De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een laat In vivo Context. Immunofluorescentiekleuring nauwkeurig visualiseren vasculaire plexus is cruciaal voor het succes van deze typen studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Angiogenese is het complexe proces van vorming van nieuwe bloedvaten die door het kiemen van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaand netwerk vat. Angiogenese speelt een belangrijke rol niet alleen in de normale ontwikkeling van organen en weefsels, maar ook in vele ziekten waarbij bloedvatvorming ontregeld is, zoals kanker, blindheid en ischemische ziekten. In het volwassen leven, bloedvaten zijn over het algemeen rustig dus angiogenese is een belangrijk doelwit voor nieuwe ontwikkeling van geneesmiddelen om te proberen en te reguleren vorming van nieuwe bloedvaten in het bijzonder in de ziekte. Om beter te begrijpen angiogenese en passende strategieën om deze te reguleren ontwikkelen, zijn modellen nodig die een goed beeld van de verschillende biologische stappen die betrokken zijn. De neonatale muis netvlies een uitstekend model van angiogenese omdat slagaders, aders en haarvaten ontwikkelen om een vasculaire plexus vormen tijdens de eerste week na de geboorte. Dit model heeft ook het voordeel van twee-dionele (2D) structuur waardoor analyse eenvoudig vergeleken met de complexe 3D anatomie van andere vasculaire netwerken. Door het analyseren van de retinale vasculaire plexus op verschillende tijdstippen na de geboorte, is het mogelijk om de verschillende stadia van angiogenese waarnemen onder de microscoop. In dit artikel wordt een eenvoudige procedure voor het analyseren van het vaatstelsel van een muis netvlies met behulp van fluorescerende kleuring met isolectin en vasculaire specifieke antilichamen.
Inleiding
Angiogenese is een complex ontwikkelingsproces gedefinieerd door de vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaand netwerk vaartuig en wordt gereguleerd door verscheidene signaleringsroutes. De belangrijkste daarvan is de VEGF weg. VEGF is vrijgegeven door ischemische cellen en leidt tot de inleiding van angiogenese in naburige bloedvaten. De toonaangevende endotheelcellen van een nieuwe vasculaire spruit is een 'tip' cel, die filopodia dat uit te reiken naar de bron van VEGF produceert, en wordt gevolgd door proliferatie 'stalk' endotheelcellen. Zo geactiveerde endotheelcellen prolifereren en migreren naar een avasculaire regio waar zij deel nieuwe vasculaire buizen. Om deze buizen stabiliseren de bloedstroom, endotheelcellen interactie pericyten en gladde spiercellen, waarin de nieuwe bloedvaten 1 omringen. Angiogenese is essentieel voor vascularisatie van het embryo en groeiende weefsels. Maar het draagt ook veel pathologische aandoeningen zoals kanker en dat defecten in angiogenese worden geassocieerd met ischemische ziekten. De ontwikkeling van effectieve behandelingen met geneesmiddelen om angiogenese te reguleren als middel voor het behandelen ziekte ook van groot belang. Bijvoorbeeld, effectieve anti-angiogene groeifactoren kanker, terwijl pro-angiogene strategieën kunnen worden gebruikt om ischemische ziekte te behandelen. Aldus modellen van angiogenese essentieel voor een beter begrip van de regulatie van de vorming van nieuwe bloedvaten en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om vasculaire groei te verbeteren of te verlagen.
Een fundamenteel element van angiogenese onderzoek is de keuze van een geschikt vasculair model. Veel in vitro modellen zijn ontwikkeld om de basisstappen van angiogenese zoals endotheliale celmigratie, proliferatie en overleving 2,3 reproduceren. Een veel gebruikte in vitro assay is de vorming van een vertakt netwerk van endotheelcellen op Matrigel matrix, hoewel tzijn niet specifiek voor endotheelcellen, noch nemen gewoonlijk de steun van pericyten en gladde spiercellen. Beoordeling van ex vivo kiemen angiogenese middels muis orgelcultuur zoals embryoid body assay, de aorta-ring assay en de foetale middenvoet assay maakt de analyse van angiogenese van endotheelcellen in de context van extra ondersteunende cellen. De belangrijkste beperkingen van deze testen omvatten het gebrek aan bloedstroming en regressie van vaten in de tijd, die een weinig tijd voor analyse. Daarom, om de regulering van angiogenese beter te begrijpen, in vivo modellen nodig zoals ontwikkeld in muizen met subcutaan geïmplanteerde spons of Matrigel pluggen, evenals de achterpoot ischemie model. Echter, zijn deze modellen uitdagend te analyseren vanwege de complexe 3D-architectuur van de neovessels. Daarentegen heeft de zebravis embryo een uitstekend model voor het visualiseren angiogenese bleek in het geheelorganisme 4. Echter, de muis evolutionair veel identiek aan humaan dan zebravis, waardoor de muis een voorkeursmodel in veel gevallen. Bijgevolg angiogenese van de postnatale muis netvlies staat voor een goed gekarakteriseerd methode van keuze voor angiogenese onderzoek. Het biedt niet alleen een fysiologische omgeving, maar ook een 2D vasculaire plexus die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd met behulp van geschikte fluorescerende vlekken. De architectuur van het schip netwerk, endotheelproliferatie, kiemen, perivasculaire cel werving en vat verbouwing kunnen allemaal worden onderzocht met behulp van deze techniek.
In de neonatale muis netvlies, ontwikkeling van retinale bloedvaten optreedt in de eerste week na de geboorte. Muizen, in tegenstelling tot mensen, worden blind geboren en de netvliezen pas vascularized geworden na de geboorte. Netvliesvaten voort uit het midden van de retina nabij de oogzenuw postnatale dag 0 (P0) en ontwikkelen door angiogenese te vormen een zeer organiserend vasculaire plexus dat de retinale periferie circa P8 5 bereikt. Bloedvaten ontwikkelen op een karakteristieke wijze met de capillaire plexus geleidelijk naar buiten groeien van de optische schijf in de richting van de periferie naar een regelmatig wisselend patroon van slagaders en aders met een tussenliggende capillair netwerk genereren. De retinale vaatstelsel biedt een ideaal model om angiogenese te bestuderen omdat de schepen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd als ze groeien in wat in wezen een 2D-vlak, waardoor het relatief eenvoudig om de retinale bloedvaten in flat-mount voorbereidingen 5 onderzoeken. Werkwijze voor het isoleren van de neonatale muis netvlies analyse van endotheliale tip celreacties meerdere uren ex vivo gerapporteerd 6. Alternatief, nader onderzoek van de gehele retinale vasculatuur en bijbehorende bloedvaten markers vereist immunokleuring van vaste monsters retina in verschillende stadia van ontwikkeling.
Hier bieden wijeen gedetailleerde beschrijving van een betrouwbare en technisch ongecompliceerd methode die wij voor whole-mount kleuring van het muizen retinale vasculaire plexus, de eerste enucleatie van de postnatale oog (zie 7) door de kleuring protocollen uiteindelijke beeldvorming onder de microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.
1. Enucleatie en Fixatie van Postnatale Eyes
- Plaats op humane wijze gedood muis pup op zijn kant, verwijder de huid die het oog met een schaar.
- Gebruik een schaar en pincet voor het oog ophelderen.
- Plaats scharen onder de enucleated oog, snijd de oogzenuw en de omliggende weefsels en til het oog. Transfer naar een 24-wells plaat met 4% paraformaldehyde (PFA) bereid in 2x PBS bij kamertemperatuur.
- Laat elk oog om vast te stellen voor 10 - 15 minuten, vervolgens transfer naar koude 2x PBS op ijs gedurende 5-10 minuten. Het beste is om enucleations en de daaropvolgende vaststelling wankelen te zorgen voor de mate van fixatie is gelijk voor elk oog.
2. Dissectie van Postnatale Muriene netvliezen
- Transfer ogen in een petrischaal met 2x PBS met behulp van een plastic Pasteur pipet die is gesneden om de boring en plaats te verbreden onder een dissecting microscoop.
- Verwijder eventueel vet rond de ogen met behulp van een tang en schaar.
- Doorboren de rand van het hoornvlies met een scherpe schaar en snijd rond het hoornvlies en de iris en gooi deze weg.
- Plaats tang tussen retina en sclera en verwijder de sclera zorg ervoor dat u het netvlies scheuren. De choroid laag kan worden verwijderd, maar als er een gevaar van beschadiging van de retina die tijdens deze stap, kan het vaatvlies laag worden gelaten omdat het niet tot een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van de immunokleuring.
- Verwijder de lens en het glasvocht behulp van een tang.
- Verwijder de hyaloids schepen door het verzamelen van hen samen in het midden van het oog met een fijne tang vervolgens snel weg te trekken van het centrum van het netvlies (afwisselend knip bij basis van hyaloid schepen met fijne schaar).
- Spoel de komvormige retina met PBS in een schone petrischaal.
- Voeg 4-5 radiale insnijdingen betrekking op ongeveer 2/3 van de straal van de retina door veerkracht De schaarrs een 'blaadje' vorm te maken.
- Tap PBS met behulp van een Pasteur pipet om het netvlies af te vlakken, en verwijder vervolgens het overtollige PBS met een klein stukje absorberend papier.
- Langzaam pipet koude (-20 ° C) methanol druppelsgewijs op het oppervlak van het netvlies tot volledig bedekt en vervolgens overstromingen met extra methanol. Dit zal helpen om het netvlies te repareren en zal permeabilisatie vergemakkelijken. Het netvlies wordt wit.
- Transfer naar een 2 ml buis met een plastic Pasteur pipet die is gesneden om de boring te verbreden.
- Voeg retina in koude methanol gedurende ten minste 20 minuten alvorens immunokleuring. Van de antilichamen hier gebruikt, alleen VE-cadherine niet met succes worden toegepast op methanol vaste netvlies. In dit geval moet netvliezen om rechtdoor gaan tot immunostaining na stap 9.
- Desgewenst kan netvlies worden opgeslagen in methanol bij -20 ° C tot enkele maanden voor kleuring.
3. Immuno / isolectin kleuring van het netvlies Vasculature
- Verwijder voorzichtig / afgieten methanol en zachtjes netvliezen even uitspoelen in PBS (in dit stadium het netvlies is nog steeds in dezelfde ml tube uit stap 11 hierboven 2).
- Verwijder PBS en deksel netvlies met 100 gl Perm / Block oplossing (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% van passende serum (zie tabel 1) en schud voorzichtig gedurende 1 uur.
- Verwijder Perm / blokkeren en incubeer netvliezen onder zacht schudden gedurende de nacht bij 4 ° C met 100 gl gekozen primaire antilichamen (zie tabel 1) en / of IsolectinB4, bereid door verdunning in Perm / Block.
- Verwijder antilichaam / isolectin en wassen netvliezen 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTx).
- In sommige gevallen, bijvoorbeeld na kleuring met IsolectinB4-Alexa488 of direct geconjugeerd primair antilichaam, een secundair antilichaam niet nodig en retina kan direct worden gemonteerd (stap 7). Wanneer een geconjugeerde primaire antilichaam is gebruikt in stap 3, en 100 pl van de geschikte fluorescent secundair antilichaam (1/200 verdund in PBSTx) toegevoegd en gedurende de nacht incuberen bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder secundair antilichaam en was netvliezen 4 x 15 min in 2 ml PBSTx.
- Overdragen netvliezen op dia's met behulp van een breed boring plastic Pasteur pipet en verwijder overtollige PBSTx met een absorberend tissue. Mount netvlies door het toevoegen van 50 pi Verleng afdekmedium op een dekglaasje en zachtjes positie op het netvlies.
- Transfer glijdt naar koelkast overnacht bij 4 ° C, ervoor te zorgen dat ze zijn plat en beschermd tegen licht, zodat het verlengen afdekmedium te stellen.
- Afbeelding retina met een confocale microscoop of een epifluorescentie microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na dissectie het netvlies moet eruit zien als een platte bloem (figuur 1). Door het protocol hierboven beschreven, kunnen endotheelcellen zichtbaar met isolectin B4-Alexa488 kleuring en ondersteuning vasculaire spiercellen gevisualiseerd met anti-gladde spier alfa actine (Figuur 2). De energiebesparende weergave met 5X doelstelling in figuur 2 kan een overzicht van de vasculaire ordening van de retina. Ook, door een andere combinatie van antilichamen die in het bovensta...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier gepresenteerde methode biedt een eenvoudige en efficiënte manier om beelden van gebrandschilderd ganse berg voorbereidingen van neonatale muis netvlies te krijgen, waardoor het een gemakkelijk kwantificeerbare en fysiologisch relevante model van angiogenese. In eerste instantie kan de muis oog heel moeilijk te ontleden vanwege zijn kleine formaat en bol vorm, dus wat oefening en goede dissectie-instrumenten zijn nodig voor betrouwbare resultaten. Dissectie van de ogen bereid 2x concentratie PBS is belangrijk omd...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de Wellcome Trust en de British Heart Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materiaal | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Wetenschappelijke laboratorium benodigdheden | PIP4210 | Verwijder de punt met een schaar om een brede opening te creëren |
| BD Falcon 24-well platen | Wetenschappelijke laboratorium benodigdheden | 353226 | |
| Select Petri schotels TV 90 mm | Wetenschappelijke laboratorium benodigdheden | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Dekglasjes 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont pincet #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Veer schaar 10,5 cm lang, met rechte 8 mm messen | World precision instruments | 501235 | Gebruikt voor enukleatie |
| Vannas schaar 8,5 cm lang, met rechte 7 mm messen, en 0,025 x 0,015 mm superfijne punten | World precision instruments | 500086 | Gebruikt voor het dissekeren van het netvlies |
| Superfijne vannas schaar 8 cm lang met rechte 3 mm messen, en 0,015 x 0,015 mm superfijne punten | World precision instruments | 501778 | Gebruikt voor het dissekeren van het netvlies |
| kristallen klare’ buizen 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagentia | |||
| Natriumfosfaat dibasisch | Sigma | S0876 | PBS reagens |
| Kaliumfosfaat monobasisch | Sigma | P5655 | PBS reagens |
| Natriumchloride | Sigma | S9625 | PBS reagens |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Bereid in 2x PBS en bewaar bij -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Geitenserum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagens | Invitrogen | P36930 | Montage reagens |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Gebruik bij 1:200 verdunning |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Gebruik bij 1:200 verdunning |
| Primaire Antilichamen | |||
| Anti-NG2 (konijn polyklonaal ) | Millipore | AB5320 | Detecteert pericyten |
| Anti-GFAP (clone GA5, muis monoklonaal) | Millipore | MAB360 | Detecteert astrocyten |
| Anti-Desmin (clone Y66, konijn monoklonaal) | Millipore | 04-585 | Detecteert pericyten |
| Anti-Collageen IV (konijn polyklonaal ) | Chemicon | AB756P | Detecteert vasculaire basement membraan |
| Anti-alpha gladde spieractine-Cy3 (clone 1A4, muis monoklonaal) | Sigma | C6198 | Detecteert vasculaire gladde spiercellen. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoklonaal) | BD Pharmingen | 550546 | Detecteert endotheelcellen |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoklonaal) | BD Pharmingen | 553370 | Detecteert endotheelcellen |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoklonaal) | BD Pharmingen | 550548 | Detecteert endotheelcelverbindingen |
| Anti-Alk1 (geiten polyklonaal) | R&D Systems | AF770 | Detecteert endotheelcellen |
| Secundaire Antilichamen | |||
| Geiten anti-konijn-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | Alle secundaire antilichamen worden direct bij aankomst opgedeeld en bewaard bij -20 °C. |
| Geiten anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | Alle secundaire antilichamen worden direct bij aankomst opgedeeld en bewaard bij -20 °C. |
| Geiten anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | Alle secundaire antilichamen worden direct bij aankomst opgedeeld en bewaard bij -20 °C. |
| Geiten anti-muis-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | Alle secundaire antilichamen worden direct bij aankomst opgedeeld en bewaard bij -20 °C. |
| Ezel anti-geit-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | Alle secundaire antilichamen worden direct bij aankomst opgedeeld en bewaard bij -20 °C. |
| Microscopen | |||
| Dissectiemicroscoop | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera voor dissectiemicroscoop |
| Epifluorescente Microscoop | Zeiss | Axioimager met Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera voor Axioimager |
| Confocale Microscoop | Nikon | A1R |
Referenties
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184(2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7 (9), e39336(2012).
- Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).
- Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
