Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

Summary

Deze video artikel illustreert de set-up, de procedures te cellichamen patchen en hoe u dynamische clamp opnames implementeren van ganglioncellen in zijn geheel-mount muis retinae. Deze techniek maakt het onderzoek de exacte rol prikkelende en remmende synaptische inputs, en hun relatieve omvang en timing neuronale spiking.

Abstract

Ganglioncellen de output vormen van de retina en de activiteit weerspiegelt de integratie van meerdere synaptische inputs die samenhangen met specifieke neurale circuits. Patch-clamp technieken, in voltage en stroom clamp clamp configuraties worden gewoonlijk gebruikt om de fysiologische eigenschappen van neuronen te bestuderen en om hun synaptische inputs karakteriseren. Hoewel de toepassing van deze technieken is zeer informatief, zij vormen diverse beperkingen. Bijvoorbeeld, is het moeilijk te kwantificeren hoe de precieze interacties van prikkelende en remmende inputs bepalen reactie output. Om dit probleem aan te pakken, hebben we gebruik gemaakt van een gemodificeerde stroom clamp techniek, dynamische klem, ook wel geleiding klem ^{1, 2, 3} en onderzocht de impact van de prikkelende en remmende synaptische inputs op de neuronale prikkelbaarheid. Deze techniek vereist de injectie van stroom in de cel en is afhankelijk van de real-time feedback van de membraanpotentiaal op dat moment. De injected stroom wordt berekend op basis van vooraf bepaalde prikkelende en remmende synaptische conductances, hun omkering potentieel en ogenblikkelijke membraanpotentiaal van de cel. Details over de experimentele procedures, worden patch klemmen cellen om een ​​whole-cell configuratie en de werkgelegenheid van de dynamische clamp techniek bereiken geïllustreerd in deze video artikel. Hier tonen we de responsen van muizen retinale ganglioncellen verschillende geleiding golfvormen verkregen fysiologische experimenten controle omstandigheden of de aanwezigheid van drugs. Verder tonen we het gebruik van kunstmatige prikkelende en remmende geleidingen gegenereerd middels alpha functies om de reacties van de cellen te onderzoeken.

Introduction

Het netvlies is een bijna transparante neuraal weefsel langs de achterkant van het oog. Veel studies gebruiken het netvlies als het model om de eerste stappen in de verwerking van visuele en mechanismen van synaptische signalering te onderzoeken. Aangezien de retinale netwerk van het-mount preparaat intact blijft na sectie, vormt dit een ideaal systeem synaptische interacties te bestuderen als fysiologische reacties zijn vergelijkbaar met de in vivo omstandigheden. Dus, met behulp van een geïsoleerde retina de eigenschappen van zijn neuronen kunnen worden bestudeerd met behulp van patch clamp technieken (voor reviews over de techniek, zie ^6,9,13). Identificatie van de precieze bijdrage van specifieke circuits en neurotransmitters ganglion cel respons echter meestal belemmerd als farmacologische middelen werken op verschillende sites.

Fysiologische reacties van retinale neuronen aan het licht, de natuurlijke stimulus, kan worden opgenomen met glazen pipetten gevuld met intracellulaire vloeistof. Met behulp van patch clamp technieken, neuronale reacties op licht stimulatie kan worden opgenomen als membraanpotentiaal fluctuaties (stroomtang) of als stromingen (voltage clamp). Door die de membraanpotentiaal op verschillende voltages en uitvoering a posteriori geleiding analyse is het mogelijk remmende en prikkelende synaptische inputs isoleren ^5,12. Dit soort experimenten worden uitgevoerd in normale baden medium en in de aanwezigheid van verschillende farmacologische middelen om de bijdrage van verschillende neurotransmitters en receptoren neuronale reacties isoleren. Een schat aan studies van vele laboratoria gekarakteriseerd de afhankelijkheid van stekelige output en prikkelende en remmende ingangen op stimulus eigenschappen zoals grootte, contrast, ruimtelijke en temporele frequenties, richting, oriëntatie en andere stimulus variabelen. Hoewel deze experimentele benaderingen geven informatie over de relatie tussen de spike output en synaptische inputs als functie van stimulus eigenschappen,interpretatie van de bijdrage van specifieke celtypen en hun synaptische inputs naar cel exciteerbaarheid niet eenvoudig. Dit komt door het feit dat zowel typische prikkelende en remmende inputs variëren stimulus eigenschappen en dus is het niet mogelijk om het precieze effect dat veranderingen in een van deze parameters moet op neuronale spiking beoordelen.

Een alternatieve benadering om deze beperkingen te omzeilen is voor het uitvoeren van dynamische clamp opnames, die een kritische evaluatie van de bijdrage van de individuele synaptische inputs naar stekelige uitgang toestaan. De dynamische clamp techniek maakt directe injectie van stroom in de cel en de hoeveelheid stroom geïnjecteerd in een bepaald afhankelijk van de opgenomen membraanpotentiaal destijds ^1,2,3 (zie voor ^7,14). Het is een gemodificeerde stroomklem set-up waarbij een real-time, snelle feedback interactie tussen de cel onder opname en de apparatuur bestaande uit gespecialiseerde hardware, softwareen een computer bereikt. De hoeveelheid stroom geïnjecteerd in de cel wordt dienovereenkomstig berekend. Vandaar dat het voordeel van deze methode is dat de cellen kunnen worden gestimuleerd met verschillende combinaties geleidingstijd golfvormen en de reactie zal de activatie van receptoren die synaptische inputs bemiddelen nabootsen. Bijvoorbeeld, vergelijking van de reactie op injectie van prikkelende en remmende geleidingen voor een kleine vlek met de reactie op injectie van prikkelende geleiding voor een kleine vlek alleen informatie over het effect van remming op de celrespons. Ook andere combinaties van fysiologisch opgenomen conductances collocatie kan worden geïnjecteerd om te onthullen hoe stimulus-afhankelijke veranderingen in prikkelende en / of remmende conductances invloed spike output.

In onze studie is de dynamische clamp techniek gebruikt om het effect van de relatieve amplitude en tijdstip van synaptische inputs op de vuurgedrag van retinale ganglion cellen vertonen. Diverse conductantiesverkregen fysiologische experimenten controle omstandigheden of in aanwezigheid van farmacologische middelen werden gebruikt als input. Daarnaast zijn kunstmatige geleidingen gebaseerd op alpha functies ook gebruikt om te onderzoeken hoe synaptische inputs worden geïntegreerd door neuronen. Dit is dus een veelzijdige techniek die het mogelijk maakt verschillende soorten geleiding gegenereerd ofwel fysiologisch, farmacologisch of rekenkundig worden geïnjecteerd in dezelfde ganglion cel, zodat de respons op deze ingangen worden.

Protocol

1. Algemene Set Up en Tissue Voorbereiding

1. Houd de muis in het donker gedurende 30 minuten (gericht haar stress niveau te verlagen). Tijdens het wachten, bereiden 1 L van extracellulaire oplossing. Los eerste 1,9 g natriumbicarbonaat in een halve liter Milli-Q water. De pH wordt op 7,4 door borrelen met 95% _O2 en 5% _CO2. Vijf minuten later, los 8,8 g Ames Medium in 100 ml Milli-Q water, toe te voegen aan de oplossing van natriumbicarbonaat, top tot 1 L met Milli-Q water en meng goed. Bewaar deze oplossing carboxygenated de rest van het experiment.
2. Breng 250 ml van de carboxygenated Ames Medium en het opzetten van de vloeistof reperfusie systeem in de elektrofysiologische set-up. Bewaar de oplossing carboxygenated.
3. Gelijkmatig uitstrijkje een dun laagje vacuüm vet op de bodem van de perfusie kamer. Sluit deze af met een deksel slip en zorg ervoor dat het luchtdicht. Neem een ​​kleine hoeveelheid vet (~ 2 mm in diameter) en plaats het op de boven-enonderste uiteinden van de kamer. Deze ballen zullen de grid (platina kader bespannen met flosdraad) op zijn plaats houden en voorkomen dat het te stevig op het netvlies. Bevestig de kamer op het platform en lijn beide openingen.
4. Het dier wordt eerst verdoofd met isofluraan gedurende 2 min, en vervolgens gedood door cervicale dislocatie. Snel ogen verwijderen met een paar kleine schaar (schoepen), grondig wassen met carboxygenated extracellulair vocht in een kleine beker, en dan plaatsen in een petrischaal gevuld met carboxygenated extracellulair vocht.
5. Onder de microscoop ontleden, maakt een insteekopening in het hoornvlies (~ 2 mm van de rand) met een 19 gauge naald. Herhaal voor het andere oog. Deze belangrijke stap moet snel zijn om zuurstofvoorziening van beide retinae toestaan. Verwijder een cornea met een klein paar van iris schaar door parallelle snijden aan de rand. Verwijder vervolgens de iris en de lens met een paar fijne tang. Herhaal voor het andere oog. Overdracht een oog beker in een bekerglas metcarboxygenated extracellulaire oplossing.
6. Met een scalpel, snij een oogschelp in de helft, kunnen de hele-mount plat en twee hele mounts per retina verkrijgen. Scheiden het netvlies voorzichtig uit het pigment epitheel met een bot ontleden sonde of door voorzichtig los te trekken. Eenmaal los, het netvlies is tamelijk doorzichtig. Let op de convexe oppervlak is de fotoreceptoren kant. Het concave oppervlak van de ganglioncellen kant en het vastplakken aan zich door de aanwezigheid van kleverige glasachtige humor.
7. Met een paar fijne tang, houdt u de rand van de vrijstaande netvliesweefsel dicht bij de ora serrata en pak de ora serrata met een ander paar fijne tang, trek hem naar het centrum van het netvlies. Dit is een delicaat proces en kan een paar pogingen nemen. Indien succesvol, worden ora serrata, ciliaire lichaam en glasvocht verwijderd door deze werkwijze, en de kromming van het netvlies wordt (bijvoorbeeld platter).
8. Trim de randen, en vervolgens overbrengen naar de perfusiekamer met ganglioncellen naar boven. Houd het weefsel op zijn plaats door het plaatsen van het rooster op het vet ballen. Plaats restmateriaal met het andere oog beker voor later gebruik. Vergelijkbare procedures voor retinale dissectie worden beschreven in Middleton en Protti ¹⁶ en Pottek et al.. ^17.
9. Monteer de opname kamer onder een microscoop rechtop. Onmiddellijk zetten de continue perfusie van het netvlies met carboxygenated extracellulaire oplossing (35,5 ° C) met een snelheid van 3 - 5 ml / min. Zorg ervoor dat de aardelektrode is op zijn plaats.
10. Aan de microscoop een digitale camera waardoor visualisatie van het weefsel. De hele set-up zit boven een air tabel (schokabsorptie) en in een kooi van Faraday (blokken externe statische en niet-statische elektrische velden).
11. Schakel de lichtbron (infrarood,> 850 nm) en met een 40X objectief, breng de focus op de cellichamen van zenuwcellen. Vind de centrale ruimte van de hele-mount voor Recording.
12. Ontdooi een bevroren flacon K ⁺ gebaseerde intracellulaire oplossing (300 pl, pH = 7,4) bevattende (in mM) K-gluconaat: 140, HEPES acid: 10, _MgCl2: 4,6, ATP-Na ^+: 4, GTP-Na ⁺ : 0.4 en EGTA: 10. Alle reagentia gekocht bij Sigma-Aldrich.

2. Patchen Cell Organen van retinale ganglioncellen

1. Eerste brand polijsten de uiteinden van borosilicaatglas capillaire glazen buis, en trek ze met een glas micro-elektrode Puller met twee stappen verwarming (weerstand: 5-8 MQ).
2. Voeg 3 ul van Lucifer Yellow (eindconcentratie 0.2%) naar de intracellulaire oplossing, meng goed, en centrifuge het. Vervolgens dragen de top 85% van de oplossing in een 1 ml spuit, sluit het aan op een 0,22 pm f Ilter eenheid, vervolgens naar een 30 G herbruikbare injectienaald. Koel.
3. Bevestig de glazen pipet, van vergelijkbaar formaat tip als die worden gebruikt voor de opnames, in de houder en schuif het onder de microscoop met een micromanipulator. Onder een 40X objectief, langzaam lager de pipet totdat deze een klein kuiltje op het oppervlak van het binnenste beperkende membraan. Zorgvuldig vooraf de pipet naar voren totdat deze vangt een kleine hoeveelheid weefsel, en dan verplaatsen naar boven en / of zijwaarts naar een klein gaatje aan de cellichamen van de ganglion cellen bloot te scheuren. Hoe kleiner de opening, hoe hoger de mate van integriteit van het netvlies net gewaarborgd blijft. Desgewenst sulforhodamine 101 (SR101, 0,5-1 uM) kunnen worden toegevoegd aan het extracellulaire medium van beschadigde neuronen labelen met fluorescentiemicroscopie ^15.
4. Vul een schone pipet met 8-10 pl intracellulaire oplossing. Steek deze in de houder bevestigd aan het hoofd podium van de versterker en zorg ervoor dat de gechloreerde zilverchloride elektrode wordt ondergedompeld. Weggooien als vuil en / of luchtbellen aanwezig is / zijn.
5. Schakel alle apparatuur. We gebruikten een EPC 8 patch clamp versterker aangestuurd door PatchMaster om whole-cell opnames realiseren in spanningsklem configuratie. Merk op dat andere versterkers die stroomklem opnames toestaan ​​in de snelle modus kan ook worden gebruikt. Toepassen en onderhouden van positieve druk in de pipet oplossing. Selecteer een cel met een grote cellichaam dus waarschijnlijk het is een ganglion cel dan een verplaatst amacrine cel of een glia cel. Langzaam zakken de pipet tip dus het is een kleine kuiltje op het oppervlak van het membraan, stoppen, en laat de druk. Onmiddellijk lager de holding potentieel om - 60 mV. Zodra een gigaseal (GQ) wordt bereikt tussen hen, zachtjes zuigen aan het membraan te breken naar een whole-cell patch clamp configuratie te bereiken. Deze procedure is een delicate stap, als er teveel negatieve druk wordt toegepast, is de verbinding lek wordt, indien te weinig, het membraan intact blijft.
6. Na verloop van tijd, zal Lucifer Geel de cel te vullen, waardoor visualisatie van de morfologie van de cel. Indienstabiel moet deze set-up 30 min of meer duren.

3. Opnames van ganglioncellen gebruiken Dynamic Clamp

1. Ten eerste, een stroom-voltage test (van - 75 tot + 35 mV elke 10 mV) wordt uitgevoerd met behulp van PatchMaster. Overgaan tot later testen alleen als een groot Na ⁺ stroom (> 1 nA) aanwezig is. Merk op dat in de zeldzame gelegenheid waar een ontheemde amacrine cel is gepatcht, in dat geval, zal niet antwoorden met treinen van actiepotentialen op latere huidige injecties.
2. Open LabVIEW en uitvoeren van de op maat geschreven Neuroakuma programma, dan laadt verschillende geleiding golfvormen. Stel herhaal nummer tot 8 (6 - 8 voor statistische doeleinden). Set omkering potentieel van prikkelende en remmende conductances bij 0 en - respectievelijk 75 mV. Selecteer een bijpassende paar prikkelende en remmende conductances voor het testen. Prikkelende geleiding trace (in groen) en remmende geleiding trace (in rood) verschijnen op het onderste paneel.
3. Ga terug naar PatchMaster, selecteert stroomtang modus, en meteen overschakelen van de versterker naar stroomtang modus 'CC + Comm FAST'. Deze modus maakt het mogelijk om accurately volgen snelle veranderingen in de membraanpotentiaal. Als er een goede afdichting tussen het membraan en de pipet wordt onderhouden, weinig / geen compensatie nodig is, anders zal de opname niet lang duren. In Neuroakuma, drukt u op de "record" knop. De cellulaire respons (meestal met een driefase uitbarsting van actiepotentialen, figuur 1A) verschijnt op het bovenste paneel. Injecteren stroom in de cel met lage schalen van conductances eerste, als weinig / geen antwoord wordt waargenomen, te verhogen in kleine stapjes totdat het produceert een sterke reactie. Overmatige stroom injectie kan de cel te doden. Zodra tests zijn voltooid, selecteert u een nieuw paar geleiding golfvormen, herhaalt u de bovenstaande voor alle paren van fysiologische en kunstmatige geleidingen. De fysiologische stromen (I) geïnjecteerd in real time zijn gebaseerd op:
   I (t) = G _exc (t) x _(Vm (t) - V _exc) + _inw G (t) x _(Vm (t) - V _inw)

Geleiding (G in ns) zou kunnen zijn synaptic of kunstmatig. Prikkelende en remmende synaptische geleiding golfvormen werden uit eerdere experimenten uitgevoerd door Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen en Solomon (ongepubliceerde resultaten) in reactie op verschillende stimuli in visuele controle condities en in aanwezigheid van tetrodotoxine (TTX, 1 uM) . Kunstmatige geleiding golfvormen werden gemodelleerd met een alfa functie. V _m (in mV) is de opgenomen membraanpotentiaal. G _exc en G _inh vertegenwoordigen prikkelende en remmende conductances respectievelijk terwijl V _exc en V _inh vertegenwoordigen de omkering potentieel van prikkelende en remmende conductances respectievelijk. Tijd is t in ms. Bemonsteringsfrequentie is 40 kHz.
I _s = I ₀ (t / α) ^e-αt

De bovenstaande vergelijking is een alpha-functie (I ₀ = maximale stroom; 1 / α = tijd tot piek ^(sec-1) van de huidige). De stijgtijd en de vervaltijd van de synaptischestroom wordt bepaald door α ^4. De prikkelende geleidbaarheid was onveranderd terwijl de latentie van de remmende geleiding werd gewijzigd, waardoor de vertraging ten opzichte van het begin van excitatie (figuur 2D).

4. Na de opname, zorgvuldig de pipet terug te trekken, zodat de cel lichaam intact blijft. Onmiddellijk de tissue in 4% paraformaldehyde gedurende 30 min, gevolgd door drie 10 min wassingen met 0,1 M fosfaatbuffer. Koel en uitvoeren antilichaamkleuring de volgende dag of binnen een week.

4. Antilichaamkleuring tegen Lucifer Yellow Gevuld retinale ganglioncellen

1. Antilichaamkleuring tegen Lucifer Yellow gevuld ganglioncellen bij kamertemperatuur (primaire anti-Lucifer Yellow rabbit IgG (verdunning = 1:10.000) gedurende vijf dagen, op de zesde dag overnacht kleuring met secundaire geit anti-konijn IgG (1:500 verdunning = )). Nat monteren het netvlies in Fluorescent Behoud Media. Bedek slip en verzegelen met nagel polish.
2. Neem confocale beelden van de cel morfologie met een Leica Spec-II confocale microscoop (Figuur 1B). De aanwezigheid van een axon maakt de bevestiging van ganglioncellen.

Results

De bijdrage van de verschillende bronnen van remmende ingangen aan ganglion cel responsen wordt aangetoond door de toepassing van verschillende geleiding golfvormen. Deze golfvormen werden verkregen met stimuli van verschillende luminantie in normale omstandigheden en in aanwezigheid van TTX, een spanningsafhankelijke Na ⁺ kanaal blocker blokkeert actiepotentiaal genereren slechts een subset van retinale remmende interneuronen. Figuur 2A toont een representatief reactie op injectie van prikke...

Discussion

Hier tonen we gebruik van dynamische klem om de invloed van de verhouding en de relatieve timing van excitatie en inhibitie van retinale ganglioncellen uitgang beoordelen. Dynamische klem wordt gebruik gemaakt van computersimulaties om fysiologisch opgenomen of kunstmatige synaptische conductances introduceren in levende neuronen. Deze methode biedt een interactief instrument waarmee geleidingen kunnen worden gemodificeerd en geïnjecteerd in neuronen voor het berekenen van hun invloed op neuronale reacties. Conductantie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagens
Isofluraane Inhalatieanesthesie	Pharmachem
Ames Medium met L-Glutamaat (Poeder)	Sigma-Aldrich
Kaliumgluconaat, Watervrij	Sigma-Aldrich
HEPES Natriumzout	Sigma-Aldrich
Magnesiumchlorideoplossing (4,9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-trifosfaat (ATP) dinatriumzouthydraat	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-trifosfaat natriumzouthydraat	Sigma-Aldrich
Ethyleenglycol-bis(2-amino–ethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Poeder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Geel, Konijn IgG Fractie (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Geit Anti-Konijn IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Behoud Media	BioFX Laboratories Inc.
Utrusting
Kapillair glazen buis met vlam gepolijste uiteinden (OD = 1,50 mm, ID = 0,86 mm, Lengte = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Enkeltraps glazen micro–elektrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0,22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Herbruikbare Hypodermische Naald: 30 G	Smith Nephew (Australië)
Enkel Inline Oplossing Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatische Temperatuur Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscoop SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscoop BX50WI: met 40X objectief	Olympus Corporation
0-30 V 2,5 A DC Voeding	Dick Smith Electronics	Q1770
Digitale Microscopische Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Versterker EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisitie Systeem	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation