Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents

Samenvatting

We ontwikkelden een kwantitatieve DNA-bindende ELISA gebaseerde bepaling om transcriptiefactor interactie met DNA te meten. Hoge specificiteit voor de RUNX2 eiwit werd bereikt met een consensus DNA-herkenning oligonucleotide en specifieke monoklonale antilichaam. Colorimetrische detectie met een enzym-gekoppelde antilichaam substraat reactie werd gevolgd in real time.

Samenvatting

Vele DNA-bindende assays zoals elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA), chemiluminescente assays, chromatine immunoprecipitatie (ChIP)-gebaseerde testen en multiwell-gebaseerde bepalingen worden gebruikt om transcriptie factor activiteit te meten. Echter, deze tests zijn nonquantitative ontberen specificiteit, kan het gebruik van radioactief gemerkte oligonucleotiden omvatten, en kunnen niet aangepast voor het screenen van remmers van DNA-binding zijn. Anderzijds, toepassing van een kwantitatieve DNA-bindings-enzyme linked immunosorbent assay (D-ELISA) test tonen we eiwitinteracties kern met DNA met de RUNX2 transcriptiefactor die afhankelijk specifieke associatie met consensus-DNA-bindende sequenties aanwezig biotine- gelabelde oligonucleotiden. Voorbereiding van de cellen, de winning van nucleair eiwit, en het ontwerp van dubbelstrengs oligonucleotiden worden beschreven. Avidine gecoate 96-well platen zijn bevestigd met alkalische buffer en geïncubeerd met nucleaire eiwitten nucleotide blokkeerbuffer. Follwegens uitvoerig wassen van de platen, specifieke primair antilichaam en secundair antilichaam incubaties worden gevolgd door de toevoeging van mierikswortel peroxidase substraat en ontwikkeling van de colorimetrische reactie. Stop reactiewijze of continue kinetische controle werden gebruikt om kwantitatief te meten eiwit interactie met DNA. We bespreken geschikte specificiteit controles, waaronder behandeling met niet-specifiek IgG of eiwit of primaire antilichaam. Toepassingen van de test beschreven onder zijn nut in drug screening en representatieve positieve en negatieve resultaten worden besproken.

Inleiding

DNA-bindende assays zijn nuttig bij het meten van het vermogen van transcriptiefactoren te interageren met DNA. Assays voor DNA-binding omvatten elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA) die afhankelijk zijn van radioactief gemerkte oligonucleotiden ¹ of chemiluminescentie assays ^2. Chromatine immuneprecipitation (ChIP) gebaseerde testen ³ en bepalingen waarbij 96-well formaat ⁴ zijn ook beschreven. De EMSA een niet-kwantitatieve test die het gebruik van radioactief gemerkte oligonucleotiden vereist. Wanneer nucleaire eiwitten associëren met de specifieke nucleotide promoter sequenties, bindende complexen zijn vertraagd op polyacrylamidegelen en de specifieke transcriptiefactor kunnen worden gevalideerd met een antilichaam "supershift". We hebben een kwantitatieve DNA bindingstest met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbent formaat (D-ELISA), die in staat is de interactie van RUNX2 meten DNA-bindende sequenties die overeenkomen met bepaalde promoter elementen ontwikkeld in RUNX2 doelwit genen. Gebruik van een anti-RUNX2 antilichaam verschaft specificiteit voor de bepaling en het ontbreken van radiolabel onderscheiden deze assay uit de traditionele gel shift assay ^5. Detectie van binding complexen is mogelijk met het gebruik van een secundair antilichaam gekoppeld aan mierikswortel peroxidase (HRP), die een HRP substraat tetramethylbenzidine (TMB) wordt omgezet in een gekleurd product voor spectrofotometrische analyse. De test hier vermeld kan het gebruik van gemuteerde DNA-oligonucleotiden als controles opgenomen en kan worden gebruikt voor de detectie van competitieve of niet-competitieve remmers van DNA-binding. Het screenen van nieuwe anti-tumor verbindingen is ook mogelijk met deze assay.

Protocol

Verschillende stappen vooruit zijn uitgevoerd tijd en verschillende reagentia bereid en opgeslagen om de procedure: (1) celkweek en eiwitisolatie, (2) bereiden van oligonucleotide (3) bereiding van 96-well platen (4) kernextract incubatie overnacht. Procedure vereist 2 dagen vanwege de overnacht incubatie van nucleair eiwit met DNA-oligonucleotiden.

1. Bereiding van Buffers

1.1 Kern eiwitisolatie

1. Hypotonische buffer: Aan 100 ml hypotone buffer bereiden 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 gl (1 M _MgCl2), 333 gl (3 M KCl) 98,3 ml _H2O Eindconcentratie: 10 mM HEPES, 1,5 mM _MgCl2, 10 mM KCl. Voor hypotonische buffer + NP40 (voor gebruik in stap 2.11) Voeg 0,5 ml (10% NP40) 9,5 ml hypotone buffer definitieve 0,5% NP40.
2. Low Salt Buffer: Aan 100 ml buffer met laag zoutgehalte (voor gebruik in stap 2.15) te bereiden 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycerol, 150 gl (1 M _MgCl2), 666 gl (3 M KCl), 40 gl (0,5 M EDTA) aan 73 ml _H2O Eindconcentratie: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM _MgCl2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
3. High Salt Buffer: Aan 100 ml buffer met hoog zoutgehalte (voor gebruik in stap 2.15) te bereiden 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycerol, 150 ul (1 M _MgCl2), 26.7 ml (3 M KCl), 40 pl (0,5 M EDTA) aan 47 ml _H2O Eindconcentratie: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM _MgCl2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
4. 10% NP40 Wasmiddel: 10 ml NP40 90 ml _H2O
5. Protease en fosfatase remmers [toegevoegd hypotone buffer + NP40 (stap 2.11), lage zout buffer (stap 2.15), en hoge zout buffer (stap 2.15) juist voor gebruik] Voeg 2,5 gl (1M DTT) en 50 ui proteaseremmers (100x) tot 5 ml van elke buffer voor uiteindelijke concentratie van 0,5 mM DTT en 1 x proteaseremmers. De proteaseremmer 100x voorraad mengsel bestaat uit:natriumfluoride (Ser / Thr, zure fosfatasen), natriumorthovanadaat (Tyr, alkalische fosfatasen), β-glycerofosfaat (Ser / Thr fosfatasen), natriumpyrofosfaat (Ser / Thr fosfatasen), aprotinine (Ser proteasen), Bestatin (amino-peptidasen ), E64 (cysteïne proteasen), leupeptine (Ser / Cys proteasen), EDTA (metalloproteasen).

1.2 Bereiding van assayplaten

1. Plaat fixeeroplossing: Ter voorbereiding 500 ml oplossing, voeg 5,25 g natriumcarbonaat 500 ml _H2O, meng en pH 9,7 voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 M natriumcarbonaat.
2. Plaat blokkerende oplossing: Om de balans op poly bereiden dI / DC oligonucleotide, resuspendeer 1 Unit (~ 50 mg) van poly dI / DC in 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9 met 1 mM EDTA voor een voorraad concentratie van 50 ug / pl. Stock is verdund tot 1 ug / ul voor gebruik.

1.3 wasbuffers en antilichaam verdunningen

OPMERKING: Streptavidin wash buffer gebruikt om borden te wassen in tussen de toevoegingen en de primaire en secundaire antilichamen verdunnen.

1. Om 1 liter Streptavidin wasbuffer bereiden, voeg 2,4 g Tris / HCI, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), tot 1 L Millipore-steriel gefiltreerd water , pH 7.18. Bewaren bij 4 ° C. Eindconcentratie: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 DNA bindingsbuffer

Opmerking: Deze buffer wordt bewaard bij -20 ° C.

1. Ter voorbereiding 15 ml DNA bindingsbuffer, voeg 180 ul (1 M HEPES, pH 7,9), 300 gl (3 M KCl), 12 gl (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 gl (1M DTT), 3,0 ml (60% glycerol), 300 pi (50 pg / ul poly dI / dC) verdund met gedeïoniseerd / gedestilleerd _H2O (12 ml). Eindconcentratie: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% glycerol, 1 ug / ul poly dI / dC.

2. Cel Cultuur en Nucleaire eiwitisolatie

t "> NB: De bereiding vereist ongeveer 3 uur Stimulatie van cellen zal afhangen experiment Het aantal cellen voor elk experiment zal variëren en alle volumes weerspiegelen een typisch experiment met 3 x 10 ⁷ cellen / bijzondere volumes aanpassen om tegemoet... het aantal cellen daadwerkelijk bij de proef ^6.

1. Nucleaire eiwit te bereiden voor DNA-binding assays, cultuur menselijke cellen dat RUNX2 (endotheel, osteosarcoom, borstkankercellen) uitdrukken in passende media ^6.
2. Behandel subconfluente cellen met nocodazol (0,2 ug / ml gedurende 16 uur) cellen arresteren de G2 / M celcyclus grens ^6. Onder deze omstandigheden wordt de RUNX2 eiwit gestabiliseerd en maximaal DNA binding wordt bereikt. Zo hebben kerneiwit beschikbaar voor meerdere assays en remmers worden vergeleken van dezelfde bereiding.
3. Bij elke stap vooraf koelen centrifuge tot 4 ° C en buffers bereiden en koelen 20 min bij 4 ° C vóór celoogst.
4. Chill-cellen (4 ° C) en gedrag procedures op ijs.
5. Centrifugeer cellen bij 1000 rpm gedurende 5 min in een 15 ml polypropyleen buis met ronde bodem.
6. Wassen 1x met ijskoude PBS (Ca ^{2 +} en Mg ^{2 +} gratis).
7. Centrifuge opnieuw en PBS bovenstaande vloeistof.
8. Voeg 500 ul van hypotone buffer zonder proteaseremmers, let daarbij goed op een volledige resuspensie van de cel pellet.
9. Transfer inhoud naar een 1,5 ml Eppendorf buis.
10. Onmiddellijk centrifuge bij 5.500 rpm voor 5,5 min; Verwijder de bovenstaande vloeistof en de cel pellet HOUDEN.
11. Resuspendeer de celpellet in 500 ui hypotonische buffer die 0,5% NP40. Voeg protease en fosfatase remmers en 0,5 mM DTT (zoals beschreven in stap 1.1.5).
12. Laat het monster rusten op ijs gedurende 30 minuten.
13. Centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 10 minuten.
14. Verwijder het supernatant (bevat de cytosolische eiwitten).
15. Resuspendeer de nucleaire pellet in 60 ul elk van laag salt buffer (waaraan proteaseremmers en 0,5 mM DTT toegevoegd uit stap 1.1.5) en hoge zout buffer (waaraan proteaseremmers en 0,5 mM DTT toegevoegd uit stap 1.1.5) voor een totaal van 120 pi. Voeg 60 ul buffer met laag zoutgehalte aan de eerste en resuspendeer pellet, voeg 60 pl buffer met hoog zoutgehalte. Vortex de pellet om te helpen bij resuspensie.

OPMERKING: Deze stap helpt zich te ontdoen van een aantal van de membraaneiwitten nucleaire en is opgericht voor de lysisstap: zoutarm eerste (resuspendeer pellet, vortex), dan is een hoog zoutgehalte (vortex) optimaliseert deze stap. Houd extract op ijs gedurende 30 minuten, met vortexen na de eerste 10 minuten.

16. Centrifugeer bij 12.000 rpm gedurende 15 min., houden de supernatant dat het kerneiwit.
17. Meet eiwitconcentratie (proberen monsters 2-5 mg / ml te houden), aliquot in geschikte hoeveelheden (10 pl / buis) en bewaar bij -80 ° C.

OPMERKING: Geschatte opbrengst: 30 x 10 ⁶ cells wordt 5 ug / ul eiwit op in 120 pl. 5 x 10 ⁶ cellen 2,2 ug / ul eiwit op in 40 pl.

3. Voorbereiding van Double oligonucleotide

1. Ontwerp van complementaire oligonucleotiden met compatibele halve plaatsen aan de uiteinden. Voor RUNX2 deze zijn: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotine (sense) en 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotine (antisense).

OPMERKING: Pilot experimenten vastgesteld dat drie RUNX2 bindingsplaatsen en single-end label biotine leverde de meest reproduceerbare resultaten.

2. Bereid 5x annealing buffer: Voeg 300 ul (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 pl (1 M _MgCl2), 10 gl (1M DTT) aan 260 ui _H2O (def 600 pi).
3. 200 pmol van elk enkelstrengs oligonucleotide (3 ui), voeg 12 pl 5x hybridisatie buffer en 45 ui _H2O in totaal 60 pl (200 pmol/60 ui).
4. Verhit bij 95 ° C gedurende 5-10 minuten in een verwarmingsblok.
5. Koel af tot 65 ° C langzaam (door het instellen van de temperatuur tot 65 ° C, het duurt 15 min), daarna afkoelen tot kamertemperatuur langzaam door de stroom van de verwarming blok (of door het plaatsen in 50 ml van de 65 ° C water af in een bekerglas op het ijs, dit duurt 15-20 minuten).

4. Bereiding van 96-well platen

OPMERKING: melkeiwitten niet in de wasbuffers.

1. Fix plaat met bevestigings-oplossing (0,1 M natriumcarbonaat): voeg 300 ul / putje.
2. Incubeer 2 uur bij schommelen bij kamertemperatuur (RT), of geen schommelen bij 4 ° C (O / N).
3. Was plaat 3x met streptavidine wasbuffer (WB): voeg 300 ul / putje elke keer.
4. Add-biotine-gelabelde dubbelstrengs oligonucleotide (3 consensus bindingsplaatsen per nucleotide) gedurende 2 uur wet schommelen (1,25 nmol / goed; 100 ul / putje).
5. Wassen 3x met koud WB: voeg 300 ul / putje en dan onmiddellijk keren de plaat in een gootsteen en dep de randen op een papieren handdoek na elke toevoeging.

OPMERKING: Gebruik geen pipet tips om vocht uit de platen te verwijderen, omdat dit avidine kan schrapen: biotine: DNA-complexen uit de putjes. Doe dit voor alle volgende wasbeurt stappen.

5. Incubatie met kernextract

OPMERKING: Gebruik geen vervanging zalm of haring sperma DNA voor de poly dI / DC blokkerende buffer. Vermijd het blokkeren van platen met melkeiwitten. Beide blokkerende middelen resulteren in hoge achtergrondwaarden.

1. Incubeer met specifieke transcriptiefactor bereid uit kernextract (90 ul / putje). Bereid een master mix die kernmateriaal extract (DNA-bindend eiwit; 3-9 ug / putje) + poly dI / DC (1 ug / ul van een 50 ug / ul voorraad) in 1x DNA-binding buffer. Volume als nodig is voor het totale aantalputten vereist (90 ul / putje).
2. Alle potentiële remmer, zoals vitamine D3 (Figuur 2) of CADD verbinding 5.221.975 (fig. 3) of de benodigde verdunning van de oplosmiddelcontrole, zoals ethanol, wordt toegevoegd in deze stap.
3. Plaats plaat op schudplatform, O / N bij 4 ° C.
4. Wassen 3x met WB: voeg 300 ul / putje

6. Toevoeging van primair antilichaam

OPMERKING: Primaire antilichaam verdunningen moet vers worden bereid - opslag wordt niet aanbevolen.

1. Verdunnen RUNX2-specifieke monoklonale antilichaam (voorraad 1 ug / ul) 1/5, 000 in Streptavidin wassen buffer. Bereid voldoende voor toevoeging aan elk putje van de plaat met 96 putjes (90 ul / putje) in drievoud.
2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudplatform.
3. Wassen 3x met WB, voeg 300 ul / putje.

7. Toevoeging van secundair antilichaam

OPMERKING: Secundair antilichaam verdunningen kunnen sto zijnrood bij 4 ° C overnacht eventueel de volgende dag.

1. Verdun F _{ab-specifieke} affiniteitsgezuiverd-HRP geconjugeerd antilichaam (7,1 mg / ml voorraad) om 1:1,400 in Streptavidin wassen buffer: 3,5 pl antibody/5.0 ml wasbuffer. Bereid voldoende voor toevoeging aan elk putje van de plaat met 96 putjes (90 ul / putje) in drievoud.
2. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform.
3. Wash 6x met WB door het omkeren plaat in gootsteen (300 ul / putje).

8. HRP substraat en Product Development

1. Voeg 50 ul van TMB substraat per putje direct uit voorraad fles.
2. Incubeer 10-20 minuten bij kamertemperatuur in het donker (halte reactie methode) of direct te meten extinctie (continue kinetische monitoring).

9. Reactie Meting

1. Stop reactie methode: Voor visuele stop reactie, controleren op kleurverandering van helder naar blauw en stoppen reactie met 50 pi zwavelzuur.
2. Meet absorptie bij 450 nm metde Biotrak II Visible plaataflezer spectrofotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) of een vergelijkbaar instrument.
3. Continue kinetische wijze van monitoring: substraat Voeg na de laatste wasbeurt en net voorafgaand aan het plaatsen in de spectrofotometer (niet de reactie te stoppen).
4. Meet de absorptie bij 635 nm met de Bio-Tek Synergy HT Multi-reactie microplaatlezer spectrofotometer (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) of een vergelijkbaar instrument.

Resultaten

De D-ELISA methode is zeer specifiek voor de aangegeven DNA-bindingseiwit zolang een sequentie-specifieke dubbelstrengs oligonucleotide dat drie kopieën van de consensus RUNX2 bindingsplaats (ACACCA) gebruikt. Het primaire antilichaam dat het eiwit factor versterkt ook de specificiteit. Het secundaire antilichaam bevat covalent gebonden mierikswortelperoxidase (HRP) dat een duidelijk substraat (tetramethylbenzidine) omgezet in een gekleurd product voor gemakkelijke detectie (fig. 1). Daarom moet een aan...

Discussie

DNA-bindende assays worden gebruikt om het vermogen van transcriptiefactoren te interageren met DNA te meten. Voor DNA binding omvatten elektroforetische mobiliteit verschuiving (EMSA) ¹ en chromatine immuneprecipitation (ChIP) gebaseerde testen ³ en bepalingen waarbij 96-well formaat ⁴ zoals chemiluminescente assays ^2. Het EMSA is niet-kwantitatieve en maakt gebruik van radioactief gemerkt ⁽³² P) oligonucleotiden. Deze worden geïncubeerd met nucleaire eiwitten en b...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Tabel 1. Reagentia
Spectrofotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		Voor gebruik met stopreactie methode
Spectrofotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		Voor gebruik met continue kinetische monitoring
Tabel 2. Apparatuur