Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Samenvatting

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Samenvatting

Mechanische eigenschappen van cellen en extracellulaire matrix (ECM) spelen een belangrijke rol in vele biologische processen waaronder stamcel differentiatie, tumorvorming en wondgenezing. Veranderingen in stijfheid van cellen en ECM vaak tekenen van veranderingen in celfysiologie of ziektes in weefsels. Daarom cel stijfheid is een index om de status van celkweken evalueren. Onder de vele methoden die aan de stijfheid van cellen en weefsels te meten, micro-inkeping met een Atomic Force Microscope (AFM) biedt een manier om betrouwbare wijze de stijfheid van levende cellen. Deze methode is op grote schaal toegepast op de micro-schaal stijfheid karakterisering van verschillende materialen, variërend van metalen oppervlakken zachte biologische weefsels en cellen. Het basisprincipe van deze werkwijze is om een ​​cel inspringen met een AFM tip van geselecteerde geometrie en meet de uitgeoefende kracht de buiging van de AFM cantilever. Montage van de kracht-inkeping bocht naar de Hertz-modusl voor de bijbehorende tip geometrie kunnen kwantitatieve metingen van het materiaal stijfheid te geven. Deze paper toont de procedure om de stijfheid van levende cellen met behulp van AFM karakteriseren. Belangrijkste stappen waaronder het proces van de AFM kalibratie, kracht-curve acquisitie en data-analyse met behulp van een MATLAB routine worden gedemonstreerd. Beperkingen van deze methode worden ook besproken.

Inleiding

Mechanische eigenschappen, met name stijfheid van afzonderlijke cellen en de omliggende extracellulaire matrix (ECM) zijn essentieel voor vele biologische processen zoals celgroei, motiliteit, celdeling, differentiatie en weefsel homeostase. ¹ Het is aangetoond dat cellen mechanische stijfheid mate wordt bepaald door het cytoskelet, vooral de netwerken van actine en intermediaire filamenten en andere eiwitten gekoppeld. ² Resultaten van de mechanische testen van de in vitro netwerken van actine en intermediaire filamenten suggereren dat de cel mechanica is grotendeels afhankelijk van de cytoskelet structuur en de voorspanning in het cytoskelet. ^3-5 Stijfheid van levende cellen wordt vervolgens beschouwd als een index om de cytoskelet structuur ^6, myosine activiteit ⁷ en vele andere cellulaire processen te evalueren. Belangrijker, veranderingen in cel mechanische eigenschappen vaak blijkt nauw associated met diverse aandoeningen zoals tumorvorming en metastase ^8-10 Monitoring de mechanische stijfheid van levende cellen kan derhalve een nieuwe manier om celfysiologie volgen;. te detecteren en diagnosticeren ziekten ^8;. en de doeltreffendheid van geneesmiddelen behandelingen evalueren ^{11 , 12}

Meerdere werkwijzen waaronder deeltjes volgen microrheology, ^13-16 magnetische verdraaien cytometry, ¹⁷ micropipet aspiratie ^18,19 en microindentation ^20-22 zijn ontwikkeld om de elasticiteit van de cellen te meten. Deeltje volgen microrheology traceert de thermische trillingen van beide submicrondeeltjes fluorescerende deeltjes geïnjecteerd in cellen of ijkmarkeringen in de cel cytoskelet. ²³ Elastisch en visceuze eigenschappen van cellen worden berekend op basis van de gemeten deeltjes verplaatsingen met de fluctuatie-dissipatie theorema. ^14,23 Deze methode maakt gelijktijdige metingen van lokalemechanische eigenschappen met een hoge ruimtelijke resolutie op verschillende plaatsen in een cel. Echter, injecteren fluorescerende deeltjes in cellen kan leiden tot veranderingen in cellulaire functie, cytoskelet structuur en dus de cel mechanics. De micropipet aspiratie methode is onderdruk in een micropipet met een diameter van 1 tot 5 urn op een klein stukje celmembraan zuigen in de pipet. Cell stijfheid wordt berekend uit de toegepaste onderdruk en celmembraan vervorming. ¹⁸ Deze werkwijze kan echter niet de ongelijkmatige verdeling van de stijfheid over de cel te detecteren. Magnetische twisting cytometrie (MTC) van toepassing magnetisch veld koppel aan super paramagnetische beads bevestigd aan het celmembraan genereren. Cell ¹⁷ stijfheid wordt verkregen in deze werkwijze van de relatie tussen de toegepaste torsie en de kronkelende vervorming van de celmembraan. Het is moeilijk om de locatie van de magnetische korrels in de werkwijze MTC controleren, en het is ook challenging tot de kronkelende vervorming met een hoge resolutie te karakteriseren. Microindentation geldt een indenter met goed gedefinieerde geometrie om punch in de cel. Het inspringen kracht en de resulterende inspringen in cellen volgen vaak de voorspelling van de Hertz-model. Young's moduli van de cellen kan worden berekend uit de kracht-indrukking curven aanpassen ervan aan de Hertz model. Deze methode is op grote schaal toegepast op de mechanische eigenschappen van de weefsels en cellen te testen, ondanks zijn beperkingen, zoals onzekerheid in contactpunt vastberadenheid, toepasbaarheid van de Hertz-model, en het potentieel om fysiek te beschadigen de cellen. Onder de vele apparaten voor microindentaion ^20, de Atomic Force Microscope (AFM) is in de handel verkrijgbaar en is op grote schaal toegepast op de mechanische eigenschappen van levende cellen en weefsels ^21,24-27 karakteriseren.

Deze paper toont de procedure van het gebruik van een asiel MFP3D-Bio AFM naar cel mechanica karakteriseren. AFM niet oply levert hoge-resolutie topografie van cellen, maar ook op grote schaal toegepast om de mechanische eigenschappen van weefselcellen karakteriseren. Het principe van AFM indrukking wordt geïllustreerd in figuur 1. De AFM cantilever nadert de cel van enkele micrometers hierboven, maakt contact met de cel streepjes de cel zodat de cantilever doorbuiging een voorgeselecteerd setpunt bereikt, en trekt vanaf de cel. Tijdens dit proces wordt de cantilever doorbuiging wordt geregistreerd als een functie van de locatie zoals weergegeven in figuur 1. Alvorens contact met de cel, de cantilever beweegt het medium zonder enige duidelijke afwijking. Wanneer inspringen op de cel, de cantilever bochten en de afbuigsignaal toeneemt. De cantilevers worden gemodelleerd als elastische balken zodat hun afbuiging evenredig is met de op het cel kracht. Door het instellen van de maximale cantilever doorbuiging, is de maximale grootte van de kracht toegepast op de steekproef beperkt tot d voorkomenAmage aan cellen. Het gedeelte van de kracht curve van punt b in figuur 1, waarbij de punt streepjes in de cel, is bekwaam tot het hertz model om de cel stijfheid extraheren naar punt c.

Figuur 1. Illustratie van de AFM microindentation en interpretatie van de geldende curve. Het bovenste paneel toont de beweging van AFM cantilever gedreven door de piëzo-scanner. De verticale locatie van cantilever z en cantilever uitwijkingssignaal d wordt geregistreerd gedurende het proces. De cantilever begint vanaf punt een, enkele micrometers boven de cel. Bij het naderen van de cel, het monster inkeping δ blijft nul tot het punt b, wanneer de punt in contact komt met de cel bereikt. De coördinaten van punt b in de plot zijn kritieke waardenvoor gegevensanalyse, aangeduid met (z _0, d _0>). Van b naar c, de cantilever streepjes in de cel totdat de cantilever doorbuiging bereikt een instelling, die is ingesteld op de verhouding tussen de beoogde maximum inspringen kracht en de cantilever veerconstante zijn. Zodra de afbuigsignaal de ingestelde maximale waarde heeft bereikt, wordt de cantilever vervolgens teruggetrokken uit de cel naar punt d, waar het vaak naar beneden worden getrokken als gevolg van tip-sample adhesie, los van de cel en keert terug naar zijn oorspronkelijke locatie bij e. Het rechter paneel toont de relatie tussen de inkeping en de opgenomen z en d signaal. In op de lagere linker paneel is een plot van een representatieve kracht curve, de maximale inspringen van een cantilever, waarvan de veerconstante wordt gemeten om te 0.07N / m, is ingesteld om 17 nm, zodat de maximale inspringen kracht toegepast op steekproef is 1.2 nN. De belangrijkste locaties tijdens de insprong zijn gemarkeerd.

Protocol

1. Kalibreer het voorjaar Constant van Cantilever

1. Laad de cantilever in de AFM volgens de instructies van de fabrikant. Het is noodzakelijk om de cantilever houder schoon met ethanol voordat experimenten. Dit zal helpen bacteriële besmetting tijdens de AFM metingen te beperken tot cultuur.
2. Kalibreren InvOLS (Inverse Optical Lever Gevoeligheid). Deze parameter beschrijft de hoeveelheid fotodiode response (Volt) per nanometer cantilever doorbuiging.
3. Laad een schoon glasplaatje op het monster podium, installeer dan de AFM hoofd en pas de laserstraal en uitlijning volgens de instructies van de fabrikant. Betrek de AFM tip over het glasplaatje.
4. Met de piëzo ingetrokken, opnieuw uitlijnen de spiegel om een ​​fotodiode lezen van -2 V. Voer een kracht spectroscopie meting met een triggerpoint (maximaal fotodiode response) van 2 V.
5. Met de piëzo ingetrokken, opnieuw uitlijnen de spiegel om een ​​fotodiode lezen van -2 V. Voer een foRCE spectroscopie meting met een triggerpoint (maximaal fotodiode response) van 2 V. Opmerking: De spanning waarden hier zijn specifiek voor het asiel AFM. Deze waarde moet worden ingesteld volgens de specificaties die door de fabrikant.
   Na data-acquisitie is voltooid, in te zoomen op de firma-contactgebied van de kracht curve. Voer een lineaire fit aan deze regio aan de helling, die zal worden in V / nm vinden. Het omgekeerde van deze waarde wordt de optische gevoeligheid van de cantilever-fotodiode ensemble.
6. Reset de spiegel aanpassing aan een vrije doorbuiging van 0 V.
7. Kalibreren van de cantilever veerconstante. Een thermische-tune methode wordt gebruikt om de veerconstante van de cantilever ²⁸ bepalen.
8. Na het kalibreren van de InvOLS, verhogen de scanner uit het monster stadium zodanig dat er geen interacties tussen de tip en sample.
9. Beginnen met het vastleggen thermische data. Tijdens dit proces, de thermische trilling van de vrijdragende ligger is Recorded. De AFM software analyseert een vermogensspectrum van een dergelijke thermische trillingen en plots in een venster data.
10. Na een paar seconden van data-acquisitie, het uitvoeren van een fit aan het segment data gecentreerd op de laagste frequentie (fundamentele resonantie) piek aan de veerconstante te bepalen.

2. Het laden van de Steekproef

1. Plaats de schotel Heater accessoire op de AFM podium, zo niet al voorzien.
2. Stel de temperatuur tot 37 ° C, en wacht 20 minuten voor het systeem om een ​​stabiele thermisch evenwicht bereiken.
3. Plaats de cultuur schotel op de AFM podium en zet deze vast met behulp van de klem voorzien van de schotel verwarmer. Het is belangrijk om de tijd tussen verwijdering van de schaal uit de incubator en het op het podium, om trauma te vermijden om de cellen te minimaliseren. Voor metingen langer dan 30 min, dient CO ₂ onafhankelijke drager worden gebruikt om de normale kweekmedium vervangen.
4. Breng een kleine daling van 37 ° C kweekmedium aan het uiteinde van de tHij AFM cantilever, en laat de AFM hoofd totdat de punt net is ondergedompeld in een vloeistof.
5. Met de top-view CCD camera, lijnt de laserstraal op de cantilever (de uitlijning in vloeistof anders dan in lucht, omdat de verandering in brekingsindex van het medium).
6. Betrek de AFM tip over een schone ruimte van de cultuur schotel.
7. Voer kalibratie van de InvOLS zoals hierboven beschreven, de cantilever gevoeligheid in de vloeibare omgeving.

Opmerking: a) Indien cellen worden gekweekt op hydrogels, de kalibratie van InvOLS worden vooraf uitgevoerd tegen het bodemoppervlak van een kweekschaal gevuld met celkweekmedium. Bij het overschakelen naar cel monsters, speciale aandacht worden besteed aan de laserstraal uitlijning niet veranderen met de cantilever. b) InvOLS moet worden gekalibreerd wanneer er een verandering in de laser uitlijning. c) Het wordt ook aanbevolen om InvOLS nemen als het gemiddelde van de waarde van verscheidene ijkcurves, sinds elke kalibratie genereert een andere InvOLS. De variatie in InvOLS is evenwel klein vergeleken met de gemiddelde waarde. Bijvoorbeeld, het kalibreren van een Bruker DNP-10 cantilever met veerconstante 0,06 N / m in vloeistof door 100 maal produceren een gemiddelde InvOLS waarde van 66,3 nm / V, met een standaarddeviatie van slechts 0,5 nm / V.

3. Verzamelen Force Curves van Cell Inspringen

1. Selecteer een cel voor inspringen. Met behulp van de optische microscoop, verplaatst u de etappe naar de cantilever boven de cel te plaatsen, zodat de punt bevindt zich in de peri-kernen regio. Nauwkeurige aanpassing van de cantilever positie kan worden door toepassing van offsets voor de X-en Y scanners.
   Opmerking: De AFM cantilever heeft van het monster oppervlak te worden ingetrokken tijdens het verplaatsen van het monster podium om een doelcel te selecteren. Dit beschermt de cantilever van kloppen in de steekproef, omdat het monster oppervlak mag niet plat.
2. Schakel over naar de modus Spectroscopie Force. Stel de Inspringenpercentage binnen het bereik van 1-10 um / sec, laag genoeg om hydrodynamische effecten te vermijden.
3. Stel de doorbuiging triggerpoint, waarvan de maximale inspringen kracht beperkt tot schade aan cellen voorkomen. Selecteer de Relative triggering optie, die zal corrigeren voor een eventuele verschuiving in de afbuigsignaal. Een maximale kracht van 2 nN is een goed uitgangspunt voor de meeste monsters. Deze waarde moet echter worden aangepast aan de stijfheid monster. Voor zachte monsters een lagere waarde moet worden gebruikt om overmatige indrukking aan het monster te voorkomen. Voor stijve monsters een hoge waarde moet worden gebruikt meetbare inkeping genereren.
4. Stel de kracht afstand groot genoeg om te waarborgen dat de punt volledig wordt losgemaakt van de cel tussen krachtmetingen. Meestal wordt de kracht afstand vastgesteld op 5 micrometer.
5. Bevel van de AFM om een ​​enkele kracht bocht te nemen.
6. Vang minimaal drie krachtcurven op verschillende locaties in de peri-kernen gebied van elke cel. Hoewel het voordelig om meerdere nemenbochten op elke cel voor betrouwbare statistische gegevens, het innemen van te veel kracht bochten kan leiden tot veranderingen in cel stijfheid als gevolg van stress van de AFM sonde.
7. Bij het verzamelen van gegevens is voltooid, en trek de tip, en herhaalt u de stappen 3,1-3,6 voor zoveel cellen als nodig is voor een goede statistische gegevens op mobiele stijfheid onder een bepaalde sample aandoening. Meestal worden 30 cellen gemeten voor elke aandoening.

Om de verdeling van de stijfheid binnen een enkele cel karakteriseren, wordt kracht-kaart-modus toegepast. In de Force-kaart-modus, stelt u een scanformaat tot de regio van belang zijn; stellen een passende oplossing; stel de insprong parameters als die welke zijn gekozen voor enkele kracht bochten; de AFM zal vervolgens raster over de gedefinieerde monster gebied en neem enkele kracht curves bij elke pixel in het monster regio.

4. Data Analysis

De opgenomen kracht curven worden geanalyseerd met behulp van een aangepaste MATLAB procedure om de cel stijfheid te berekenen. Het volgende is een korte beschrijving van MATLAB procedure:

1. De MATLAB-programma identificeert het aanspreekpunt coördineert z0 en d0 (zie figuur 1) met behulp van een algoritme door Lin et al geadopteerd uit een gepubliceerde methode ^29.:
2. Voor elk gegevenspunt in de krachtcurve, voert een lineaire aanpassing van de gegevens aan de linkerzijde van de bijzondere plaats en een Hertz model passen naar rechts (de geselecteerde punt als eerste contactpunt) tot de ingestelde maximale inspringen (200-300 nm aanbevolen).
3. Voor elk punt, berekent de relatieve RMS fout van zowel horten en vatten deze waarden.
4. Het punt waarop de minimale totale pasfout bereikt is geselecteerd als de eerste contactpunt.
   Opmerking: Computation tijd kan worden verminderd door het implementeren van een gouden-gedeelte zoeken in plaats van lineair scannen van de volledige kracht curve.
5. Monster vervorming δ en inspringen kracht F wordt als volgt berekend:
   
6. Een kleinste kwadraten aanpassing wordt toegepast op de F vs passen δ gegevens in de post-contactgebied, z z ≥ _0, de Hertz model om de Young's modulus E van het cel extract:
   
   , Waarin v verhouding van de Poisson.
   Opmerking: Als δ meer dan 10% van de monsterdikte (celhoogte), wordt de gemeten stijfheid cel die door het substraat stijfheid. De dikte van peri-kernregio gewoonlijk in de orde van enkele micrometers. Daarom is alleen de eerste 200-300 nm van F-δ curve is geschikt om de Hertz model.

Resultaten

Figuur 2a toont drie representatieve krachtcurven uit 3T3 fibroblasten gekweekt op plastic oppervlak, polyacrylamide gel elasticiteitsmoduli 3000 Pa en 17.000 Pa, respectievelijk. Na zorgvuldig identificeren van de contactpunten in de bochten, wordt het inspringen kracht als functie van de cel vervorming uitgezet in Figuur 2b. Onder een kracht van grootte kleiner dan 0,3 nN, een piramidevorm tip streepjes 3 micrometer in een cel gekweekt op een 3 kPa polyacrylamidegel. In tegenstelling,...

Discussie

De AFM inspringen methode heeft voordelen om mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren. Zij het ​​minder gevoelig is dan de magnetische draaiende cytometrie en optische pincetten, welke krachten kunnen meten op het piconewton level ^32, kan de AFM weerstandskracht detecteren van monsters, variërend van enkele tientallen pico-Newton tot honderden nano-Newton, vergelijkbaar met variëren van kracht die kunnen worden toegepast op cellen met behulp van een micropipet ^19. Deze reeks v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Atomaire Krachtmicroscoop	Asylum Research	MFP3D-BIO