Methodenartikel

5/6th Nephrectomy in combinatie met High Salt Dieet en stikstofoxide synthase Remming aan chronische nierziekte induceren in de Lewis rat

23.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50398

⸱

3 juli 2013

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology & Hypertension, University Medical Center Utrecht

In dit artikel

Samenvatting

Een tweetraps methode om chronische nierziekte (CKD) in de Lewis rat vast door operatief verwijderen 5/6th van renale massa wordt beschreven. Combinatie van de chirurgische procedure, NOS-remming en een hoge zoutconcentratie dieet leidt tot een model lijkt op menselijke CKD, waardoor studie van causale mechanismen en de ontwikkeling van nieuwe behandelingen.

Samenvatting

Chronische nierziekte (CKD) is een wereldwijd probleem. Vertragen CKD progressie is een belangrijke prioriteit voor de gezondheid. Aangezien CKD wordt gekenmerkt door complexe verstoringen van homeostase, integratieve diermodellen noodzakelijk om ontwikkeling en progressie van CKD bestuderen. Om de ontwikkeling van CKD en nieuwe therapeutische interventies bij CKD bestuderen, gebruiken we de 5/6th nefrectomie ablatie-model, een bekend experimenteel model van progressieve nierziekte, die lijkt op een aantal aspecten van het menselijk CKD. De bruto vermindering van de renale massa veroorzaakt progressieve glomerulaire en tubulo-interstitiële schade, verlies van overblijvende nefronen en de ontwikkeling van systemische en glomerulaire hypertensie. Het is ook geassocieerd met progressieve intrarenaal capillaire verlies, ontsteking en glomerulosclerose. Risicofactoren voor CKD steevast invloed op de endotheelfunctie. Om dit na te bootsen, combineren we het verwijderen van 5/6th van renale massa met stikstofmonoxide (NO) uitputting en een hoog zout dieet. Na aankomst en acclimatisatie, dieren opnieuwontvangstbericht NO synthase remmer (NG-nitro-L-arginine) (L-NNA) aangevuld in drinkwater (20 mg / L) gedurende 4 weken, gevolgd door rechtszijdige uninephrectomy. Een week later, wordt een subtotaal nefrectomie (SNX) uitgevoerd aan de linkerkant. Na SNX, worden dieren toegelaten om te herstellen voor twee dagen, gevolgd door LNNA in drinkwater (20 mg / L) voor een periode van 4 weken. Een hoog zout dieet (6%), aangevuld in de grond chow (zie tijdslijn figuur 1), wordt voortgezet gedurende het experiment. De progressie van nierfalen wordt gevolgd in de tijd door het meten van plasma-ureum, systolische bloeddruk en proteïnurie. Door zes weken na SNX heeft nierfalen ontwikkelde. Nierfunctie wordt gemeten met behulp van 'gouden standaard' inuline en para-amino hippuurzuur (PAH) klaring technologie. Dit model van CKD wordt gekenmerkt door een vermindering van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) en de effectieve renale plasma flow (ERPF), hypertensie (systolische bloeddruk> 150 mmHg), proteïnurie (> 50 mg/24 uur) En milde uremie (> 10 mM). Histologische kenmerken zijn tubulo-interstitiële schade weerspiegeld door een ontsteking, tubulaire atrofie en fibrose en focale glomerulosclerose leidt tot massale vermindering van gezonde glomeruli binnen de resterende populatie (<10%). Follow-up tot 12 weken na SNX toont verdere progressie van CKD.

Inleiding

Door zijn progressieve aard, voortvloeiende eindstadium nierziekte, en bijbehorende cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit, CKD is een groeiend probleem voor de volksgezondheid 1. Vertragen CKD progressie is daarom een ​​belangrijke prioriteit voor de gezondheid. Aangezien CKD wordt gekenmerkt door complexe verstoringen van homeostase, integratieve diermodellen noodzakelijk om ontwikkeling en progressie van CKD bestuderen. De nier bestaat uit een groot aantal verschillende celtypen met elkaar. Deze complexiteit kan niet worden nagebootst in vitro.

Om nieuwe therapeutische interventies bestuderen in CKD, gebruiken we de 5/6th nefrectomie ablatie-model, een bekend experimenteel model van progressieve nierziekte, die lijkt op een aantal aspecten van het menselijk CKD 2,3. De bruto vermindering van de renale massa veroorzaakt progressieve glomerulaire en tubulo-interstitiële schade, verlies van overblijvende nefronen en de ontwikkeling van systemische en glomerulaire hypertensie. Het wordt geassocieerd met progressive intrarenale capillaire verlies 4, ontsteking en glomerulosclerose. Risicofactoren voor CKD steevast invloed op de endotheelfunctie 5. We gebruikten een rat stam (Lewis) die relatief resistent tegen de ontwikkeling van CKD dus combineerden we verwijderd 5/6th van niermassa met stikstofoxide (NO) uitputting 6, 7, 8 en een hoog zoutdieet 9. Na aankomst en acclimatisatie, dieren krijgen een NO-synthase remmer (L-NNA) aangevuld tot drinkwater (20 mg / L) voor een periode van 4 weken, gevolgd door een recht eenzijdig uninephrectomy (UNX) met voortzetting van L-NNA na twee dagen . Een week later, wordt subtotaal nefrectomie (SNX) dwz verwijdering van 2/3e van renale massa uitgevoerd op de linkerkant. Na SNX worden dieren men herstellen gedurende 2 dagen, gevolgd door nogmaals 20 mg / L LNNA in drinkwater gedurende 4 weken. Een hoog zout dieet (6%), aangevuld in de grond chow (zie tijdslijn figuur 1), wordt voortgezet gedurende het experiment. Thij redenen de UNX voeren op de rechterkant en de SNX aan de linkerkant is de niervaten langer aan de linkerkant die het gemakkelijker maakt toegang tot de nier zonder de vaten strekken te veel als de nier wordt blootgesteld buiten het lichaam . In de literatuur worden beschreven modellen waarbij de polen van de linker nier eerst worden verwijderd, gevolgd door UNX van de rechter nier een week later 10,11,12. In onze handen bleek bij dit model een veel snellere ontwikkeling van nierfalen, maar ook een veel grotere variatie in verlies van nierfunctie. De progressie van nierfalen wordt gevolgd in de tijd door het meten van plasma-ureum, systolische bloeddruk en proteïnurie. Door zes weken na SNX heeft nierfalen ontwikkeld, gekenmerkt door duidelijke vermindering van glomerulaire filtratiesnelheid (69%) en een effectieve renale plasmastroom (62%) 13 hypertensie (systolische bloeddruk> 150 mmHg), proteïnurie (> 50 mg/24 hr) en milde uremie (> 10 mM). Histologische kenmerken zijn Tubulo-interstitiële schade weerspiegeld door een ontsteking, tubulaire atrofie en fibrose en focale glomerulosclerose leidt tot massale vermindering van gezonde glomeruli binnen de resterende populatie (<10%). Follow-up tot 12 weken na SNX toont verdere progressie van CKD, het verstrekken van een window of opportunity voor de evaluatie van therapeutische interventies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met het dier experimentele ethische richtlijnen van de Utrechtse proefdier commissie. Het protocol wordt uitgevoerd onder de leiding en goedkeuring van de auteur instelling dierlijke zorg en gebruik commissie.

CKD wordt geïnduceerd in mannelijke inteelt Lewis ratten (Charles River, Sulzfeld, Duitsland) op de leeftijd van 8 weken. Ratten worden gehuisvest onder standaard omstandigheden in een licht, temperatuur en vochtigheid geregelde omgeving.

1. Operatie Voorbereiding

  1. Steriliseren chirurgische instrumenten:
    • 1 student weefsel tang 1-2 tanden 12 cm
    • 1 student standaardpatroon tang
    • 2 Semken tang
    • 1 Mayo schaar
    • 1 student iris schaar
    • 1 Olsen-Hegar naaldhouder met een schaar
    • Deken
  2. Controleer inventarislijst:
    • Operatietafel met warming pad en lamp
    • O 2, isofluraan
    • Weefsels
    • Scheerapparaat
    • Weegschaal
    • Steriele operatiekamer set
    • Steriel gaas 5x5 en 10x10
    • 70% alcohol
    • 0,9% NaCl-oplossing
    • 1 ml spuit
    • Naalden (25G)
    • Gel foam pads: Spongostan
    • Vicryl 4.0 en 5.0
    • Buprenorfine 0,03 mg / kg (1:10 verdund in fysiologisch zout)
    • Schone kooi voor ratten na de operatie

2. Right Side Uninephrectomy

  1. Ontsmet de tafel met 70% alcohol.
  2. Plaats rat in inductie doos en induceren anesthesie met 4% isofluraan en 1 liter stroom van O 2. Opmerking: afhankelijk van de rat gebruikte stam, zijn pre-en peri-operatieve analgesie voorgeschreven, moet dit met de lokale dierenarts te bespreken.
  3. Overdragen rat aan tafel en plaats neus in kegel. De rat en de neuskegel zijn op een verwarmingselement geplaatst om de lichaamstemperatuur van de rat te behouden. De rat is geventileerd met een mengsel van 2% isofluraan en 1 liter O 2.
  4. Scheer de flank van de rat en te desinfecteren met alcohol. Was en desinfecteer handen en draag steriele chirurgische handschoenen. Draag een hoofdkap en een masker. Maak een 1-1,5 cm incisie evenwijdig aan de ribben met behulp van anatomische pincet en botte schaar. Expose de nier door stompe dissectie van de rugspieren.
  5. De onderste pool van de nier is zichtbaar, zorgvuldig gebruik maken van de kleine stompe tang om de perirenaal vetweefsel grijpen. Externaliseren de nier door zachtjes te trekken op de perirenaal vet met een tang. Zorg ervoor dat de bijnier tijdens deze procedure niet storen. De bijnier kan gemakkelijk worden verwijderd door een pincet op de mediale site in het vetweefsel en voorzichtig omhoog bewogen tussen de bijnier en de nier zoals weergegeven in figuur 2.
  6. Plaats nier zachtjes op gaas en helder van omringende vet en bindweefsel. Identificeer de nierslagader en ader en plaats een ligatuur (5.0vicryl) met een enkele knoop rond de vaten, maar niet afhechten de knoop.
  7. Verplaats de losse knot voorzichtig langs de vaten naar de aorta met ongeveer 0,5 cm, de ruimte tussen de nier en de knoop te creëren. Dit wordt gedaan om de ligatuur wegglijdt na snijden.
  8. Bind knoop met twee dubbele knopen. Als perfusie gestopt, zal de kleur van de nier onmiddellijk bruin veranderen. Niet knippen de uiteinden van de ligatuur.
  9. Snijd de renale vaten dichtbij de nier en verwijder de nier. Trek voorzichtig aan de lange zijden van de ligatuur te controleren op bloedingen van de renale vaten. De ligatuur moet blijven in plaats op het schip. Snijd de lange uiteinden van de ligatuur. Merk op, het overblijfsel niervaten trekken onmiddellijk in de buikholte.
  10. Dep weggesneden nier drogen en wegen.
  11. Sluit de skeletspieren incisie met hechtingen lopen met Vicryl 5.0. Injecteer 0,10 ml (0,03 mg / kg) buprenorfine im in de achterste ledematen. Sluit dehuid met Vicryl 4.0 met intracutane hechtingen. Dit voorkomt het openen van de ratten wond. Opmerking: als gevolg van respiratoire depressie bij Lewis ratten, geven we alleen postoperatieve analgesie net voor het uitschakelen van de isofluraan.
  12. Huisvesten van de rat in een schone eenzame kooi met gemakkelijke toegang tot voedsel en water. Plaats de kooi helft op aarde pad O / N en controleer de rat zorgvuldig de volgende dag. Wanneer de wond wordt gesloten en de rat actief, gewoonlijk tussen 6 en 12 uur na de operatie, kan de rat worden teruggeplaatst in groepshuisvesting.

3. Left Side Subtotaal Nephrectomy

  1. Zeven dagen later, worden dezelfde voorbereidingen aan de linkerzijde als de rechterzijde beschreven 2,1-2,5. Voor de operatie wordt de hoeveelheid nierweefsel die moet overeenkomen met ongeveer 2/3e van het gewicht van de rechter nier verwijderd worden berekend. Bereid kleine stukjes gel schuim (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) voor de operatie.
  2. Plaats scherpe schaar rond het bovenste pool van de linker nier en resect de bovenste paal in een slag (voor schaar locatie, zie figuur 3). Bedek onmiddellijk met een stukje gel schuim en oefenen lichte druk met een steriel gaasje.
  3. Herhaal dit met de onderste pool van de nier als in 3.3.
  4. Til nier te klonteren op de huid te voorkomen. Handhaaf milde druk op zowel gel foam pads met een steriel gaasje totdat het bloeden stopt. Bij het bloeden aanhoudt, voeg een ander foam pad.
  5. Plaats overblijfsel nier met aanhangend gel foam pads in de buik. Sluit de spieren en de huid en volg 2,9-2,12.

4. Sham Chirurgie

  1. Sham bediende ondergaan dezelfde procedure om de nieren bloot te leggen. In plaats van het uitroeien van de nier of het snijden van de polen een week later, zijn zowel de nieren ontkapseld op een interval, de zorg niet aan de bijnieren verstoren. Wondsluiting en post-operatieve zorg zijn identical om 2.11 en 2.12.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na subtotaal nefrectomie ongeveer 1/6e van de totale nierweefsel overblijft. Figuur 4 toont het gewicht van het verwijderde gedeelte van de rechter nier met gemiddelde en standaardafwijking twee eerdere experimenten. Men moet in gedachten houden dat in de week na UNX, hypertrofie van de linker nier plaatsvindt, blijkt dat het gewicht dat verwijderd moet worden berekend op basis van het gewicht van de rechter nier altijd resulteert in minder dan 5/6th verwijderen. Aangezien het niet mogelijk is het gewic...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Chirurgische verwijdering van 5/6th van nierweefsel in de Lewis rat, gecombineerd met een hoge zoutconcentratie dieet en tijdelijke NOS remming leidt tot een model van CKD dat menselijke CKD lijkt en maakt studie van causale mechanismen en effectiviteit van therapeutische interventies bij CKD.

De 5/6th nefrectomie model is een bekende en uitvoerig beschreven model voor CKD. Echter, simpelweg verwijderen van 5/6th van renale massa niet leiden tot een onmiddellijke nierfalen in alle ratten sta...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Krista den Ouden voor haar uitstekende technische bijstand. Deze techniek werd financieel ondersteund door de Nederlandse Nierstichting, subsidie ​​C06.2174. MCV wordt door Nederland ondersteunde organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) Vidi-subsidie ​​016.096.359.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
   Reagens
L-NNASigma-aldrichN5501 
Spongostan tandheelkundig: gel schuim pads 1x1x1 cmJohnson&JohnsonMs0005 
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36EthiconV303H 
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36EthiconV392H 
Buprenorfine (0,3 mg/ml)Via lokale apotheker besteld door Reckitt Benckiser pharmaceuticalsonbekend 
   Uitrusting
Student Tissue Forceps - 1x2 Teeth 12 cmFine Science Tools (FST)91121-12 
Student Standard Pattern ForcepsFST91100-12 
Mayo SchaartjesFST14010-15 
2X Semken ForcepsFST11008-13 
Student Iris ScissorsFST91460-11 
Olsen-Hegar Needle HolderFST12002-14 

Referenties

  1. AS, G. o, Chertow, G. M., Fan, D., McCulloch, C. E., Hsu, C. Y. Chronic kidney disease and the risks of death, cardiovascular events, and hospitalization. N. Engl. J. Med. 351 (13), 1296-1305 (2004).
  2. Fleck, C., Appenroth, D., et al. Suitability of 5/6 nephrectomy (5/6NX) for the induction of interstitial renal fibrosis in rats--influence of sex, strain, and surgical procedure. Exp. Toxicol. Pathol. 57 (3), 195-205 (2006).
  3. Griffin, K. A., Picken, M. M., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A. K. Functional and structural correlates of glomerulosclerosis after renal mass reduction in the rat. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (3), 497-506 (2000).
  4. Kang, D. H., Kanellis, J., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
  5. Baylis, C. Nitric oxide synthase derangements and hypertension in kidney disease. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 21 (1), 1-6 (2012).
  6. Bongartz, L. G., Braam, B., et al. Transient nitric oxide reduction induces permanent cardiac systolic dysfunction and worsens kidney damage in rats with chronic kidney disease. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298 (3), 815-823 (2010).
  7. Fujihara, C. K., De N, G., Zatz, R. Chronic nitric oxide synthase inhibition aggravates glomerular injury in rats with subtotal nephrectomy. J. Am. Soc. Nephrol. 5 (7), 1498-1507 (1995).
  8. Fujihara, C. K., Sena, C. R., Malheiros, D. M., Mattar, A. L., Zatz, R. Short-term nitric oxide inhibition induces progressive nephropathy after regression of initial renal injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (3), F632-F640 (2006).
  9. Dikow, R., Kihm, L. P., et al. Increased infarct size in uremic rats: reduced ischemia tolerance? J. Am. Soc. Nephrol. 15 (6), 1530-1536 (2004).
  10. Elrashidy, R. A., Asker, M. E., Mohamed, H. E. Pioglitazone attenuates cardiac fibrosis and hypertrophy in a rat model of diabetic nephropathy. J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther. 17 (3), 324-333 (2012).
  11. Haylor, J., Schroeder, J., et al. Skin gadolinium following use of MR contrast agents in a rat model of nephrogenic systemic fibrosis. Radiology. 263 (1), 107-116 (2012).
  12. Moriguchi, Y., Yogo, K., et al. Left ventricular hypertrophy is associated with inflammation in sodium loaded subtotal nephrectomized rats. Biomed. Res. 32 (2), 83-90 (2011).
  13. van Koppen, A., Joles, J. A., et al. Healthy bone marrow cells reduce progression of kidney failure better than CKD bone marrow cells in rats with established chronic kidney disease. Cell Transplant. , (2012).
  14. Baylis, C., Corman, B. The aging kidney: insights from experimental studies. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (4), 699-709 (1998).
  15. Szabo, A. J., Muller, V., Chen, G. F., Samsell, L. J., Erdely, A., Baylis, C. Nephron number determines susceptibility to renal mass reduction-induced CKD in Lewis and Fisher 344 rats: implications for development of experimentally induced chronic allograft nephropathy. Nephrol. Dial Transplant. 23 (8), 2492-2495 (2008).
  16. Darling, I. M., Morris, M. E. Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion. Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).
  17. Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney Int. 38 (1), 167-184 (1990).
  18. Myers, G. L., Miller, W. G., et al. Recommendations for improving serum creatinine measurement: a report from the Laboratory Working Group of the National Kidney Disease Education Program. Clin. Chem. 52 (1), 5-18 (2006).
  19. Hostetter, T. H., Meyer, T. W. The development of clearance methods for measurement of glomerular filtration and tubular reabsorption. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287 (5), F868-F870 (2004).
  20. Koeners, M. P., Racasan, S., Koomans, H. A., Joles, J. A., Braam, B. Nitric oxide, superoxide and renal blood flow autoregulation in SHR after perinatal L-arginine and antioxidants. Acta. Physiol. (Oxf). 190 (4), 329-338 (2007).
  21. van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
  22. Kreutz, R., Kovacevic, L., Schulz, A., Rothermund, L., Ketteler, M., Paul, M. Effect of high NaCl diet on spontaneous hypertension in a genetic rat model with reduced nephron number. J. Hypertens. 18 (6), 777-782 (2000).
  23. Liu, Z. C., Chow, K. M., Chang, T. M. Evaluation of two protocols of uremic rat model: partial nephrectomy and. 25 (6), 935-943 (2003).
  24. Griffin, K. A., Picken, M., Bidani, A. K. Method of renal mass reduction is a critical modulator of subsequent hypertension and glomerular injury. J. Am. Soc. Nephrol. 4 (12), 2023-2031 (1994).
  25. Meyer, F., Ioshii, S. O., et al. Laparoscopic partial nephrectomy in rats. Acta. Cir. Bras. 22 (2), 152-156 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Model voor chronische nierziektemeting van de nierfunctieinulineklaringPAH klaringmeting van prote nuriesystolische bloeddruk

Gerelateerde artikelen