Method Article

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

DOI:

10.3791/50521

⸱

July 23rd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende introduceren Agrobacterium tumefaciens In planten voor eiwithoudende transiënte expressie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoogdiercelculturen is het belangrijkste platform voor de commerciële productie van humane vaccins en therapeutische eiwitten. Het kan echter niet voldoen aan de toenemende wereldwijde vraag naar geneesmiddelen vanwege de beperkte schaalbaarheid en hoge kosten. Planten hebben aangetoond dat een van de meest veelbelovende alternatieve farmaceutische productieplatforms die robuust, schaalbaar, goedkoop en veilig. De recente ontwikkeling van virus-gebaseerde vectoren is toegestaan ​​snelle en hoog-niveau transiënte expressie van recombinant eiwitten in planten. Verder optimaliseren van de bruikbaarheid van het tijdelijke expressiesysteem, demonstreren we een eenvoudig, efficiënt en schaalbaar methodologie om target-gen dat Agrobacterium introduceren in plantenweefsel in deze studie. Onze resultaten geven aan dat zowel agroinfiltration spuit en vacuüm methoden hebben geleid tot de efficiënte introductie van Agrobacterium in bladeren en levenskrachtige twee fluorescerende eiwitten, GFP en DsRed. VoortsWe tonen de unieke voordelen van beide methoden. Spuit infiltratie is eenvoudig en dure apparatuur hoeft niet. Ook kan de flexibiliteit om ofwel infiltreren gehele verlaten met een doelgen, of genen van meerdere doelen voeren op een blad. Zo kan het worden gebruikt voor laboratoriumonderzoek expressie van recombinante eiwitten en voor verschillende eiwitten of vectoren waarin voor yield of expressie kinetiek. De eenvoud van de spuit infiltratie suggereert ook haar nut in de middelbare school en universiteit onderwijs voor het vak van de biotechnologie. Daarentegen, vacuüm infiltratie meer robuust en opgeschaald voor commerciële vervaardiging van farmaceutische eiwitten. Het biedt ook het voordeel van het kunnen plantensoorten die niet vatbaar is voor spuit infiltratie zoals sla en Arabidopsis zijn agroinfiltrate. Kortom, de combinatie van spuit en vacuüm agroinfiltration biedt onderzoekers en docenten een eenvoudige, efficiënte en robuustemethodologie voor transiënte eiwitexpressie. Het zal veel gemakkelijker de ontwikkeling van farmaceutische eiwitten en bevorderen van wetenschappelijk onderwijs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinds 1970 zijn planten onderzocht als alternatieven voor zoogdieren, insecten en bacteriële celculturen voor de commerciële productie van recombinant proteïnen en therapeutische eiwitten 1. Plant-gebaseerde systemen voor de expressie van biofarmaceutische producten hebben aangetoond belofte in de afgelopen jaren een aantal nieuwe behandelingen voor ziekten, zoals de ziekte van Gaucher 2, en aviaire influenza H5N1 3, succesvol zijn gebleken in klinische onderzoeken. De ontwikkeling van competente mechanismen voor recombinante eiwitexpressie in planten in de decennia aangezien deze eerste experimenten heeft het potentieel voor plantaar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plant Groei

  1. Plaats 60 turf pellets in een vermeerdering lade. Voeg 4 L van kraanwater en laat de turf pellets absorberen het water voor 2 uur.
  2. Voeg 2 N. benthamiana zaden in elke turf pellet met een zaaimachine, bedek de schaal met een doorzichtige plastic koepel en laat ze ontkiemen in een 25 ° C, 84% vochtigheid met een 16/8 uur dag / nacht cyclus (Figuur 1A).
  3. Verwijder de koepel twee weken na het zaaien, afvoer van water uit de lade en voeg 2 L van Jack's kunstmest bij een concentratie van 1,48 g / L (Figuur 1B). Blijven planten groeien in een 25 ° C, 50% vochtigheid met een 16/8 uur ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Expressie van fluorescerende eiwitten door Spuit Infiltratie

GFP en DsRed - - Om de effectiviteit van de spuit infiltratie van Agrobacterium in het plantenweefsel te tonen, hebben we de expressie van twee fluorescerende eiwitten getest door twee verschillende gedeconstrueerd planten virale vectoren - geminiviral en MagnICON - in N. benthamiana. Voor N. benthamiana bladeren die volledig werden geïnfiltreerd met Agrobacteriën bevattende geminiviral vectoren,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De toenemende vraag naar eiwit gebaseerde geneesmiddelen wereldwijd vereisen nieuwe productieplatforms die robuust, schaalbaar, lage kosten en een kluisje. Planten hebben aangetoond dat een van de meest veelbelovende alternatieve productiesystemen voor farmaceutische productie eiwit. In de afgelopen jaren is de ontwikkeling van deconstructed virus gebaseerde vectoren transiënte expressie van eiwitten in planten, die sterk verbetert de snelheid en opbrengst van plantaardige expressiesystemen 2,10 ingeschakeld........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken R. Zon en andere studenten van Chen's Laboratorium voor hun bijdrage aan materiaal generatie planten. We danken ook dr. D. Green voor zijn steun van undergraduate onderzoek in de Universiteit van Technologie en Innovatie (CTI). Dit onderzoek werd mede ondersteund door NIH subsidie ​​U01 AI075549 en 1R21AI101329 naar Q. Chen, en een SSE subsidie ​​van CTI van de Arizona State University naar Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, en J. Stahnke zijn undergraduate studenten ondersteund door de SSE subsidie.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRedClontech632152www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON VectorIcon Geneticsn/awww.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral VectorAuthor’s Labn/aSee reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamianaAuthor’s Labn/aherbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101Author’s Labn/aSee reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, platesSigmaL0418www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, platesSigmaL0543www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrateSigmaM2773-500 gwww.sigmaaldrich.com
Bacto-TryptoneFisher73049-73-7www.fishersci.com
Bacto Yeast ExtractBecton, Dickinson CO.REF 212750www.bd.com
Difco Nutrient BrothBecton, Dickinson CO.REF 234000www.bd.com
MES hydrate BufferSigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
CarbenicillinSigmaC1613-1MLwww.sigmaaldrich.com
KanamycinSigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com
Sodium HydroxideSigma221465www.sigmaaldrich.com
Jack’s FertilizerHummert InternationalJul-25www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum PumpFisher13-878-113www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator ValveFisherNC9386590www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ringFisher08-594-15Cwww.fishersci.com
3 L TubRubber-Maidn/aRubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230MLFisherNC9489269www.fishersci.com
Peat PelletHummert International14-2370-1www.hummert.com
Propagation Tray Domehydrofarm132052www.hydroponics.net
Propagaiton Trayhydrofarm138758www.hydroponics.net
Virbo Hand SeederGro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelfHummert International65-6924-1www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture TubesSigmaCLS430172-500EAhttp://www.sigmaaldrich.com
SpectrophotometerBio-Rad170-2525www.bio-rad.com
Spectrophotometer CuvettesBio-Rad223-9950www.bio-rad.com
Microcentrifuge TubesUSA Scientific1415-2500www.usascientific.com
Benchtop CentrifugeBio-Rad166-0602EDUwww.bio-rad.com
Incubator/ShakerEppendorfExcella E25www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
  2. Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AgroinfiltrationTransient ExpressionRecombinant ProteinsSyringe InfiltrationVacuum InfiltrationPlant BiotechnologyGFP ExpressionDsRed ExpressionAgrobacterium CulturePlant Transformation

Related Articles