Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

Summary

Lytische faag biosensoren en antilichaam kralen zijn in staat onderscheid te maken tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige stafylokok bacteriën. De fagen werden geïmmobiliseerd door een Langmuir-Blodgett methode op een oppervlak van een kwartskristal microbalans sensor en werkte als breed staphylococcus probes. Antilichaam kralen herkennen MRSA.

Abstract

Een structureel getransformeerd lytische bacteriofagen met een breed gastheerbereik van Staphylococcus aureus-stammen en een penicilline-bindende eiwitten (PBP 2a) antilichaam geconjugeerd latex kralen zijn gebruikt om een biosensor ontwikkeld voor discriminatie van methicilline resistente (MRSA) en gevoelige (MSSA) S creëren . aureus soorten ^1,2. De lytische fagen zijn omgebouwd tot faag spheroids door contact met water-chloroform-interface. Faag spheroïde monolagen werden op een biosensor oppervlak bewogen door Langmuir-Blodgett (LB) techniek ^3. De gecreëerde biosensoren werden onderzocht door een kwartskristalmicrobalans met dissipatie tracking (QCM-D) om bacteriën-faag interacties te evalueren. Bacterie-spheroïde interacties leidden tot lagere resonantiefrequentie en een stijging van de dissipatie energie voor zowel MRSA en MSSA-stammen. Nadat het bacteriële bleken deze sensoren verder blootgesteld aan de penicilline-bindende eiwit antilichaam latex bolletjes. Sensoren geanalyseerd met MRSA gereageerd 2a antilichaam kralen PBP; hoewel sensoren geïnspecteerd met MSSA gaf geen antwoord. Deze experimentele onderscheid bepaalt een ondubbelzinnig onderscheid tussen methicilline resistente en gevoelige S. aureus-stammen. Evenzeer gebonden en ongebonden bacteriofagen onderdrukken de groei van bacteriën op oppervlakken en in het water schorsingen. Zodra lytische fagen worden veranderd in bolletjes, ze behouden hun sterke lytische activiteit en vertonen een hoge bacteriële capture-mogelijkheid. De faag en faag sferoïden kunnen worden gebruikt voor het testen en sterilisatie van antibioticaresistente micro-organismen. Andere toepassingen kunnen het gebruik in bacteriofaagtherapie en antimicrobiële oppervlakken.

Introduction

Methicilline resistente stammen van Staphylococcus aureus zijn gesuggereerd als een factor in essentiële infecties en nosocomiale uitbraken ^4-8. Voorkomende manieren van de erkenning van methicilline resistentie, zoals de disk diffusie oxacillin agar screentest, of bouillon microverdunnings, vertrouwen op maat kweekomstandigheden om de uitdrukking van de weerstand te verbeteren. Veranderingen omvatten het gebruik van oxacilline, incubatie bij 30 of 35 ° C in plaats van 37 ° C, en de toevoeging van NaCl aan het groeimedium. Verder is het voor juiste detectie bij dit soort technieken, een lange incubatietijd van 24 uur in plaats van 16 tot 18 uur vereist. Snelle technieken met de juiste (> 96%) niveau van gevoeligheid voor de identificatie van meticillineresistentie omvatten geautomatiseerde microverdunningsplaten technieken zoals het Vitek GPS-SA-kaart, de Rapid ATB Staphylococcus-systeem, en de Rapid Microscan Panel systeem dat resultaten opleveren na 3-11 uur ^9-11. De Crystal MRSA ID systeem is een snelle methode, gebaseerd op de erkenning van de groei van S. aureus in aanwezigheid van 2% NaCl en 4 mg oxacilline per liter met een zuurstof-gevoelige fluorescentie sensor. Beweerde gevoeligheden variëren tussen 91 tot 100% na 4 uur incubatie ^12-14. Deze fenotypische methoden zijn beperkt in hun nauwkeurigheid door de impact van de heersende stammen die heterogene weerstand uiten. Daarom is de beste algemeen aanvaarde methoden voor de erkenning van methicilline resistentie is PCR of DNA hybridisatie van het mecA gen ^15. Deze techniek vereist echter gezuiverd DNA en is zeer gevoelig voor verschillende hulpstoffen (verontreinigingen) die celresten ¹⁶ omvatten.

Bovendien zijn deze technieken hebben een lange tijd uit te voeren. Strategieën voor de herkenning van het mecA genproduct eiwit PBP 2a, kunnen worden gebruikt om resistentie te bepalen en kan betrouwbaarder vergelijking met standaard testtechnieken ^17.

Het was eerder aangetoond dat bacteriofaag 12600 kan gebruikt worden als een erkenning probe voor Staphylococcus aureus stammen inbegrip van die met meticillineresistentie ^1,2,18. In dit werk een nieuwe techniek in de specifieke herkenning en detectie van MRSA, zoals de herkenning van bacteriën met conformatie van MRSA in real time wij voorgesteld. Daarvoor speciaal een S. aureus bacteriofaag met een breed spectrum van systemen (waaronder MRSA) in combinatie met monoklonale antilichamen tegen eiwit (PBP 2a) gebruikt. PBP 2a is een celwand-eiwit en is de oorzaak van antibiotische weerstand van MRSA. Echter PBP 2a antilichaam niet specifiek voor S. aureus omdat sommige andere bacteriën hebben antibiotische bindende eiwitten met sequentie-overeenkomst aan PBP 2a ^19,20. Dus ook in dit werk, S. aureus bacteriofagen en antilichamen tegen PBP 2a eiwit zijn gebruikt. Om een ​​biosensor ontwikkelen specificatisch detecteren en identificeren MRSA een apparaat met een twee stappen is gebruikt. De eerste stap die een S. aureus bacteriofaag monolaag als sensor probe, terwijl de tweede stap gebruikt PBP 2a specifieke antilichamen. Daarom is de eerste stap zal S. herkennen aureus bacteriën, zoals de andere zal gevoelig zijn voor het antibioticum-bindend eiwit. Bij ontvangst van twee stappen signalen positief, duidt de specifieke detectie van MRSA.

Protocol

1. Instellen van het podium

1. Verkrijgen type stam S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 en Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicilline-resistente stammen van S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; De lytische faag 12.600.
2. Verkrijgen PBP 2a antilichaam geconjugeerd latexparels.
3. Bereid NZY medium zoals beschreven ^21.
4. Verkrijgen fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
5. Bereid gedemineraliseerd water als subfase voor Langmuir-Blodgett (LB) monolaag depositie.

2. Bacteriofaag Voortplanting en titratie

1. Incubeer 5 ml overnacht cultuur van S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 ⁸ kolonievormende eenheden (CFU) / ml) met 500 ul van faag (3 x 10 ^{9 <}/ Sup> PFU / ml) in 500 ml NZY medium in 2 L Flack on shaker-incubator bij 37 ° C geïncubeerd.
2. Centrifugeer cultuur bij 4424 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
3. Re-gecentrifugeerde supernatant bij 11.325 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
4. Filter supernatant door een 0,22 urn Millipore filter.
5. Centrifugeer het filtraat bij 75.395 xg gedurende 1,5 uur.
6. Los pellet in 100 pl gedestilleerd water.
7. Bereid 10-voudige verdunningen van faagsuspensie in NZY medium.
8. Plaat 1 ml overnachting (ON) cultuur van S. aureus ATCC 12600 op elk van 2 platen met NZY agar om ervoor te zorgen dat alle oppervlak is bedekt. Verwijder de overmaat aan cultuur en laat het oppervlak drogen gedurende 30 minuten.
9. Spot een monster (10 ui) van faag passende verdunning op het oppervlak van de plaat en incubeer bij ³⁷ ° C gedurende 18-24 uur.
10. Onderzoekt de vorming van plaques en bereken de faag titer. Bacteriofaag titers (T) worden geschat op basis van het aantal pLaques (N) gevormd per 10 ul volume (v) van faagsuspensie en de verdunningsfactor (F). De titer werd berekend met de formule:. T = N / (VXF) Voor bijvoorbeeld het aantal plaques 75 bij een verdunning 10 ^-7 en volume 10 pi (10 x 10 ^-3 ml), de titer gelijk 75 / (10 x 10 ^-3 x 10 ^-7) = 7,5 x 10 ¹⁰ plaque vormende eenheden (PFU) per ml suspensie.

3. Goud-geïmmobiliseerde faag

1. Schoon goud gecoate kwarts stukken (60 mm ²⁾ van plasma-etsen in argon gedurende 10 min en vervolgens steriliseren gedurende 6 uur onder UV-licht in een steriele kast.
2. Voeg 50 microliter van 1 x 10 ⁹ PFU / ml faagsuspensie het goud oppervlak van elk stuk in een steriele petrischaal, en incubeer overnacht in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.
3. Verwijder titreren de resterende faagsuspensie.
4. Wassen stukken met gebonden faag 5 maal met PBS om ongebonden te verwijderenfaag.

4. Testen van geïmmobiliseerde faag infectiviteit op een droog oppervlak

1. Verspreid een O / N cultuur van S. Aureus ATCC 12600 op een NZY agar plaat en laat het drogen.
2. Plaats een goudstuk met geïmmobiliseerde faag op de plaat naar beneden.
3. Neem een ​​zone van lysis na 12 uur incubatie bij 37 ° C aangeeft dat infectiviteit.
4. Met goud bedekt stukken zonder faag in controle-experimenten.

5. Testen van lytische activiteit van vrije en gebonden faag in Liquid

1. Voeg een ON cultuur van S. aureus ATCC 12.600-10 ml NZY in elk van vier 300 ml kolven zijarm (6 x 10 ⁶ CFU / ml in elke kolf).
2. Voeg toe op twee kolven 2 x 10 ⁶ PFU / ml gratis faag.
3. Gebruik de beide andere kolven als controles.
4. Bewaak het tijdsverloop van S. aureus cellysis voor 570 min door optische dichtheid meting (OD ₆₀₀₎ op 30 min. intervallen voor alle kolven.
5. Neem een ​​laatste meting op 24 uur.
6. Herhaal de stappen 5,1-5,5, maar gebruik goudstukken met gebonden fagen in plaats van vrij fagen, en goudstukken zonder faag in control kolven.

6. Verlies van gebonden fagen Tijdens Incubation

1. Voeg 50 ul van 1 x 10 ⁹ PFU / ml faag aan het oppervlak van steriele goudstuk in een petrischaal die wordt geplaatst in een vochtige kamer gedurende de nacht bij kamertemperatuur.
2. Verwijder de ophanging met ongebonden faag uit de gouden oppervlak en titer.
3. Was de gouden stuk met gebonden faag 5 maal met PBS en in 1 ml NZY oplossing in 15 ml buis shaker-incubator bij 37 ° C gedurende 8 uur.
4. Bepaal de titer van de vrijstaande faag zoals beschreven in 2.

7. Faag Sferoïden Voorbereiding

1. Combineren 400 pl stock faag 12600 suspensie (10 ¹¹ PFU / ml) met een gelijk volume chloroform spectrofotometrische graad in 1 ml flaconbij kamertemperatuur.
2. Voorzichtig vortex de faag-chloroform ophanging 5-6 keer (5 sec interval) meer dan een minuut duren.
3. Mag de schorsing te stabiliseren gedurende 30 seconden en vervolgens pipet van de bovenste fase die spheroids afgepipetteerd voor monolaag voorbereiding.
4. Neem een ​​paar microliter van de sferoïden suspensie voor de transmissie en scanning elektronenmicroscopie.
5. Gebruik een resterende spheroïde suspensie voor biosensor productie.

8. Biosensor Voorbereiding

1. Clean QCM-D sensors plasma etsen in argon gedurende 10 min PDC-32G Harrick plasma cleaner.
2. Spoel de sensor met hexaan om eventuele organische verontreinigingen te verwijderen.
3. Bereiden en schoon een dieptepunt van de film evenwicht zoals beschreven in ^22.
4. Vul LB trog met een subfase oplossing en reinig deze met een trog barrière en stabiliseren de trog bij 20 ± 0,1 ° C
5. Verspreid 300 pi aliquot van faag 12.600 in waterige suspension (10 ¹¹ PFU / ml) op LB subfase.
6. Bereid faag monolaag op LB subfase oplossing doordat 300 pi aliquot van faag 12.600 waterige suspensie (10 ¹¹ PFU / ml) te lopen naar beneden een hellend bevochtigbaar glazen staaf die gedeeltelijk wordt ondergedompeld in de subfase ^22,23.
7. Stabiliseer de bereide monolaag gedurende 10 min, en vervolgens te comprimeren met een snelheid van 30 mm / min (45 cm ² / min), totdat een constante druk 19 N / m wordt bereikt.
8. Voer een verticale film depositie op loodrecht QCM-D sensor met een snelheid van 4,5 mm / min door achtereenvolgens dompelen sensor in en uit de monolaag zeven keer. Elektronenmicroscopie van neergeslagen faag monolagen vóór blootstelling aan bacteriële monsters bleek dat de lagen werden continu, homogeen en uniform (gegevens niet getoond).
9. Herhaal stappen 4,5-4,8 met een faag sferoïde suspensie die wordt bereid in 3.
10. Gebruik gefabriceerd faag biosensoren voor MRSA-detectie, elektronmicroscopie en ellipsometrie.

9. Biosensor testen, Discriminatie van Methicilline Resistente en gevoelige Staphylococcus Bacteriën

1. In dit protocol zijn biosensoren met ongemodificeerde en gemodificeerde faag en faag spheroids voorbereid. Een kwartskristalmicrobalans met vier sensor stromingskamers wordt gebruikt om toezicht te houden binding van bacteriën aan de fagen geïmmobiliseerd op QCM sensoroppervlak. PBP 2a geconjugeerd latex korrels worden gebruikt om tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige Staphylococcus bacteriën. Alle metingen worden uitgevoerd in de stroom-modus (50 ul / min) en 5 MHz.
2. Een basis lijn resonantiefrequentie van de QCM sensor in water (~ 30 min).
3. Teken een schorsing van levende methicilline gevoelige Staphylococcus bacteriële cellen in water (10 ⁹ CFU / ml) door de test cel.
4. Voortdurend veranderingen in de sensoren resonantiefrequentie en energie dissipatie monitor voor de eerste boventoon, USIng van de Q-Soft-software.
5. Als de veranderingen in de resonantiefrequentie sensoren en afbraak bereikt verzadigingsniveaus, voeg de suspensie van PBP geconjugeerd latex korrels (6,77 x10 ¹⁰ parels / ml) om de stroming tijdens de continue monitoring van de frequentie en dissipatie.
6. Herhaal de stappen 9,2-9,5 voor methicilline resistente staphylococcus bacteriële cellen (MRSA).
7. Definieer een frequentie verandering door de massale verandering als gevolg van bacteriën, door de Sauerbrey vergelijking ^24,25 = Af-Δm xn / C, waarbij C de massa gevoeligheid constante (C = 17,7 ng x cm ^-2 x Hz ^-1 bij 5 MHz ), m is massa en n het getal boventoon (n = 1).
8. Definieer een energie dissipatie verandering (Δ D) uit de opname van de exponentieel verval van de trilling (frequentie en amplitude demping, die kwantificering van de energie afgevoerd en opgeslagen gedurende een periode van trilling toegestaan,E _verdreven en E _opgeslagen, respectievelijk: Δ D = E _afgevoerd / 2 πE _opgeslagen. Δ D wordt gemeten in dissipatie eenheden (DU), een DU = 10 ^-6 relatieve eenheden).

Results

De faag gedemonstreerd lytische activiteit tegen alle geteste stammen van S. aureus, waaronder MRSA-stammen, zoals aangegeven door de faag spot test. Plaque groottes algemeen varieerden van 5 tot 15 mm. Geen activiteit werd gevonden tegen andere test kweken (tabel 1).

Een normale groei van S. aureus ATCC 12600 in NZY middelgrote on shaker-incubator bij 37 ° C is weergegeven in figuur 1A (een curve gemerkt met lege cirkels). Het aantal bacte...

Discussion

Het is bekend dat fagen kunnen worden gebruikt als biosensor probes voor bacteriële pathogenen ^28. Het is aangetoond dat dit werk faag met PBP 2a antilichamen kunnen worden gebruikt om het oude probleem: snelle discriminatie antibiotica resistente en gevoelige stammen.

Het bleek echter deze normale ongewijzigde Staphylococcus fagen zijn niet geschikt voor detectie met bacteriën QCM apparaten, hoewel ze bacteriën binden. De faag staart is zo lang dat akoestische golven niet kunnen ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 en Bacillus subtilis ATCC 6051 van	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, voorgesteriliseerde	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 µm, GP Express PLUS membraan
Bio-Assay schaal	NUNC A/S, Denmark	240835	Afmetingen(mm), 245 x 245 x 25
Pipetten	Gilson, Pipetman, Frankrijk	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gouden gecoate kwarts stukken	Auburn University, AL		Zelfgemaakt
Petrischalen	Fisher Brand, VS	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Cultuur groeikolven	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer kolven
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, VS.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, VS	PDC-32G
Millipore waterzuiveringssysteem	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, VS	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools