Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Samenvatting

Opklaren is een krachtige tool waarmee beeldvorming verschillende biologische processen in levende dieren. In dit artikel presenteren we een gedetailleerde werkwijze voor het afbeelden van de dynamiek van subcellulaire structuren, zoals de secretoire granules in de speekselklieren van levende muizen.

Samenvatting

Hier beschrijven we een werkwijze voor het subcellulaire structuren in levende knaagdieren die is gebaseerd op het gebruik van confocale intravitale microscopie. Als model orgaan, gebruiken we de speekselklieren van levende muizen aangezien ze verschillende voordelen. Ten eerste kunnen ze gemakkelijk worden blootgesteld toegang tot de optiek mogelijk en gestabiliseerd vermindering van de bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling bevorderen. Dit vergemakkelijkt aanzienlijk beeldvorming en het bijhouden van kleine subcellulaire structuren. Ten tweede, de meeste van de celpopulaties van de speekselklieren zijn vanaf het oppervlak van het orgaan. Hierdoor is het gebruik van confocale microscopie met een hogere ruimtelijke resolutie dan andere technieken die zijn gebruikt voor in vivo beeldvorming, zoals twee-foton microscopie. Tenslotte speekselklieren kan gemakkelijk farmacologisch en genetisch gemanipuleerde, zodat een robuust systeem te onderzoeken biologische processen op moleculair niveau.

In deze studie behandelen we een protocol ontwikkeld om de kinetiek van de exocytose van secretoire korrels in acinaire cellen en de dynamiek van het apicale plasmamembraan waar de secretoire granules smelten bij stimulatie van de beta-adrenerge receptoren volgen. Specifiek, gebruikten we een transgene muis die co-expressie cytosolische GFP en een membraan gerichte gefuseerd met het fluorescerende proteïne tandem-tomaat. Echter, de procedures die we gebruikten te stabiliseren en beeld de speekselklieren worden uitgebreid tot andere muismodellen en gekoppeld aan andere benaderingen van in vivo cellulaire componenten worden, waardoor de visualisatie van verschillende subcellulaire structuren zoals endosomen, lysosomen, mitochondria, en het actine cytoskelet.

Inleiding

In de afgelopen twee decennia de komst van levende microscopie en het gebruik van fluorescente proteïnen geleid tot grote doorbraken op elke denkbare cellulair proces, waardoor onze kennis van celbiologie ^1. Dit veld heeft enorm geprofiteerd van het gebruik van zoogdierlijke celkweken die zeer krachtig modelsystemen, vooral als het gaat om experimentele manipulaties. Echter, ze niet vaak een getrouw beeld geeft van de biologie van complexe meercellige organismen ^2. Dit probleem is begonnen met de ontwikkeling van opklaren (IVM) worden aangepakt dat de deur naar het onderzoeken van de belangrijkste biologische vragen op gebieden als neurobiologie, immunologie en tumorbiologie ³ heeft geopend. Tot dusver meeste studies op basis van IVM uitgevoerd op het niveau van individuele cellen en weefsels, zonder enige informatie over de dynamiek van subcellulaire compartimenten. Onlangs heeft ons laboratorium en anderes hebben IVM technieken kunnen beeldvorming subcellulaire structuren in levende knaagdieren ^{4-7, 13-15} en waardoor farmacologische en genetische manipulaties in vivo ontwikkeld. Deze aanpak is door ons gebruikt om membraan mensenhandel te bestuderen in vivo, en meer specifiek endocytose en gereguleerd exocytose ^6,7.

Onze experimentele model is gebaseerd op het blootstellen stabiliseren en weergave de submandibulaire speekselklier (SG) van verdoofd knaagdieren. De keuze van de SG als model orgaan voor IVM komt door het feit dat de klieren gemakkelijk toegankelijk door het uitvoeren van een kleine ingreep, kan buiten gebracht zonder dat hun fysiologie en gestabiliseerd de bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling verminderen. Bovendien SG selectief worden genetisch gemanipuleerd door injectie of virale of niet-virale gebaseerde vectoren via speeksel kanaal ^8,9. Tot slot, SGS zijn exocriene klieren bestaat uit gepolariseerde epithElial cellen, die de acini en leidingen, myo cellen, en een complexe populatie van stromale cellen vormen. Om deze reden, zijn ze een uitstekend model om exocytose, endocytose, gentherapie, en actine cytoskelet te bestuderen, zoals blijkt uit onze recente studies ^10, en bieden de mogelijkheid om aspecten van celbiologie zoals cel polariteit, celdeling, cel-studie cel contacten, en ionkanalen.

In dit artikel beschrijven we in detail een imaging protocol voor het bereiken van subcellulaire resolutie in het epitheel van de SG's van een live-muis. Specifiek, laten we zien hoe het imago van de secretoire korrels in de acinuscellen van de SG's tijdens gereguleerde exocytose. Zoals eerder aangetoond, na stimulatie met agonisten van beta-adrenerge receptoren, de secretoire granules fuseren met de apicale plasmamembraan en geleidelijk instorten vrijgeven van de inhoud in de acinaire canaliculi ^6. Ons doel is om de fundamentele hulpmiddelen verstrekken aan onderzoekers met minimal ervaring in chirurgische procedures en dierlijke behandeling, zodat ze met succes kunnen IVM presteren op een subcellulaire resolutie. Aangezien de meest uitdagende gedeelte van IVM is de bereiding van het dier, hier richten we ons op de beschrijving van de fundamentele chirurgische procedures die worden gebruikt om bloot te immobiliseren en de SG zonder hun functie te compromitteren. Wat betreft de procedures voor subcellulaire structuren, verschillende strategieën, zoals systemische afgifte van fluorescente probes, het gebruik van transgene dieren, of een combinatie van beide label, ^7,11 elders beschreven.

Protocol

Deel 1: Microscoop en voorbereiding van de Imaging Setup

1. Elke omgekeerde confocale microscoop moet geschikt zijn voor IVM zijn. In deze studie een Olympus IX81 omgekeerde microscoop, uitgerust met een FluoView-1000 laser scanning confocale eenheid gebruikt. Om de best mogelijke oplossing te bereiken, wordt het gebruik van hoge NA doelstellingen, zoals de water-immersie UPLSAPO 60x/1.20 NA, en de olie-immersie Plan-Apo 60x/1.42 NA aanbevolen. Olie-immersie doelstellingen hoger collectie efficiëntie en hoewel zij vereisen het gebruik van een dekglaasje tussen het weefsel en het doel, ze een betere beeldkwaliteit bij gebruik voor beeldgebieden binnen 15-20 urn van het oppervlak. Daarnaast is het gebruik van olie elimineert de zorg voor water verdamping tijdens langere beeldvorming sessies. Om de temperatuur en vochtigheidsgraad te handhaven, moet de microscoop volledig omsloten en warme bevochtigde lucht toegevoerd. Als alternatief, het dier, de microscoop podium, en dedoelstelling moet worden verwarmd door andere middelen. Zo kunnen chemische warmte pads worden gebruikt voor het dier en het podium en specifiek doel verwarmers kunnen worden gebruikt voor de doelstelling (figuur 1A). De doelstelling verwarming moet worden ingeschakeld 30 minuten voor aanvang van de procedure. Opmerking: wanneer de warmte pads zijn te gebruiken om het dier warm te houden een gaasje moet in plaatsen tussen het kussen en de huid. De huid moet worden gecontroleerd op brandwonden.
2. De standaard Stadium meeste van de commercieel beschikbare confocale microscopen hebben een opening dat wordt gebruikt om verschillende houders die worden gebruikt om dia, petrischalen en platen van verschillende grootte past voegen. Om IVM, een standaardtafel tussen te voegen voor 35 mm petrischalen wordt omgekeerd omgekeerd, bedekt met een 40 mm glasplaatje, dat vervolgens wordt beveiligd door hoog vacuüm siliconenvet of tape (Figuur 1A). Een aangepaste insert kan ook worden vervaardigd uit 3 mm dikke aluminium plaat. Het glasoppervlak is dan cleaned met 70% ethanol en veegde met een Kimwipe.
3. Vervaardiging van een op maat gemaakte houder voor de SGS immobilisatie (stabilisator). Het doel van de houder om de SG in plaats vast te koppelen aan de fase en het dekglaasje stabiliseren. De houder kan worden gemaakt van een 60 mm plastic petrischaal. Eerst wordt de bodem van de schaal van de wanden gebroken en gesneden in rechthoeken van ongeveer 15 x 10 mm. Vervolgens worden de randen afgerond en gepolijst met fijn schuurpapier. Vier afstandhouders (1,5-2 mm) zijn gebouwd door het verwijderen van de rubberen uiteinden van 1 ml spuit plunjers. Door het gebruik van fijn schuurpapier, het oppervlak van de afstandhouders en de vier hoeken van het plastic onderdeel worden gepolijst. De afstandhouders worden vervolgens gelijmd met behulp van geleiachtige superlijm, en later glad met een fijn schuurpapier op een vlakke ondergrond. Merk op, dat bij oudere dieren, de grootte van de houders en de afstandhouders kan worden verhoogd iets groter klieren tegemoet.
4. Bereiding van de optische koppeling gel. 0,3% Carbomer-940 (Tabel 2) gel wordt bereid door verwarming tot 100 ml ultrazuiver water en oplossen 5,47 g D-sorbitol. Vervolgens 0,3 g Carbomer-940 toegevoegd. De beker moet worden afgedekt en geplaatst op een roerende hete plaat (laagste verhitten) gedurende enkele uren of tot al het carbomeer klonten volledig is opgelost. Tenslotte Trietanolamine wordt druppelsgewijs toegevoegd terwijl zachtjes roeren tot een pH van ongeveer 7,4 is bereikt. De gel wordt bewaard bij 4 ° C ^13.

Deel 2: Dieren en Anesthesie

1. Voor het uitvoeren van eventuele experimenten met dieren, moet de protocollen worden goedgekeurd door uw lokale dierlijke zorg en ethische commissie. Belangrijkste is dat onderzoekers goed worden opgeleid om chirurgische ingrepen uit te voeren, en moeten met hun lokale dierenverzorgers commissie of instelling dierenarts te raadplegen alvorens verder te gaan met de procedure.
2. In deze studie werd een muismodel (GFP / mTomato muis) verkregen door het kruisen FVB muizen die oplosbaar GFP (GFP-muis) wie C57B6 muizen die een membraan gerichte gefuseerd met het fluorescente eiwit tandem-tomaat (mTomato-muis) ⁶ gebruikt. Opmerking: het meestal 20-30 min voor het dier volledig verdoofd en klaargestoomd voor de beeldvorming geworden
3. Muizen zijn ondergebracht in een gecontroleerde omgeving in het dierenverblijf en mogen acclimatiseren gedurende een week voorafgaand aan het experiment. Deze stap is noodzakelijk om de beeldvorming van de SG aangezien elke nood leidt tot verhoogde afscheidingsactiviteit ^12. Water en voedsel zijn ad libitum. Mannetjes van 2 -5 maanden oud worden gebruikt voor imaging experimenten (20-30 g).
4. Vóór anesthesie, wegen de dieren de juiste dosis anestheticum bepalen.
5. Aangezien de spanning geïnduceerd door toediening van injecteerbare anesthetica de secretoire activiteit van de SG kan aantasten, veroorzaken pre-anesthesie met isofluraan inhalatie, gevolgd door de injectie van anesthesie. Om dit doel, plaatst de muizen zeer voorzichtig in de verdamper kamer, enzet de zuurstoftoevoer (800-900 mmHg). Stel de isofluraan niveaus 3% aan de pre-anesthesie-inductie starten.
6. Zodra de dieren bewusteloos Injecteer een mengsel van 100 mg / kg ketamine en 20 mg / kg xylazine in de peritoneale holte (25 G naald). Anesthetica worden vers bereid door 100 mg / ml xylazine 20 mg / ml in zoutoplossing en vervolgens mengen met de ketamine. Dit mengsel wordt verder verdund 1:1 met zout en een geschikte hoeveelheid geïnjecteerd gebaseerd op het gewicht dier. Deze verdunning helpt bij het voorkomen van een toevallige overdosis. Merk op dat het mengsel zijn effectiviteit verliest na 20 minuten.
7. Observeer de dieren tekenen van waakzaamheid en meer injecteren anesthesiemengsel als ze komen uit narcose (ongeveer 75% van de initiële dosis binnen 45 minuten na de eerste injectie, en 50% elk uur daarna). Controleer de diepte van de anesthesie elke 15 min door te knijpen de poot en het observeren van de respons. Opmerking: toedienen Altijd oogzalf te voorkomendroge ogen.
8. Anesthetica induceren hypothermie, die de reproduceerbaarheid van de experimenten en de gezondheid van het dier kunnen beïnvloeden. Daarom moet muizen onder de warmtelamp of op een verwarmde pad voor de gehele duur van de proef worden gehouden. Let op: de warmte lamp moet minstens 12-18 cm van het dier om aanbranden te voorkomen
9. De lichaamstemperatuur van de dieren moet worden bewaakt met een thermometer met een rectale temperatuursensor.

Deel 3: Animal Chirurgie en positionering voor intravitale Microscopie

1. Bereid de werkruimte met de chirurgische instrumenten (tabel 1) dat schoon en steriel moet zijn.
2. Scheer de nek van de muis met een elektrische tondeuse. Veeg de ventrale zijde van de nek van de verdoofde muis met een gaasje spons gedrenkt in 70% ethanol. Droog de overtollige met een Kimwipe.
3. Met doffe gebogen pincet hef een klein stukje van de huid op de middellijn (ongeveer aan het ondereinde van de kauwspieren), en een kleine incisie (Figuur 1B).
4. Plaats de schaar in de opening en gescheiden van de huid van het onderliggende weefsel door het openen van de schaarbladen. Voorkom schade aan de onderliggende klierweefsel door te wijzen de schaar richting de onderkant van de huid. Herhaal deze stap meerdere keren totdat de huid wordt afgescheiden van de diepere weefsels (Figuur 1B).
5. Met een schaar, knip een strook van losgemaakte huid ongeveer 3 mm breed en 10 mm lang. De huid moet worden gesneden zodat de opening begint bij de basis van de SG waar de zenuw, het kanaal en de bloedvaten sluit de klier naar de rest van het lichaam. Na reiniging van de wond, wordt de resulterende opening ovaal van vorm en meet ongeveer 8 x 12 mm. Beide SG's zullen zichtbaar zijn na de opening (Figuur 1B).
6. Met een spuit van toepassing de optische koppeling gel in het midden van de snede en veeg hem naarde buitenkant met een steriel gaasje. Schoon gaasjes worden gebruikt voor elke doekje om introductie van haar of bloed te voorkomen in het blootgestelde weefsel. Herhaal deze stap tot alle bloed en losse haren wordt verwijderd.
7. Gebruik # 7 pincet, scheid de bindweefsel afgelegen rechts submandibulaire klier tot aan de basis van de klier (alternatief dit protocol kan worden gebruikt links SG). Zoek eerst het topje van de SG en pak het bindweefsel een paar millimeter boven het topje van de klier. Scheur het bindweefsel rond de klier zonder verwonden het parenchym. (Figuur 1B). Zodra de klier wordt blootgesteld voorzichtig los bindweefsel van de klier. Als bloeden optreedt, was het bloed weg met een zoutoplossing. Zorg ervoor dat alle bindweefsels worden gescheiden en de klier is volledig blootgesteld. Houd de klier vochtig door het toepassen van optische koppeling gel regelmatig.
8. Voorafgaand aan het brengen van het dier aan de microscoop, een dikke stukje gaas en de heat pak op de microscoop podium een ​​temperatuur van 38 ± 2 ° C te houden De temperatuur van de chemische verpakking kan worden aangepast door de grootte van de stukken die de binnenzak blootstellen aan de atmosfeer. Gaas biedt een aantal isolatie van de warmte pak van de metalen trap. Bedek de bovenkant van het warmtepakket met een dun stuk gaas ook.
9. Leg het dier op zijn kant (rechterkant voor de juiste klier) en op het gaas. Plaats het dier met de submandibulaire speekselklier in het midden van het dekglaasje (figuur 1C).
10. Het dier moet worden beveiligd en gestabiliseerd in deze positie voor het immobiliseren van de klier. Leg een stuk plakband aan de buikzijde van de rechter poot van de muis. Haak de snijtanden van de muis door een zijden hechtdraad (figuur 1C, inzet). Maak een zekere spanning tussen de zijden draad en de poot en bevestig ze op het podium door plakband. De SG moet natuurlijk worden rusten in het midden van dedekglaasje. Het hoofd en de thorax moet bovendien worden gestabiliseerd door kunststof wiggen die kunnen worden gekoppeld aan het podium.
11. Leg een klein stukje lensreinigingspapier over de klier (figuur 1C). Verleng de klier beetje in en steek een aangepaste houder over de klier. Nauw paar de stabilisator naar het podium met plakband. Koppeling kan worden verbeterd door een metalen klem verbonden met het stadium (figuur 1C). Spanning en scherpe hoeken moeten worden vermeden omdat ze de bloedtoevoer in gevaar kan brengen. Onmiddellijk na de stabilisatie inspecteren de bloedstroom hetzij door onderzoek van de klier visueel (het moet roze kleur behouden) of door epifluorescentie. In het GFP / m-tomaat muis, kan grove veranderingen van de bloedstroom gemakkelijk worden geëvalueerd omdat zowel de bloedvaten en verschillende bloedcellen worden aangeduid met m-tomaat.
12. Bedek het dier met een gaasje en een verwarmd kussen. Meet de temperatuur van de blootgestelde klier met een thermometer voorzieet een kleine flexibele thermokoppel in contact met een zijde van de blootgestelde klier.

Deel 4: Imaging Parameters

1. Met behulp van epifluorescentie verlichting focus op het oppervlak van de klier door ofwel met de GFP of RFP filter set. Vind het oppervlak van de SG, en beoordeelt de bloedstroom in de haarvaten en de algehele morfologie van het weefsel. Tekenen van beschadiging van het weefsel onder membraan blebbing of de verschijning van grote vacuolen.
2. Beoordeel de stabiliteit van het weefsel, hetzij via epifluorescente of door pre-scannen van de geselecteerde gebied. Een stabiel preparaat is essentieel, aangezien de meeste bewegingsartefacten niet kan worden verwijderd of gecorrigeerd in nabewerking gegevensanalyse. Als de voorbereiding niet stabiel is, zijn aanpassingen nodig.
3. Om het beeld een goede focal plane vinden de klieren in de pre-scan mode (1X zoom), en geleidelijk de doelstelling naar het dekglaasje totdat de acinar structuren, de secretoire korrels en de plasma membraan duidelijk zichtbaar (Figuur 2).
4. De beeldparameters voor de time-lapse afhangen van de individuele experiment. Om het beeld van de dynamiek van de secretoire korrels gebruiken een scansnelheid van 0,5-2 sec / frame, en 256 x 256 pixels met een 0,2 micrometer / pixel ruimtelijke schaal (gezichtsveld van ongeveer 50 micrometer x 50 micrometer). Om optimaal te visualiseren de korrels en de plasmamembraan, moet de optische dikte worden ingesteld tussen 0.9-1.2 urn. Om het GFP en tandem-tomaat wekken, kan men een golflengte van 488 nm en 561 nm gebruikt, respectievelijk. Het piekvermogen ligt rond 0,5 mW voor de 488 nm en 1 mW voor de 561 nm. Dit zorgt voor minimale fotobleking.
5. De detector instellingen moeten worden aangepast aan het signaal binnen het dynamische bereik te houden en afhankelijk van de helderheid van het monster.
6. Nadat alle parameters zijn ingesteld, kan beeldvorming worden gestart. Ten eerste, een momentopname van het gezichtsveld worden gebruikt als referentiepunt. Terwijlbeeldvorming in time lapse, kan afdrijven van het weefsel in XY en Z optreden. Dit kan handmatig worden gecompenseerd door aanpassing van het scangebied en de Z-positie. De aanpassingen moeten geleidelijk en in kleine stappen om artefacten te vermijden worden gemaakt. Bovendien kan het referentiebeeld worden gebruikt om te bepalen of fotobleken optreedt. Indien significante photobleaching wordt gedetecteerd (meer dan 15-20% vermindering van fluorescentie), vermindering van de laservermogen met 0,1 mW.
7. Om exocytose stimuleren injecteren subcutaan 0,1 mg / kg van een versbereide oplossing van isoproterenol in zoutoplossing. Exocytose wordt geactiveerd ongeveer 1 minuut na de injectie. Secretiegranula fuseren met de plasmamembraan wordt gedetecteerd door een toename van GFP-fluorescentie in de korrels en de verspreiding van de tandem-tomaat peptiden in hun beperkende membranen (Figuur 3). Wij raden het verwerven 3-4 time-lapse sequenties in hetzelfde gebied, 10 min elk.
8. Na de opnamesessie, euthanaseren de anesthetized dier door CO ₂ inhalatie in een euthanasie kamer (10-12 mmHg gedurende 10 min).

Resultaten

In het GFP / mTomato muis, de acini verschijnen als duidelijk verschillende structuren, die cytosolische GFP en-membraan gerichte tandem-Tomaat peptide (figuur 2, onderbroken lijn) te uiten. In individuele acini worden acinuscellen afgebakend door de tandem-Tomaat peptide. GFP wordt ook gedetecteerd in de kernen die duidelijk zichtbaar in de acinaire cellen (Figuur 2, pijlen) zijn. Cytosole GFP is uitgesloten van de secretoire granules die zo donker ronde blaasjes van ongeveer 1-1,5 mic...

Discussie

Tot dusver subcellulaire structuren zijn afgebeeld meestal in in vitro (dwz celculturen) of ex vivo (dwz orgel-culturen, weefsel plakjes, acinar preparaten) modelsystemen die vaak niet recapituleren de kenmerken van intacte levende weefsels ^6. In dit opzicht is de hier gepresenteerde benadering een belangrijke doorbraak omdat zo beeldvorming van de dynamiek van een specifieke membraantransport stap (gereglementeerde exocytose) in levende muizen.

Dit prot...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens
Isoflouraan (Forane)	Baxter	101936-40	Verwerk onder chemische afzuigkap
Ketamine (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Voorraad oplossing 100 mg/ml
Xylazine (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Voorraad oplossing 100 mg/ml
Neomycin/Polymyxin B	Bausch and Lomb	24208-785-55	Gebruik om het oog van de muis te smeren
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Voeg druppelsgewijs toe om te voorkomen dat de oplossing stolt
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	Bereid verse oplossingen in zoutoplossing wanneer nodig. Voorraden kunnen worden bewaard bij -20 °C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (Verdamper)	Braintree Scientific	190AF
Draagbare Downdraft tafel uitgerust met HEPA-filter	Hazard Technology	PDDT
Warmtelamp, Model HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T Thermometer	Braintree Scientific	TW2
Operatie schaar (11,5 cm recht)	World Precision Instruments	5003708-12
#7 gekromde punt pincet	World Precision Instruments	14187
Microschaar	World Precision Instruments	503365
Zwarte gevlochten zijden hechtdraad #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
Gaasjesponsjes 2" x 2"	Tyco Healthcare	9022
Lens schoonmaakdoekjes	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476