een onbelangrijke carbon regio met verscheidene gouden kralen.
5. Onder lage dosis-focus modus, om de scherpstelafstand tot ~ 3 micrometer en de hoek aan te passen aan de richting van de focus lijn parallel aan de kantelas te zijn.
6. Onder lage dosis-zoekmodus, herinneren opgeslagen posities (uit stap 5.3), past het model eucentrische hoogte en controleer de tilt bereik van het gebied van belang. Verwerven afbeelding een projectie met zeer lage elektron-dosis (~ 1 e ^- / Å ²⁾ op 8 tot 10 micrometer defocus, in expoure-modus, om de gecorreleerde virusdeeltjes te bevestigen voor cryo-electron tomografie.
7. Schakel over naar de lage-dosis-scherpstelling. In TEM menu automatische functies, vooraf aan de geautomatiseerde eucentrische hoogte en richten functies op het focusgebied.
8. Stel de parameters voor het verwerven van een tilt-serie. Voor figuur 4 in dit document, kantelhoeken variërend ± 70 °, onder en boven 45 °, bij 3 ° en tilt stappen van 2 °, respectievelijk, werden gebruikt, met een 6 micrometer defocus en ongeveer 70 e ^- / Å ² totale dosis.
9. Herhaal de stappen 5.7 en 5.8 voor alle opgeslagen posities. Batch tomografie software kan worden gebruikt voor automatische gegevensverzameling op meerdere posities van de doorvoer te verhogen.

6. Driedimensionale reconstructie met behulp IMOD ¹⁷

1. Inspecteer de ruwe tilt-serie om de minimale en maximale densiteit waarden aan te passen en te bepalen of er een te worden uitgesloten vanwege grote afbeelding shift.
2. Start eTomo en setup tomogram paneel met astype, pixelgrootte, de vaste diameter, enz. Maak vervolgens com scripts.
3. Configureert het hoofdvenster zodanig dat verschillende stadia van de tomogram berekening kan worden aangepast / gelijktijdig gevolgd. Wijzig de nodige parameters en uitvoeren van de specifieke programma's die nodig zijn door elke bewerkingsstap (zie eTomo tutorial http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
4. In de laatste fase, maak een volledige lijn stack (met een gemiddelde resterende fout minder dan 0,6) en het reconstrueren tomograms behulp van een gewogen back-projectie algoritme in IMOD.
5. DeNoise potentiële aandachtsgebieden behulp van een 3D-lineaire anisotrope diffusie rand versterken programma geïmplementeerd in IMOD met de juiste parameters om het contrast en de helderheid te verbeteren.

Results

Om het dynamische gedrag van de virusdeeltjes karakteriseren, werden HeLa-cellen geïnfecteerd met HIV-1 afgebeeld door high-speed confocale microscopie levende cellen en deeltjes bewegingen werden geanalyseerd door geautomatiseerde 3D ​​deeltjes volgen (figuur 1). Om de tijdspanne van enkele minuten die kunnen optreden tussen de verzameling van de laatste afbeelding confocale live cell en duik-invriezen (die lang genoeg is om gecorreleerd HIV-1 deeltjes verliezen kan zijn), een cryo-fluorescentie micros...

Discussion

We hebben een eenvoudige set protocollen gepresenteerd aan een geavanceerde correlatieve benadering te analyseren dynamische cellulaire gebeurtenissen met behulp van time-lapse confocale, levende cellen fluorescentie beeldvorming gevolgd door cryoET bieden. De methodologische ontwikkeling 3D levende cellen beeldvorming met hoge resolutie cryoET correleren is cruciaal voor vele uitdagende biologische problemen, zoals zeldzame visualiseren, dynamische (niet statisch, zoals eerder vermeld), en diffractie beperkte virale de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa celcultuur op EM rasters
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A goudconjugaten	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescente microspheren	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Geel-groen fluorescerend
Heat-inactivated foetaal runderserum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicilline-Streptomycine	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Cultuurbakje met glazen bodem	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM rasters	Quantifoil Micro Tools, Jena, Duitsland	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Apparatuur
Glow-discharge apparaat 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 elektronenmicroscoop met een Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscoop	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2,7-4 mm werkafstand) objectieflens
Nikon TiE microscoop	Nikon Instruments, Melville, NY		met behulp van een 60X/1.35 NA olie-immersie objectieflens
Sweptfield confocale microscoop	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live celkamer	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescentie sample stage	Zelfgemaakt		Gebouwd door machinefabriek, zie referentie 15 voor het ontwerp.