Methodenartikel

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

16K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50443

⸱

16 juli 2013

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

In dit artikel

Samenvatting

Intercellulaire Ca 2 +-Golven worden gedreven door gap junctie kanalen als hemikanalen. Hier beschrijven we een methode om intracellulaire Ca meten 2 +-Golven in celmonolagen in reactie op een lokale eencellige mechanische stimulus en de toepassing ervan op de eigenschappen en de regulering van de gap junction kanalen en hemikanalen onderzoeken.

Samenvatting

Intercellulaire communicatie is essentieel voor de coördinatie van fysiologische processen tussen cellen in diverse organen en weefsels zoals de hersenen, lever, retina, cochlea en vaatstelsel. In experimentele opstellingen, intracellulaire Ca2 +-golven worden opgewekt door een mechanische prikkel een enkele cel. Dit leidt tot de afgifte van de intracellulaire signalerende moleculen IP3 en Ca2 + die de voortplanting van de Ca 2 +-golf inleiding concentrisch van de mechanisch gestimuleerde cel om de naburige cellen. De belangrijkste moleculaire pathways die intercellulaire Ca2 +-golven controle worden geleverd door gap junction kanalen via de rechtstreekse overdracht van IP-3 en door hemikanalen door het vrijkomen van ATP. Identificatie en karakterisering van de eigenschappen en de regelgeving van de diverse connexin en pannexin isovormen als gap junction kanalen en hemikanalen zijn toegestaan ​​door de quantification van de verspreiding van de intercellulaire Ca 2 +-golf, siRNA, en het gebruik van remmers van gap junction kanalen en hemikanalen. Hier beschrijven we een methode om intracellulaire Ca2 +-golf in monolagen van primaire corneale endotheliale cellen met Fluo4-vm in antwoord op een gecontroleerde en gelokaliseerde mechanische stimulus veroorzaakt door een acuut en kortdurend vervorming van de cel te meten als gevolg het aanraken van de celmembraan met een micromanipulator gecontroleerde glazen micropipet met een tip diameter van minder dan 1 urn. Ook beschrijven de isolatie van primaire boviene corneale endotheelcellen en het gebruik ervan als modelsysteem voor Cx43 hemichannel activiteit uitoefent als de aangedreven kracht intracellulaire Ca 2 +-golven door het vrijkomen van ATP. Tenslotte bespreken we het gebruik, voordelen, beperkingen en alternatieven van deze werkwijze in het kader van gap junction kanaal en hemichannel onderzoek.

Inleiding

Intercellulaire communicatie en signalering zijn essentieel voor de coördinatie van fysiologische processen in reactie op extracellulaire agonisten op weefsel en hele-orgaan level 1,2. De meest directe manier intercellulaire communicatie wordt door het optreden van gap junctions. Gap junctions zijn plaquettes van gap junction kanalen, die eiwitachtige kanalen gevormd door de head-to-head couperen van twee connexine (Cx) hemichannels van aangrenzende cellen 3,4 (figuur 1) zijn. Gap junctions doorlaten kleine signaalmoleculen met een molecuulgewicht van minder dan 1,5 kDa, zoals Ca2 + of IP 3 5, waardoor modulerende Ca2 +-afgifte uit de intracellulaire opslagplaatsen van de naburige cellen 6 (figuur 2). Gap junction kanalen zijn strak gereguleerd door intra-en intermoleculaire eiwit interacties en door cellulaire signalering processen, zoals redox wijziging enfosforylering 7. GJS vergemakkelijken de gecoördineerde respons van de aangesloten cellen, waardoor die als een chemische en elektrische syncytium. Bijvoorbeeld, de verspreiding van cardiale actiepotentiaal in de atriale en ventriculaire myocyten wordt gemedieerd door Cx-based GJ kanalen 85. Cxs niet alleen een rol van gap junction kanalen, maar ook vormen ongepaarde hemichannels, daardoor functioneren als kanalen in membranen eveneens regelmatig ionenkanalen 8-10 (Figuur 1). Hemichannels deelnemen aan paracrienen tussen naburige cellen door het regelen van de uitwisseling van ionen en signaalmoleculen tussen de intra-en extracellulaire milieu.

In veel celtypen (zoals epitheelcellen, osteoblasten, astrocyten, endotheelcellen, enz.) en organen (zoals de hersenen, de lever, de retina, cochlea en het vaatstelsel), intercellulaire Ca2 +-golven zijn fundamenteel voor de coördinatie van meercellige reacties 11. Verhogingen van de intracellulaire Ca2 + niveaus in een bepaalde cel zijn niet beperkt tot deze cel, maar doorgeven aan de omringende naburige cellen is, zodat de intracellulaire Ca 2 +-wave 12,13. Deze intercellulaire Ca2 +-golven zijn belangrijk voor de normale fysiologische regulering cellagen als syncytia en de dysregulatie is geassocieerd met pathofysiologische processen 11. In de hoornvliesendotheel en epitheel, verschillende groepen 14-24, inclusief onze eigen 25-33, bestudeerde de mechanismen en de rol van intercellulaire communicatie. In niet-exciteerbare cellen, zoals corneale endotheelcellen, twee verschillende modi van intercellulaire communicatie plaatsvinden 28,29, namelijk spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie. Spleetovergangen intercellulaire communicatie impliceert een directe uitwisseling van signaalmoleculen via gap junctions 7. Gap juncnale intercellulaire communicatie is van cruciaal belang voor het behoud van weefsel homeostase, het regelen van celproliferatie, en de oprichting van een gesynchroniseerde reactie op extracellulaire spanning 10,34,35. In een aantal pathologieën, wordt gap junction koppeling verminderd als gevolg van gebrekkige Cxs, en hierbij van invloed spleetovergangen intercellulaire communicatie 36. Dit benadrukt het belang en de invloed van spleetovergangen intercellulaire communicatie in meercellige organismen. In tegenstelling tot spleetovergangen intercellulaire communicatie paracriene intercellulaire communicatie is niet afhankelijk van cel-cel bijstelling, omdat impliceert de diffundeerbare extracellulaire messengers (figuur 2). Verschillende soorten signaalmoleculen worden uitgebracht in de extracellulaire ruimte door signalering cellen. Het molecuul wordt dan naar de doelcel, waar het wordt gedetecteerd door een specifiek receptoreiwit. Vervolgens wordt het receptor-complex signaal induceert een cellulaire reactie diewordt beëindigd door verwijdering van het signaal, inactivering of desensibilisatie. Uitgebracht lipofiele extracellulaire signalen boodschappers penetreren het membraan en handelen op intracellulaire receptoren. Daarentegen hebben hydrofiele boodschappers niet over de plasmamembraan van de reagerende cel, maar fungeren als een ligand dat bindt aan het oppervlak tot expressie gebrachte receptor eiwitten, die doorzenden het signaal naar de intracellulaire omgeving. Drie belangrijke families van celoppervlak receptor-eiwitten aan dit proces: ionkanaal-gekoppelde, enzyme-linked, en G eiwit-gekoppelde. De vrijgegeven boodschappermolecule kan handelen receptoren van dezelfde cel (autocriene) op doelwitcellen in de nabijheid (paracriene) of op verre doelcellen die de bloedsomloop (endocriene) vereist.

In vele celtypen, waaronder corneale endotheel 28,29, ATP is een van de belangrijkste hydrofiele, paracriene factoren die de voortplanting van intracellulaire Ca2 +-golven 37-40 drijven. During mechanische vervorming, hypoxie, ontsteking of stimulatie door verschillende agenten, kan ATP uit gezonde cellen 41-44 worden uitgebracht in reactie op shear stress, rek, of osmotische zwelling 44,45. Verschillende ATP-afgifte mechanismen geopperd, zoals vesiculaire exocytose 44 en een veelheid van transportmechanismen, zoals ATP-bindende cassette (ABC) transporters, plasmalemmal spanningsafhankelijke anion kanalen 46, P2X7 receptor kanalen 47,48, alsmede connexin hemichannels 49-52 en pannexin hemikanalen 43,49,53. Extracellulair ATP kan snel gehydrolyseerd ADP, AMP en adenosine 54,55 door ectonucleotidases die in het extracellulaire milieu. Het extracellulair vrijgegeven ATP en zijn metaboliet ADP 56 zal verspreiden via diffusie. De daaropvolgende interactie van deze nucleotiden purinerge receptoren in de naburige cellen is betrokken bij de propagation van intercellulaire Ca2 +-golven 28,37,51. Twee verschillende klassen van purinerge receptoren aanwezig zijn: adenosine is de voornaamste natuurlijke ligand voor P1-purinoceptoren, terwijl zowel purine (ATP, ADP) en pyrimidine (UTP, UDP) nucleotiden handelen meeste P2-purinoreceptoren 57.

Intercellulaire communicatie kan worden onderzocht door verschillende methoden, zoals schrapen loading, kleurstofoverdracht, lokale uncaging van agonisten zoals IP3 en Ca 2 +, mechanische stimulatie enz.. Hier beschrijven we de studie van Ca 2 +-golven opgewekt door mechanische stimulatie van een enkele cel. Het voordeel van het bestuderen van Ca 2 +-golven door mechanische stimulatie is dat het een eenvoudig hulpmiddel om de verspreiding van de Ca 2 +-golf in de tijd te kwantificeren en geeft kwantitatief vergelijken van verschillende voorbehandelingen van de cellen. In het corneale endothelium, die intracellulaire Ca 2 +-golven kunnen een cogecoördineerd antwoord van de monolaag, wordt als een mogelijke afweermechanisme van de niet-regeneratieve corneale endotheel helpen het endotheel aan extracellulaire spanningen tijdens intraoculaire chirurgie weerstaan, of na blootstelling aan ontstekingsmediatoren bij afstoting of uveitis 58,59.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Isolatie van corneale endotheelcellen

Voordat u begint: Isoleer de cellen van de frisse ogen, verkregen uit een lokaal slachthuis, zo spoedig mogelijk na enucleating het oog. Zorg ervoor dat het oog werd enucleated uit een koe van maximaal 18 maanden oud zijn, vijf minuten post mortem en bewaard in Earle's Balanced Salt Solution - 1% jodium oplossing bij 4 ° C voor het transport naar het laboratorium.

  1. Neem het oog uit het Earle's Balanced Salt Solution - 1% jodium-oplossing en plaats deze in een petrischaal (100 x 20 mm).
  2. Steriliseer het oog met een oplossing die 70% ethanol en spoel met Earle's gebalanceerde zoutoplossing bevattende 1% jodium.
  3. Vanaf deze stap over, werken in een steriele kap. Ontleden voorzichtig het hoornvlies van het oog en plaats deze in een petrischaal (35 x 10 mm) met Earle's Balanced Salt Solution, de epitheliale cellaag naar boven. Verwijder zorgvuldig alle resterende irisweefsel still indien nodig aan de cornea.
  4. Breng de cornea andere Earle's Balanced Salt Solution bevattende petrischaal met de endotheliale cellaag omhoog en spoel tweemaal met Earle's Balanced Salt Solution.
  5. Breng het hoornvlies met de endotheellaag naar boven in een zandloper, een komvormig schotel, en bedekken met groeimedium. Het groeimedium bestaat uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium bevattende 25 mM glucose, 10% foetaal runderserum, 6,6% L-glutamine, 2,5 ug / ml amfotericine-B en 1% antibioticum-antimycoticum mengsel dat 10.000 eenheden / ml penicilline, 10.000 ug / ml streptomycine en 25 ug / ml amfotericine B.
  6. Verwijder het medium een ​​zuigkracht pipet.
  7. Breng 300 pi van een trypsine-oplossing (0,5 g / L) de endotheliale laag van het hoornvlies (alle stappen die trypsine bevatten worden door met dezelfde concentratie).
  8. Plaats de zandloper met het hoornvlies in een overdekte petrischaal en zet het in de incubator gedurende 30 min bij 37 ° C en 5% CO2.
  9. Voorzichtig schrapen de endotheelcellen uit de buurt van het hoornvlies met een brand-gepolijste haakvormige glas Pasteur pipet in een steriele kap.
  10. Zuigen uit de oplossing die de endotheelcellen toevoegen aan kolven (25 cm2) met 4 ml kweekmedium.
  11. Breng 300 pi groeimedium aan het hoornvlies en herhaal het schrapen en voeg de oplossing die de endotheelcellen aan de kweekkolf.
  12. Herhaal deze laatste stap (1.11) eens te meer.
  13. Plaats de cultuur kolven met de corneale endotheelcellen in het groeimedium in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  14. Na twee dagen, voeg 6 ml kweekmedium.
  15. Vernieuw het groeimedium elke tweede dag.

2. Celkweek

  1. Verwijder het kweekmedium en twee keer was de cellen met Earle's Balanced Salt Solution, wanneer confluentie bereikt is (binnen about 10 dagen na isolatie).
  2. Voeg 1,5 ml trypsine oplossing om de cellen om ze los door de kolf in de incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 3 tot 4 min.
  3. Voeg 12 ml groeimedium. Pipetteer de middellange drie keer in en uit om de cellen te verspreiden en tel de cellen.
  4. Zaad van de cellen met een variabele fractie afhankelijk van de celdichtheid en zet ze in de couveuse. Bereid twee goed-kamer slides (met een oppervlakte van 4,2 cm 2) met een celgetal van 165.000 cellen (celdichtheid 39.286 per cm 2). Bereid 80 cm2 cultuur flessen een nieuwe passage in een dichtheid van 6.250 per cm2, door vers kweekmedium tot een totaal volume van 25 ml.
  5. Vernieuw het medium om de twee dagen.
  6. Confluentie van de cellaag wordt bereikt na 3 tot 4 dagen. Gebruik cellen voor experimenten.
  7. Wanneer confluentie van de cellaag in de kolven wordt bereikt, herhaalt u de stappen 2,1-2,6. Celculturen tot passage 2 kan worden fof experimenten.

3. Mechanische stimulatie voor Inducerende Calcium Wave

  1. Plaats de cellen in de chambered dia met 10 pM Fluo-4:00 in met fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden.
  2. Verwijder de TL 4:00 oplossing was de cellen vijf keer met fosfaat-gebufferde zoutoplossing, incubeer de cellen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing en laat de cellen gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur vóór de meting.
  3. Excite bij 488 nm met Argon laser en gebruik beam splitter HFT 488, het verzamelen van de fluorescentie-emissie bij 530 nm met behulp van een longpass emissiefilter LP 505, stellen de pinhole op minimum. Gebruik een olie-immersie 40X objectief (Air, 1.2 NA). In experimenten met ARL-67156, gebruik dan een 10X objectief (Air, 0.3 NA).
  4. Zoeken naar een veld waarin de cellen confluent de confocale microscoop.
  5. Plaats de pipet zodat deze op 45 ° ten opzichte van de chambered glijbaan en aanraken van de celmembraan.Leiden tot een korte (≈ 1 sec) mechanische stimulatie van een enkele cel. De mechanische stimulatie bestaat uit een acuut en kortdurend vervorming van de cel door kort minder dan 1% van het celmembraan aanraken met een glazen micropipet (tip diameter <1 pm) gekoppeld met een piëzo-elektrisch kristal nanopositioner, bediend via een versterker die gemonteerd op een micro-manipulator. De glazen micropipetten zijn gemaakt met een micro-elektrode trekker. Zorg ervoor dat de nanopositioner wordt bediend door een spanning tussen 0,2 en 1,5 V tijdens de mechanische stimulatie. Een spanning lager dan 1,5 V kunnen tot celbeschadiging. Voor elk type cel en conditie, moet de optimale spanning voor mechanische stimulatie zonder beschadiging van cellen zorgvuldig worden bepaald door toepassing van een reeks spanningen vanaf laag (0,2 V) naar hoog (1,5 V) spanning. De spanning is een maat voor de kracht van de stimulatie aangezien deze spanning bepaalt de mechanische spanning en spanning die worden toegepast op de celmembraan. Dewerking van de mechanische stimulatie kan worden berekend door de mechanische spanning te vermenigvuldigen met het gebied. Aangezien zowel de omgeving (<3,14 um 2) en de spanning zeer laag, de kracht van de mechanische stimulatie laag. (Merk op dat wanneer een cel wordt beschadigd, de fluorescentie lekt uit de cel en de cel wordt donker.)
  6. Meet ruimtelijke veranderingen in [Ca 2 +] i na mechanische stimulatie met de confocale microscoop.
  7. Verzamelen en opslaan van afbeeldingen.
  8. Teken een veelhoekig gebied van belang de totale oppervlakte van reagerende cellen (actief gebied AA) met de software van de confocale microscoop definiëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties en het protocol wordt gedemonstreerd wordt uitgevoerd onder de leiding en goedkeuring van het dier zorg en gebruik commissie van de KU Leuven.

In runder corneale endotheelcellen (BCEC) worden functionele gap junctions expressie en beide spleetovergangen intercellulaire communicatie en paracriene intercellulaire communicatie aanzienlijk bijdragen aan intercellulaire ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige methode om intracellulaire Ca2 +-golven meten monolagen van primaire boviene corneale endotheelcellen door een lokale en gecontroleerde mechanische stimulatie met behulp van een micropipet. Mechanisch gestimuleerde cellen reageren met een lokale toename van intracellulaire IP3 en Ca2 +, die beide essentiële intracellulaire signalerende moleculen die rijden intracellulaire Ca 2 +-golven 11,67. IP3 wordt direct overgebra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Onderzoek uitgevoerd in het laboratorium werd ondersteund door subsidies van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO; subsidie ​​nummers G.0545.08 en G.0298.11), de Interuniversitaire attractiepolen Program (Federaal Wetenschapsbeleid; toekenningsnummer P6/28 en P7/13) en is ingebed in een FWO-ondersteund onderzoeksgemeenschap. CDH is een post-doctoraal onderzoeker van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen (FWO). De auteurs zijn erg dankbaar voor alle huidige en voormalige leden van het Laboratorium voor Moleculaire en Cellulaire Signalering (KU Leuven), dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometrie, USA), het laboratorium van Dr Leybaert (Universiteit Gent) en van Dr Vinken (VUB) die behulpzaam discussies verstrekt, geoptimaliseerde procedures of betrokken waren bij de ontwikkeling van instrumenten voor de studie van connexine hemikanalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)14155-048
IodineSigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)11960-044
L-glutamine (Glutamax)Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)35050-038
Amphotericin-BSigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)A2942
Antibiotic-antimycotic mixtureInvitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)15240-096
TrypsinInvitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)25300-054
Dulbecco's PBSInvitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)14190-091
Fluo-4 AMInvitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)A265
Apyrase VISigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)A6410
Apyrase VIISigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slidesLaboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)155380
Confocal microscope Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)LSM510
Piez–lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)PI Polytech (Karlsruhe, Germany)P-280
HVPZT-amplifierPI Polytech (Karlsruhe, Germany)E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA4878
Micr–lectrode puller Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)WZ DMZ-Universal Puller

Referenties

  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074(2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6(2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451(2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8(2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kanalen van gap junctionshemikanaalactiviteitconfocale microscopieFluo4 AM ladingmicromanipulatorstimulatieATP afgiftemetingconnexine isovormanalyse

Gerelateerde artikelen