Methodenartikel

Force Measurement Tijdens Inkrimping naar Muscle Function beoordelen in zebravis Larven

DOI:

10.3791/50539

⸱

23 juli 2013

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Michigan , 2Department of Surgery, Section of Plastic Surgery, University of Michigan , 3Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan , 4Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krachtmetingen kunnen worden om veranderingen in spierfunctie gevolg van ontwikkeling, verwonding, ziekte, behandeling of chemische toxiciteit tonen. In deze video, tonen we een methode om kracht te meten tijdens een maximale contractie van de zebravis larven romp spieren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravis larven bieden modellen van spierontwikkeling, spierziekte en spier-gerelateerde chemische toxiciteit, maar verwante studies vaak niet functionele maatregelen van spieren gezondheid. In deze video artikel, demonstreren we een methode om kracht generatie te meten tijdens het samentrekken van de zebravis larven romp spieren. Krachtmetingen worden bereikt door het plaatsen van een verdoofde larve in een kamer gevuld met een zoutoplossing. Het voorste uiteinde van de larve is gekoppeld aan een krachtopnemer en het achterste uiteinde van de larve is gebonden aan een lengte controller. Een isometrische twitch contractie wordt opgewekt door elektrische veld stimulatie en de kracht respons is opgenomen voor analyse. Troepenmacht tijdens samentrekking geeft een maat voor de algehele gezondheid spier en in het bijzonder biedt een maatstaf voor de spierfunctie. Hoewel deze techniek beschrijven voor gebruik met wildtype larven kan deze werkwijze worden gebruikt met genetisch gemodificeerde larven of larven behandeld met drugs of toxische stoffen,naar spierziekte modellen karakteriseren en behandelingen te evalueren, of om spierontwikkeling, verwonding, of chemische toxiciteit te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jonge zebravis (Danio rerio) larven, 3-7 dagen na de bevruchting (DPF), worden steeds meer erkend als een nuttig organisme voor skeletspieren onderzoek. Jonge larven worden gebruikt voor het model menselijke spierziekte 1-9, evalueren drugs en ​​therapeutische strategieën 10-11, studie spierblessure 12, begrijp spierontwikkeling 13-16, en te onderzoeken spier-gerelateerde chemische giftigheid 17-19. Typische studies in deze gebieden te onderzoeken in hoeverre gezonde spier abnormale gemaakt door genetische manipulatie of blootstelling aan toxische agentia, en sommige studies onderzoeken de mate waarin abnormale spier op de behandeling reageert. Essentieel belang voor het succes van deze studies is de mogelijkheid om nauwkeurig te beoordelen spieren gezondheid.

Hoewel er een verscheidenheid van methoden beschikbaar om spieren gezondheid te beoordelen in de zebravis larven, weinig directe informatie over de spierfunctie. Muscle gezondheid wordt gewoonlijk geëvalueerd door appearance, zoals beoordeeld door histologische kleuring 6,8,11, immunostaining 9,15,16,18, lichtmicroscopie 3,13, elektronenmicroscopie 3,4,14,16, of dubbele breking 7,9,11, maar deze technieken bieden morfologische informatie alleen. Romp en staart verplaatsingen en zwemmen snelheid 4,17 evalueren motorische functie, maar deze zijn niet direct maatregelen van spierfunctie omdat ze weerspiegelen ook de neurale input, energiemetabolisme, en andere processen.

In tegenstelling, het meten van de troepenmacht tijdens samentrekking geeft een directe beoordeling van de spierfunctie en vertegenwoordigt een maat voor de algehele gezondheid spier. Extra voordelen van deze aanpak zijn eenvoudig data-analyse en kwantitatieve resultaten. In deze video artikel geven we een gedetailleerde procedure voor het meten van de troepenmacht door larvale spieren, in de hoop dat meer onderzoekers deze methode zullen gebruiken om bestaande maatregelen van spieren gezondheid aanvullen in hun onderzoek.

Het algemene doel van deze methode is om de troepenmacht te meten tijdens het samentrekken van de zebravis larven romp spieren. Om dit doel te bereiken, een zebravis larve is verdoofd en geplaatst in een kamer gevuld met een zoutoplossing. Het voorste uiteinde van de larve is gekoppeld aan een krachtopnemer en het achterste uiteinde van de larve is gebonden aan een lengte controller. Spieractiviteit wordt bereikt door elektrisch veld stimulatie en de stimulatie stroom en de lengte van de larven worden ingesteld voor een optimale twitch kracht produceren. Een isometrische twitch contractie wordt opgewekt en de kracht respons is opgenomen voor analyse.

Om duidelijk te zijn, is deze techniek niet te meten krachten die ontstaan ​​door larvale spieren tijdens het zwemmen. Omdat beide uiteinden van de larven zijn gebonden aan apparatuur en omdat de larve blijft narcose kan niet leiden beweging tijdens de test. Bovendien veldstimulatie activeert alle spiervezels tegelijkertijd een bil inducerenateral contractie, wat niet is wat van nature 20. Daarom, in plaats van het meten van de werkelijke krachten die tijdens het zwemmen, deze techniek bepaalt de kracht genererende capaciteit van de larvale spieren.

Wij hebben deze techniek gebruikt om spierzwakte in een zebravis model van nemaline myopathie 21, alsmede het effect van antioxidantbehandeling op spierfunctie evalueren een zebravis model van multi-MiniCore ziekte 22 tonen. Anderen hebben een soortgelijke techniek 23 om de gevolgen van een milieuvervuiling op de spierfunctie 19 onderzoeken gebruikt.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: alle procedures waarbij zebravissen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen, verordeningen, en regelgevende instanties. Alle procedures gebruik van dieren die in dit artikel zijn goedgekeurd door de Universiteit van Michigan Comite over het gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA).

1. Maak Suture Loops

  1. Gebruik een tang om niet-steriel hechtdraad (USP 10/0 monofilament nylon, 3 laags) scheiden in drie onderdelen.
  2. Beginnen met een dubbele overhandse knoop in een van de strengen. Stoppen voordat het aandraaien van de knoop volledig om een ​​klein (~ 1 mm diameter) lus in plaats van een knoop te maken.
  3. Gebruik een schaar om het overtollige hechtdraad gesneden uit de lus staarten. Een voorbeeld van een voltooide lus is weergegeven in figuur 1.
  4. Plaats de lus aan de kleverige kant van een Post-it Note voor later gebruik. De hechting lussen worden gebruikt om de larven tijdens krachtmetingen houden.
  5. Herhaal stappen 1.1-1.4 noodzakelijk. Make twee hechtdraad lussen voor elke larve die zal worden getest.

2. Maak Testing Solution

  1. Voeg Tyrodes door toevoeging 7,977 g natriumchloride, 0,373 g kalium-chloride, 0,265 g calciumchloridedihydraat, 0,102 g magnesiumchloride hexahydraat, 0,048 g natriumfosfaat monobasisch 1,000 g natriumbicarbonaat en 0,037 g ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzoutdihydraat tot 1000 ml gezuiverd water.
  2. Roer de oplossing totdat de zouten volledig zijn opgelost. Deze oplossing kan worden opgeslagen voor een maand bij 4 ° C.
  3. Voeg 2,1 ml 4 mg / ml tricaïne, bereid volgens de zebravis Book 24, 47,9 ml Tyrodes oplossing en meng. Bescherm deze oplossing tegen licht door te slaan in een donkere glazen fles of in een glazen fles bedekt met aluminiumfolie. Deze oplossing moet bij kamertemperatuur worden opgeslagen en opgemaakte elke dag.

3. Bind Aanesthetized larve in Experimental Kamer

  1. Plaats het testapparaat (Figuur 2) op het podium van een stereo-microscoop.
  2. Sluit de krachtopnemer en de lengte controller kabels om het apparaat te testen. Schakel de krachtopnemer. Schakel de lengte controller, zodat het rigide blijft. (Opmerking:.. De lengte regelaar biedt de mogelijkheid te rekken of inkorten spiervoorbereiding tijdens contractie Maar deze functie van de lengte regelaar niet in de hierin beschreven werkwijze derhalve de lengte controller kan worden gezien als een stevige bevestiging punt gemonteerd op een XYZ positioning system).
  3. Met een disposable pipet overdracht, vul de experimentele kamer met het testen oplossing.
  4. Gebruik een tang te halen een hechtdraadlus door een van de staarten en hang het aan de krachtopnemer buis. Hang een tweede hechtdraadlus op de buis bevestigd aan de lengte controller. (Opmerking: het grijpen van een hechtdraadlus op het gebogen deel kan knikken de hechtdraad en Cause het te breken tijdens volgende stappen).
  5. Met een disposable pipet overdracht, overdracht van een zebravis larve een kleine petrischaal gevuld met testen oplossing. Wachten tot de verdoving in de testoplossing (tricaïne) van kracht (~ 1 min) nemen. Met een pincet, zachtjes duwen de staart en controleer of de larve is verdoofd door een gebrek aan touch-opgeroepen zwemmen.
  6. Gebruik een glazen pipet om de larve te dragen aan de experimentele kamer.
  7. Door zachtjes duwen de larve met gesloten tang, begeleiden het voorste gedeelte van de larven door de hechtdraadlus op de krachtopnemer buis. Begeleiden het voorste gedeelte van de larven door de hechtdraadlus op de buis. Pak beide hechtdraadlus staarten met een pincet en trek ze tegelijk naar de hechtdraadlus posterior aan de dooierzak of zwemblaas (figuur 3A) vast.
  8. Met een pincet, houdt men hechtdraadlus staart en trek, waardoor de larve tot 90 ° draaien om de buis tot aan de laterale zijde van de larve gezichts up (Figuur 3B). Als de lus genoeg werd aangescherpt, zal er wat weerstand tegen de trek zijn, de larve moeten niet optimaal van. Als de lus is te veel aangescherpt, zal de larve niet draaien om de buis.
  9. Met behulp van de XYZ-positionering apparaat dat op de lengte controller, verplaatsen de lengte controller buis langs de X-as (definities as in figuur 2A) en onder de romp en de staart van de larve. Laat ruimte tussen de uiteinden van de lengte controller buis en de krachtopnemer buis.
  10. Begeleiden de hechtdraadlus over de staart van de larve en draai de hechtdraadlus zoals eerder beschreven (Figuur 3C). U kan nodig zijn om het achterste deel van de larve draaien, zodat de laterale zijde naar boven. Trim de hechtdraadlus staarten (Figuur 3D).

4. Positie Larve in Experimentele Kamer

  1. Verplaats de larve naar een geschikte afstand van de kamer beneden aan de larve w zorgenziek binnen "werkafstand" van een omgekeerde microscoop objectief tijdens daaropvolgende stappen. Om dit te bereiken, gebruiken de XYZ-positionering apparaten te langzaam lager de buizen (met bijgevoegde larve) langs de Z-as totdat de buizen net tegen de bodem van de kamer. Vervolgens verhogen de buizen totdat de larve is een geschikte afstand van de kamer beneden (~ 100 micrometer).
  2. Met de XYZ positioneerinrichting aan de lengte controller, de lengte controller buis langs de Y-as op de lengteas van de larve met de lange as van de krachtopnemer buis uitlijnen.

5. Record Force Tijdens een Maximal Twitch Contraction

  1. Verplaats de proefapparatuur de fase van een omgekeerde microscoop.
  2. Stel de kamertemperatuur tot een gewenste waarde. Om te beginnen, sluit het waterbad circulator, thermometer, en temperatuurregelaar om het apparaat te testen. Zet de benodigde componenten en pas de instelling van de temperatuur controller totdat de thermometer meldt de gewenste waarde. Gegevens in dit artikel werden verzameld bij 25 ° C, maar metingen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of bij 28.5 ° C.
  3. Sluit de kabels van de stimulator om het apparaat te testen. Schakel de stroom naar de stimulator maar de larve tot stap 5.6 niet stimuleren.
  4. Controleer de larve evenwijdig aan de kamerbodem. Via een 40X objectief, zie het gedeelte van de larve tussen de uiteinden van de buizen. Als evenwijdig aan de bodem, zullen beide uiteinden van de larve in focus. Pas indien nodig de krachtopnemer buis langs de Z-as totdat beide uiteinden zijn in focus.
  5. Controleer of de larve lengte korter is dan optimaal. Zet de video sarcomeer lengte systeem en draai de videocamera zodanig dat de strepen worden evenwijdig aan de zijkanten van het videoframe. Dit systeem controleert afstand strepen door het analyseren van variaties in pixelintensiteit langs elke horizontale rij van pixels binnen een door de gebruiker gedefinieerde regio van belang(ROI). De resultaten voor alle rijen in het ROI worden gemiddeld en gerapporteerd met een frequentie gelijk aan de video frame rate (≥ 80 sec -1). De afstand ribbeltje wordt gebruikt als indicator van sarcomeer lengte.
  6. Stel de microscoop te richten op perifere vezels en noteer de aangegeven sarcomeer lengte. Indien nodig, gebruik maken van de XYZ-positionering apparaat dat op de lengte-controller om de lengte van de larve aanpassen (X-as) totdat de sarcomeer lengte van minder dan optimaal (bijv. 1.90 pm).
  7. Stel de stimulatie stroom naar twitch kracht te optimaliseren. Om te beginnen, stellen de uitgangsstroom op de stimulator een lage magnitude (bijv. 100 mA). De stimulator kan handmatig of met een computer met een aangepast LabVIEW programma worden geactiveerd. Ontlokken een twitch van de larvale spieren met een stroomstoot van 0,2 msec in duur.
  8. Gebruik een oscilloscoop om de kracht productie nemen en te meten van de piek twitch kracht met behulp van cursors de oscilloscoop's. Verhoging van de huidigein stappen van 50 mA en meet de piek twitch kracht bij elke huidige niveau. Wacht 30 seconden tussen de samentrekkingen om vermoeidheid te voorkomen. Als stimulatie huidige toeneemt, piek twitch kracht toeneemt meestal tot een maximum en daarna geleidelijk afneemt. De stroom waarbij de larve genereert de grootste kracht is de optimale stimulatie stroom. Stel de huidige amplitude om de optimale stimulatie huidige.
  9. Met de XYZ positioneerinrichting, de lengte van de larve (en dus sarcomeer lengte) om maximale twitch kracht opwekken. Wildtype zebravis larven (3-7 DPF) genereren maximale twitch kracht bij sarcomeer lengte van 2,10 micrometer of 2,15 micrometer. Toch kan het sarcomeer lengte worden ingesteld op 2,08 pm tot overtollige spanning op de larve te voorkomen.
  10. Ontlokken een twitch van de larvale spieren. Gebruik de oscilloscoop om de kracht respons opnemen en opslaan van het record voor verdere analyse.

6. Meet Musculature Afmetingen met larve op optimale lengte

  1. Verplaats het apparaat testen terug naar de stereo-microscoop.
  2. Met behulp van het oculair schaal, meet de hoogte van de spieren, gezien vanaf de zijkant. Dan, zorg ervoor dat u de lengte van de larve verandert, zwenken de larve van 90 ° met de hechtdraadlus staarten om de larve te bekijken vanaf de onderkant. Meet de breedte van de musculatuur gezien vanaf de bodem. Neem de metingen op een anatomisch herkenningspunt (bijv. urogenitale opening) (Figuur 4).
  3. Snijd de hechtdraad lussen met een microblad de larve van de testapparatuur los.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij gezonde wildtype zebravis larven moeten de spiervezels parallel aan elkaar zonder grote verschillen tussen hen en hebben duidelijk strepen (figuur 5A). Wildtype zebravis larven die niet vertonen deze functies, of met duidelijke schade zoals vrijstaande vezels (figuur 5B), moet worden weggegooid.

Een representatieve grafiek van piek twitch kracht tegen elektrische stimulatie voor een zebravis larve wordt getoond in figuur 6. Voor wildtype zebravis larven tussen 3-7 dpf, de optimale stimulatie stroom is meestal tussen de 400-600 mA, met 3 dpf larven vereist over het algemeen groter stimulatiestroom dan 6-7 dpf larven.

De ruwe krachtdata (in stap 5.8 verzameld) moet worden verwerkt en geanalyseerd met gegevensanalyse software. Eerst wordt de basislijn van de kracht record op nul. Ten tweede wordt de uitgangsspanning van de krachtopnemer omgezet kracht (mN) (zie instructies van de fabrikant om een ​​kalibratiecurve voor de krachtopnemer genereren). Een vergelijkingskracht respons tijdens een maximale twitch samentrekking van een larve verzameld wordt getoond in figuur 7. Gegevensanalyse software kan worden gebruikt om maximaal vermogen en andere kenmerken van de kracht respons te bepalen.

Een representatieve reeks gegevens van piekkracht maximale twitch contracties wordt getoond in Figuur 8A. Typische piek twitch geldende waarden voor wild-type 3-7 dpf larven range 0,9-1,7 mN, met oudere larven het genereren van meer kracht dan jongere larven. Verschillen in piek twitch kracht kan worden door normale processen zoals groei en ontwikkeling (figuur 8) of abnormale processen zoals genmutatie-pathologie 21,22.

Normalization door spierkracht doorsnede (CSA) kan worden gebruikt om de mate waarin verschillen in de piek twitch geldende louter vanwege differe bepalen nces in grootte van de spieren 21,22. Muscle CSA kan worden geschat met de formule: CSA = π (A / 2) (B / 2), waarin A de lengte van de spieren gezien vanaf de zijkant, B de breedte van de musculatuur gezien vanaf de bodem, en een elliptische dwarsdoorsnede is uitgegaan. Typische CSA waarden voor wild-type 3-7 dpf larven range 0,027-0,034 mm 2, met 3-4 dpf larven algemeen toont kleiner CSA waarden dan 5-7 dpf larven. Een representatieve reeks genormaliseerde piekkracht data van maximale twitch contracties wordt getoond in Figuur 8B. Typische genormaliseerde piek twitch geldende waarden voor wild-type 3-7 dpf larven range 34-51 mN / mm 2, met 4-7 dpf larven algemeen toont hogere waarden dan 3 dpf larven.

figure-results-1
Figuur 1. Hechtdraadlus. Pijlen wijzen naar de hechtdraadlus staarten.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" altijd "> figure-results-2
Figuur 2. (A) Omschrijving van de apparatuur met gelabelde onderdelen. (B) Close-up uitzicht op de experimentele kamer. (A) Experimentele kamer met transparante bodem. (B) Krachtopnemer. (C) Lengte controller. (D) XYZ positioneersystemen. De X-, Y-, en Z-as worden gedefinieerd in de rechterbovenhoek. (E) Temperatuurregelingssysteem gebruik thermo-elektrische modules. Tubing herbergt waterstroom voor de koeling van de thermo-elektrische modules. (F) Roestvrij stalen buis bevestigd aan transducer dwingen. (G) Roestvrij stalen buis bevestigd aan lengte controller. (H) Thermometer microsonde. (I) Platinum parallel plaatelektroden, verspreid over de lengte van dekamer. Platina platen zijn 2,5 mm hoog en 0.255 mm dik.

figure-results-3
Figuur 3. Koppelverkoop larve in experimentele ruimte. (A) Larve gebonden aan ten voorste einde, maar nog niet 90 ° gedraaid. (B) Larve na gedraaide 90 °. (C) Larve gebonden aan ten achterste einde, maar nog niet gedraaid. (D) Larve na gedraaide en hechtdraadlus staarten worden geknipt.

figure-results-4
Figuur 4. Metingen voor transversale schattingstechnieken. Musculature gezien vanaf de (A) zijde en (B) bodem. Plaatsing van de rode balken geven de locatie van de urogenitale opening. De lengte van de rode balken geven de hoogte en breedte van de spieren, gezien vanaf respectievelijk de wand en bodem.

figure-results-5
Figuur 5. Zijaanzicht van de zebravis larven romp musculatuur. (A) gezonde weefsel. (B) Weefsel met duidelijke schade. Contracturen als gevolg van vezels detachementen zijn gemarkeerd met sterretjes.

figure-results-6
Figuur 6. Vertegenwoordiger perceel van piek twitch kracht tegen stimulatiestroom. De optimale stimulatie stroom is 500 mA.

figure-results-7
Figuur 7. Vergelijkingskracht record voor een enkele twitch contractie. Deze samentrekking is opgewekt met een stimulus puls op 0 msec. De piek kracht is 1,56 mN.

figure-results-8
Figuur 8. Vergelijkingskracht gegevens van 3-7 dpf larven. (A) Toplast gegevens van maximale twitch contracties. (B) Toplast gegevens van maximale twitch contracties genormaliseerd naar CSA. Oudere larven (6-7 DPF) werden gevoed Hatchfry Encapsulon Grade 0 met Spirulina (Argent Laboratories) begint op 5 dpf. Middelen + standaardafwijkingen gerapporteerde N = 5 in elke groep. Groepen significant verschillend van 3 dpf larven (*) en 4 dpf larven (#) zijn aangegeven (ANOVA, p <0,05). De aanzienlijke stijging van de genormaliseerde kracht tussen de 3 en 4 dpf (B) wijst op een stijging van de intrinsieke kracht genererende capaciteit in deze periode, terwijl de toename van de kracht tussen de 4 en 6-7 dpf (A) wordt toegeschreven aan de groei op basis van no veranderen van 4 tot 7 dpf in genormaliseerde kracht.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode meet de troepenmacht tijdens een twitch om de spierfunctie te evalueren in rompspieren van zebravis larven. Hoewel tetanische contracties kunnen worden uitgelokt in de zebravis larven (bijvoorbeeld door 200 stimulatie pulsen / sec voor een duur van 0,2 sec), de maximale tetanische kracht is slechts 10-15% groter is dan de maximale twitch kracht. Daarom is de kracht die tijdens een twitch een redelijke mate van kracht genererende mogelijkheden. Samentrekkingen zijn voorkeur boven tetanische contracties omdat samentrekkingen hebben minder kans op scheuren of uitglijden op de hechting banden veroorzaken.

Om zinvolle gegevens met deze techniek te genereren, moet maximale twitch kracht worden bereikt voor elke larve en de variabiliteit tussen de experimentele groepen moet worden geminimaliseerd. Met deze doelstellingen in het achterhoofd, bieden wij de volgende suggesties. Ten eerste, moet u erop letten wanneer de koppelverkoop van de larve van de krachtopnemer en de lengte controller buizen. Als de hechting lussen te worden aangedraaidveel, zal de hechting dwars door het spierweefsel. Indien de hechting lussen niet voldoende aangedraaid, de kracht die door de larven niet volledig overgebracht op de krachtopnemer. Beide situaties, maar vooral de laatste, onderschatten maximale twitch kracht. Ten tweede, omdat het testen van meerdere experimentele groepen kan enkele uren (20-30 min / larve), afwisselend tussen groepen te nemen, omdat de larven zal blijven ontwikkelen tijdens de testperiode.

Hoewel sommige van de genoemde apparatuur is essentieel voor het meten van de maximale twitch kracht (bv. krachtopnemer, huidige stimulator), andere items zijn niet absoluut noodzakelijk. De video sarcomeer lengte is gewenst maar niet vereist. Als alternatief kan een reeks samentrekkingen worden om optimale lengte, waarbij de lengte van de larve wordt aangepast tot maximum samentrekkende kracht worden behaald. Een temperatuurregeling is ook niet absoluut noodzakelijk. Temperatuurregeling is kritisch wanneer measuring twitch kinetiek, die zeer gevoelig zijn voor temperatuur, terwijl maximale twitch kracht niet bijzonder gevoelig is voor kleine veranderingen in de temperatuur en kan worden gemeten bij kamertemperatuur. Merk op dat, ongeacht de temperatuur in de kamer tijdens krachtmetingen, de larven worden ° C 24 voordat kracht gehandhaafd op de optimale groeitemperatuur van 28,5 testen voor nauwkeurige staging.

De larven worden getest in een Tyrodes oplossing die tricaïne. We gebruiken 0.02% (w / v) tricaïne, de concentratie aanbevolen voor anesthesie 24 tot spontane contracties opgewekt door het zenuwstelsel te elimineren en dus tijdens krachtmetingen vermoeidheid te voorkomen. Tricaïne vergemakkelijkt ook de tie-op stap en vermindert de totale testtijd. Echter, we dat ook tricaïne in de testoplossing consequent vermindert de maximale twitch kracht met ongeveer 30%. Een soortgelijk effect is ook waargenomen in kikkervisje staart spier, waarbij tricaine verminderde kracht generatie na neuromusculaire transmissie is geblokkeerd, wat suggereert dat tricaïne heeft een direct effect op de spieren 25. Tricaïne kan spiercel prikkelbaarheid verminderen door natrium conductantie over het celmembraan, zoals in zenuwcellen 26. Andere opties voor het blokkeren van activatie van motoneuronen zijn d-tubocurarine en α-bungarotoxine maar in tegenstelling tricaïne zijn deze verbindingen niet-permeabele huid en moet rechtstreeks worden geïnjecteerd in de kop, ruggenmerg, of het hart 27. Individuele onderzoekers zal moeten beoordelen of tricaïne wenselijk is voor hun specifieke toepassing. Als tricaïne is opgenomen in de testoplossing, moet de concentratie verenigbaar tussen experimenten en onderzoekers moet controleren of het effect van de tricaïne niet varieert tussen experimentele groepen.

We beschrijven deze methode voor larven zo jong als 3 dpf en zo oud als 7 dpf. Hoewel spiervezels lijken functional zo vroeg als 17 uur na de bevruchting, als spontane staart bewegingen beginnen 27, de korte lengte van de staart vóór 3 dpf hindert de binding van de larve van de testapparatuur. We hebben meestal geen testen larve na 7 dpf omdat veel ziekte-modellen niet veel langer dan deze tijd te overleven. Als test larven dan 5 dpf moet de larven worden gevoed. We hebben geconstateerd dat unfed larven hebben kleinere spieren en het genereren van minder maximale twitch kracht dan gevoed larven, waarschijnlijk te wijten aan de afnemende dooierzak. Aldus kan het wenselijk zijn larven tussen 3-5 dpf te testen, de extra variabele externe voeding voorkomen.

Samengevat beschrijven we een kwantitatieve en betrouwbare methode voor het meten van kracht genereren tijdens een maximale twitch samentrekking van zebravis larven trunk spier. Deze methode kan worden gebruikt om de algemene gezondheid van de zebravis larven spier beoordelen en specifiek geeft informatie over spierfunctie. Naast het verstrekken van informatie over degrootte van de kracht generatie, kan deze techniek worden gebruikt om de kinetiek van de troepenmacht studeren of worden aangepast aan spiervermoeidheid 22 bestuderen. Hoewel deze techniek beschrijven voor gebruik met wildtype larven kan deze werkwijze worden toegepast voor genetisch gemodificeerde larven of larven behandeld met drugs of toxische stoffen om spier ziektemodellen karakteriseren en behandelingen evalueren of spierontwikkeling, spierverwonding of studie spier-gerelateerde chemische toxiciteit.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Angela Busta voor hulp bij zebravissen veehouderij. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (AG-020591 naar SVB en 1K08AR054835 te JJD).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS
Tricaine poederSigma-AldrichA5040
NatriumchlorideSigma-AldrichS7653
KaliumchlorideSigma-AldrichP9541
CalciumchloridedihydraatSigma-Aldrich223506
MagnesiumchloridehexahydraatSigma-AldrichM2670
NatriumfosfaatmonohydraatSigma-AldrichS0751
NatriumbicarbonaatSigma-AldrichS6297
EthyleendiaminetetraazijnzuurdinatriumzoutdihydraatSigma-AldrichE5134
EQUIPMENT
Nonsteriel-naadAshaway Line TwineS30002USP 10/0 monofilament nylon (3-laags)
PincetFine Science Tools11251-20Dumont #5
VerenschaarFine Science Tools15000-08Vannas
StereomicroscoopLeica MicrosystemsMZ8Verlicht met Fostec EKE ACE I-lichtbron
Krachttransducerfigure-materials-1 Aurora Scientific400A
Lengtecontrollerfigure-materials-2 Aurora Scientific318B
XYZ-positioneringsapparatenParker Hannifin3936M
ThermometerPhysitempBAT-12
Vaste overdrachtpipetFisher Scientific13-711-9AMSnede-uiteinde om opening te verbreden en larvenoverdracht te vergemakkelijken
PetrischaalFisher Scientific08-757-11YZ
GlaspipetFisher Scientific13-678-8BSnede-uiteinde (en vuurpolijsting) om opening te verbreden en larvenoverdracht te vergemakkelijken
Omgekeerd microscoopCarl Zeiss MicroscopyAxiovert 100
WaterbadcirculatorNeslab InstrumentsRTE-111
TemperatuurregelaarAlpha Omega InstrumentsSerie 800
Stimulatorfigure-materials-3 Aurora Scientific701CHoogvermogen, volgstimulator
Video sarcomeerlengtesysteemfigure-materials-4 Aurora Scientific900B-5A
LabVIEW-softwareNational Instruments
OscilloscoopNicolet TechnologiesACCURA 100
MicrobladFine Science Tools10050-00
MicrobladhouderFine Science Tools10053-13
Gegevensanalysesoftware (Signo)Alameda Applied Sciences

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
  2. Nixon, S. J., Wegner, J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14 (13), 1727-1743 (2005).
  3. Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. PNAS. 104 (17), 7092-7097 (2007).
  4. Hirata, H., Watanabe, T., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134, 2771-2781 (2007).
  5. Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).
  6. Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology. Neuromuscul. Disord. 20 (12), 826-832 (2010).
  7. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19 (4), 623-633 (2010).
  8. Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo. Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).
  9. Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum. Mol. Genet. , (1093).
  10. Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. PNAS. 108 (13), 5331-5336 (2011).
  11. Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J. Cell Mol. Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
  12. Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).
  13. Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Knöll, R., Bakkers, J. Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex. Dev. Biol. 318 (1), 92-101 (2008).
  14. Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development. J. Cell Biol. 181 (2), 381-394 (2008).
  15. Kim, H. R., Ingham, P. W. The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo. Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).
  16. Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function. J. Cell Sci. 123 (7), 1141-1150 (2010).
  17. Huang, H., Huang, C., et al. Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS). Aquat. Toxicol. 98 (2), 139-147 (2010).
  18. Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
  19. Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish. Neurotoxicol. Teratol. 33 (6), 752-764 (2011).
  20. Buss, R. R., Drapeau, P. Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 87 (3), 1244-1251 (2002).
  21. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
  22. Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135 (4), 1115-1127 (2012).
  23. Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae. J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).
  24. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Univ. of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
  25. Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. Muscle weakness during tricaine anesthesia. Comp Biochem Physiol Part C. 110 (3), 289-296 (1995).
  26. Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).
  27. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Spiercontractiekrachttransducerlengtecontrollerhechtlussenelektrische veldstimulatietwitchcontractiespierdwarsdoorsnedeoptimale stimulatiestroom

Gerelateerde artikelen