De Ex vivo Dual recirculatie menselijke placenta perfusie model kan worden gebruikt om de overdracht van xenobiotica en nanodeeltjes de humane placenta onderzoeken. In deze video protocol beschrijven we de apparatuur en technieken die nodig zijn voor een succesvolle uitvoering van een placenta perfusie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Decennia geleden de menselijke placenta werd gedacht aan een ondoordringbare barrière tussen moeder en ongeboren kind. De ontdekking van thalidomide geïnduceerde aangeboren afwijkingen en vele latere studies later bleek het tegenovergestelde. Vandaag verschillende schadelijke lichaamsvreemde stoffen, zoals nicotine, heroïne, methadon of drugs evenals milieuverontreinigende stoffen werden beschreven om deze barrière te overwinnen. Met het toenemende gebruik van nanotechnologie, de placenta waarschijnlijk met nieuwe nanodeeltjes in aanraking te komen, hetzij per ongeluk door blootstelling of opzettelijk in het geval van potentiële nanomedische toepassingen. Gegevens van dierproeven die niet kunnen worden geëxtrapoleerd naar de mens, omdat de placenta is de meest soortspecifieke zoogdieren orgel 1. Daarom is de ex vivo dual recirculerende menselijke placenta perfusie, ontwikkeld door Panigel et al.. In 1967 2 en voortdurend gemodificeerd door Schneider et al.. 1972 3, kan dienen als een uitstekend model to studie van de overdracht van xenobiotica of deeltjes.
Hier richten we ons op de ex vivo dual recirculatie menselijke placenta perfusie-protocol en de verdere ontwikkeling tot reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
De placenta's werden verkregen na geïnformeerde toestemming van de moeders van ongecompliceerde zwangerschappen termijn ondergaat keizersnede. De foetale en maternale vaartuigen van een intact zaadlobben werden van een canule en geperfuseerd ten minste vijf uur. Als model fluorescent gelabeld polystyreen deeltjes met grootten van 80 en 500 nm in diameter werd toegevoegd aan de moeder circuit. De 80 nm deeltjes in staat waren om de placenta te passeren en zorgen voor een perfect voorbeeld van een stof die wordt overgedragen via de placenta naar de foetus tijdens de 500 nm deeltjes in de placenta weefsel of moeder circuit werden behouden. De ex vivo menselijke placenta perfusie model is een van de weinige modellen verstrekken van betrouwbare informatie overhet mobiliteitsgedrag van xenobiotica op een belangrijk weefsel barrière die voorspellende en klinisch relevante gegevens levert.
Inleiding
De placenta is een complex orgaan dat verantwoordelijk is voor de uitwisseling van zuurstof, kooldioxide, nutriënten en afvalproducten en tegelijkertijd kunnen de twee circuits bloed van de moeder en de groeiende foetus van elkaar gescheiden te houden. Daarnaast zorgt het ervoor dat de afwijzing van het kind door de moeder immuunsysteem en scheidt hormonen af om zwangerschap te behouden. De cellulaire barrière wordt gevormd door de cytotrofoblastcellen die een getrouw syncytia fuseren en vormen zonder zijdelingse celmembranen 4,5. De gehele placenta bestaat uit verschillende zaadlobben, welke foetale villous boom bevatten en vormen een functionele eenhei....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiden van de perfusie-systeem
- Het opzetten van de perfusie-systeem, bestaande uit een waterbad, een perfusie kamer, twee kolommen voor zuurstoftoevoer, twee peristaltische pompen, twee bubble vallen, twee boilers en een druksensor (figuur 1). Verbind deze componenten met buissecties uit silicone en polyvinylchloride materialen volgens het schema in figuur 2. Tenslotte zijn er twee circuits die de foetus en de moeder circuit, respectievelijk.
- Schakel het waterbad, de stroming kachels en verwarming voor de perfusie kamer. Moet de temperatuur 37 ° C.
- Warm de perfusiemedium (NCTC-135 weefselcultuu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 4A toont de perfusie profielen van kleine polystyreen deeltjes (80 nm) die door de placenta getransporteerd vergeleken grotere polystyreen deeltjes (500 nm) die niet naar de foetale compartiment. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde deeltjesconcentratie op de gegeven tijdstip ten minste 3 onafhankelijke experimenten. Voor polystyreen nanodeeltjes de overdracht placenta is grootte-afhankelijke 19. Na 3 uur van placenta perfusie al 20-30% van de oorspronkelijk toegevoegde 80 .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Onder de dubbele recirculerende perfusie hier blijkt, zijn er verschillende andere experimentele configuraties mogelijk, afhankelijk van de vraag die moet worden beantwoord. Vooral geopend placenta perfusie worden vaak gebruikt om de klaring te beoordelen bij steady-state concentratie 3. De recirculerende perfusie opstelling kan ook worden toegepast op actief transport van endogene of exogene stoffen bevestigen. Voor deze benadering dezelfde concentratie van de lichaamsvreemde moet worden toegevoegd aan de ma.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt financieel ondersteund door de Zwitserse Nationale Stichting, (NRP 64 programma, verlenen geen 4064-131232).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
| Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
| D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
| Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
| Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
| Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
| Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
| Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
| Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| EQUIPMENT | |||
| Water bath | VWR | 462-7001 | |
| Thermostat | IKA-Werke GmbH Co. KG | 3164000 | |
| Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
| Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| Notebook | Hewlett Packard | ||
| Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
| Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
| Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
| Blunt cannulae ( 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| Blunt cannulae ( 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| Blunt cannulae ( 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| Blunt cannulae ( 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm | VWR | 291-1212 | |
| Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
| Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| pH meter + electrode | VWR | 662-2779 |
Referenties
- Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
- Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
